CN103571853B - 密码子优化的Cry2Aa基因与重组载体以及改变作物抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种Cry2Aa#基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，该Cry2Aa#基因具有SEQ？ID？No：1所示的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽。另一方面，本发明还提供了一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有如上所述的Cry2Aa#基因，并能使所插入的Cry2Aa#基因得到表达。另一方面，本发明还提供了一种改变作物抗性的方法，其特征在于，该方法包括将如上所述的重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在所述作物中表达。通过上述技术方案，杀虫蛋白的表达量显著提高，能够为水稻提供对稻纵卷叶螟等水稻害虫的高抗性。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种密码子优化的Cry2Aa基因、一种重组载体和一种改变作物抗性的方法。
背景技术
苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）是自然界中普遍存在的一类细菌，Bt菌及Bt毒蛋白作为生物杀虫剂，在农业上有70多年的安全使用的历史。1981年，Schnepft和Whiteley首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫蛋白基因，迄今为止，已先后分离并克隆了600多个杀虫蛋白基因，如：CrylA，Cry2A，Cry1F等(Chickmore,2011)。自1987年以来，Bt基因或改造后的Bt基因已被成功地导入烟草、玉米、棉花和水稻等多种植物，获得了一大批具有良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源，产生了显著的社会效益和经济效益。目前Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具有应用前景的抗虫基因。
虽然先后获得了转基因烟草(Vaecketal,1987;Adangetal,1987;Bartonetal,1987)、番茄(Fischhoffetal,1987)、棉花(Perlaketal,1990)，但是杀虫蛋白（InsecticidalCrystalProtein,ICP）在植物中表达水平普遍低，抗虫效果也差。如美国Agra-cetus公司的Barton等（1985）和Agrigenefic公司的Adang（1985）分别将3’端缺失的CrylAa和CrylAc转入烟草得到了抗虫转基因植株。但上述转基因植物的抗虫性都很弱，难以检测出mRNA的转录，杀虫蛋白的表达量很低，以重量计，仅占可溶性蛋白的0.001%。
发明内容
本发明的目的是提供克服杀虫蛋白在植物中表达水平普遍低、抗虫效果也差的缺陷，提供一种在植物中表达水平高、抗虫效果好的杀虫蛋白。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种Cry2Aa#基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该Cry2Aa#基因具有SEQIDNo：1所示的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
另一方面，本发明还提供了一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有如上所述的Cry2Aa#基因，并能使所插入的Cry2Aa#基因得到表达。
另一方面，本发明还提供了一种改变作物抗性的方法，其特征在于，该方法包括将如上所述的重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在在所述作物中表达。
通过上述技术方案，杀虫蛋白的表达量能够达到18.88μg/g叶片鲜重，可以为水稻提供对稻纵卷叶螟等水稻害虫的高抗性。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：植物表达载体p3300-Cry2Aa#的构建流程；
图2：a.转基因水稻中Cry2Aa#基因PCR扩增产物的凝胶电泳图。
b.转基因水稻中Bar基因PCR扩增产物的凝胶电泳图；
图3：转基因植株B2A4008S的Southern杂交印迹图；
图4：转基因植株B2A4008S中的Cry2Aa#基因的RT-PCR检测结果；
图5：转基因B2A4008S的叶片中Cry2Aa蛋白浓度的检测结果；
图6：转基因植株B2A4008S对稻纵卷叶螟抗性的生物测定结果；
图7：转基因植株B2A4008S（T1代）的草铵膦抗性检测结果。
图8：T2代转基因植株B2A4008S的草铵膦抗性检测结果。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种Cry2Aa#基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该Cry2Aa#基因具有SEQIDNo：1所示的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽。
本发明的密码子优化的Cry2Aa基因，其命名为Cry2Aa#基因，相比原始Cry2Aa基因，进行了密码子优化，基本替换掉了存在的水稻稀有密码子，以使其密码子相对使用度与水稻保持一致，同时也大大降低了密码子ACG、TCG、GCG、CCG所占的比例，减少了可能发生甲基化的位点。密码子优化的Cry2Aa基因（即本发明的Cry2Aa#基因）与原始Cry2Aa基因的比较如表1所示，与原始Cry2Aa基因的DNA序列相比，其氨基酸组成不变，改变碱基492个，占碱基总数的25.91%，更改密码子428个，占整个密码子的67.61%；G+C含量由原始序列的34.81%改变为57.47%；并且消除了潜在的Poly（A）加尾信号位点、内含子剪切信号位点。而原始序列中存在9个潜在的Poly(A)加尾信号位点及4个内含子剪切信号位点，他们可能会造成转录本的不正常剪切，从而导致成熟mRNA的不完整性。
根据本发明的Cry2Aa#基因，其中，该Cry2Aa#基因的5’端还含有SEQIDNo：3所示的序列，且该Cry2Aa#基因的3’端还含有SEQIDNo：4所示的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码N端具有PR1a信号肽序列、C端具有KDEL内质网滞留信号序列并对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽。
优选情况下，本发明的Cry2Aa#基因具有如SEQIDNo：2所示的序列，SEQIDNo：2所示的序列是在以上密码子优化的Cry2Aa#基因序列（SEQIDNo：1）的5’端添加如SEQIDNo：3所示的序列，3’端添加如SEQIDNo：4所示的序列得到的。SEQIDNo：3为PR1a信号肽序列，SEQIDNo：4为内质网滞留信号KDEL序列。SEQIDNo：2所示的序列中的信号肽和定位信号肽可以使表达后的Cry2Aa蛋白（SEQIDNo：5）靶向性的运输到细胞的内质网等质体内并积累。
根据本发明的Cry2Aa#基因，其中，该Cry2Aa#基因的3’端还具有转录终止子序列，所述转录终止子序列包括SEQIDNo：10所示的序列并能够终止转录。
根据本发明的Cry2Aa#基因，其中，该Cry2Aa#基因的5’端还具有启动子序列和增强子序列；所述启动子序列包括SEQIDNo：8所示的序列，且能够启动Cry2Aa#基因的转录；所述增强子序列包括SEQIDNo：9所示的序列，且能够增强Cry2Aa#基因的转录。
优选情况下，在上述组合序列（SEQIDNo：2）的5’端分别添加Kozak特征序列及限制性内切酶SmaI识别位点序列（cccggg）、3’端添加SacI识别位点序列（gagctc），最终形成如SEQIDNo：6所示的DNA序列。SEQIDNo：6所示的DNA序列的5’端添加启动子和表达增强子、3’端添加终止子，从而构建基因表达框。优选地，该植物表达框如SEQIDNo：7所示DNA序列，它5’端具有如SEQIDNo：8（即Ubi启动子）和SEQIDNo：9（即Ω增强子序列）所示的序列作为表达Cry2Aa#基因的启动子和增强子，3’端具有如SEQIDNo：10所示的序列作为表达Cry2Aa#基因的转录终止子。
根据本发明的Cry2Aa#基因，其中，该Cry2Aa#基因具有SEQIDNo：2所示的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽；优选地，该Cry2Aa#基因具有SEQIDNo：6所示的序列，且该Cry2Aa#基因能够编码对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽。
本发明还提供了一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有如上所述的Cry2Aa#基因，该重组载体能使所插入的Cry2Aa#基因得到表达。
本发明中，所述重组载体由上述基因序列和载体组成，所述载体可以为T载体、原核表达载体和真核表达载体中的至少一种，其中，T载体和原核表达载体的主要作用是初步验证功能基因和目标蛋白的功能，而真核表达载体的作用是为了后续将其转化进作物中，因此，能够满足上述应用的各种T载体（pMD18-T、pMD19-T等）、原核表达载体（pET32a等）和真核表达载体（pCAMBIA3300、pCAMBIA3301等）均可用于本发明。
根据本发明的重组载体，其中，该重组载体还插入有Bar基因，并且能使Bar基因得到表达；所述Bar基因具有SEQIDNo：12所示的序列且所述Bar基因能够编码具有抗草铵膦活性的多肽。优选地，所述重组载体由上述Cry2Aa#基因序列和真核表达载体（pCAMBIA3300、pCAMBIA3301等）组成。
根据本发明的重组载体，其中，所述Bar基因的5’端还具有启动子序列，所述Bar基因的3’端还具有终止子序列；所述启动子序列包括SEQIDNo：11所示的序列，且能够启动Bar基因的转录；所述终止子序列包括SEQIDNo：13所示的序列，且能够终止Bar基因的转录。优选地，筛选标记基因的表达框依次由CaMV35S启动子（SEQIDNo：11）、筛选标记基因Bar基因（SEQIDNo：12）以及CaMV35SpolyA终止子（SEQIDNo：13）组成。
本发明还提供了一种改变作物抗性的方法，其特征在于，该方法包括将如上所述的重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在所述作物中表达。
根据本发明，术语“作物”为本领域公知的概念，指大面积栽种或大面积收获，供盈利或口粮用的植物。本发明的基因不仅可用于转入水稻，也可以用于转入玉米、高粱、小麦、棉花、油菜、大豆、土豆、蔬菜等。优选地，所述作物为水稻，所述水稻包括各种水稻，如各亚种（籼稻、粳稻、爪哇稻）、各生态型（早稻、中稻、晚稻）水稻等。为了将该基因应用于两系法杂交水稻的育种，本发明中，所述水稻为光温敏核不育系水稻，具体地，可为光温敏核不育系水稻7001S、农垦58S、P88S、4008S、Y58S、培矮64S、N5088S、香125S、测64S、广占63S、GD-2S等。优选地，本发明中选光温敏核不育系水稻4008S作为转化的受体作物。
实现转基因的方法有本领域公知的农杆菌介导转化法、基因枪法和花粉管通道法等。优选地，本发明所用的转化方法为农杆菌介导转化法。所述农杆菌介导转化法可以为传统的常规法，如（YukohHiei，etal.TransformationofricemediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantMolecularBiology，1997,35,205-218）中报道的方法，也可采用（SeiichiToki,etal.EarlyinfectionofscutellumtissuewithAgrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.ThePlantJournal,2006,47,969-976.）中报道的快速转化方法。本发明的发明人对现有技术的快速农杆菌转化法进行了改进，具体地，SeiichiToki等人进行农杆菌转化时，愈伤组织诱导后不进行继代而直接浸染，而本发明的发明人发现，根据所用的愈伤组织的状态，诱导产生的愈伤组织继代第3天达到最佳状态时再进行浸染能够得到更高的侵染效率。即，优选地，所述农杆菌转化法包括，用上述的重组载体的农杆菌菌液与作物的愈伤组织共培养，并对共培养后的愈伤组织进行筛选、预分化和分化，其中，所述愈伤组织为诱导后继代的愈伤组织。
此外，本发明的发明人发现，农杆菌转化法中，在共培养和预分化愈伤组织时，所用固体培养基中的琼脂粉含量为10-15g/L，优选为12g/L能够使愈伤组织的状态良好，分化效率提高。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
其中，DNA序列SEQIDNo：6委托大连宝生物公司合成并连接在pMD19T载体上；各种PCR引物的合成和基因测序工作委托华大基因公司进行；各种酶均购自大连宝生物公司；pMD19T载体购自大连宝生物公司；pCAMIA3300载体提供自澳大利亚农业分子生物学应用中心（CAMBIA，http://www.cambia.org）；质粒的提取、纯化和酶切以及其他常规分子生物学操作参考《分子克隆》（科学出版社，第三版）进行。
实施例1
本实施例用于说明本发明的Cry2Aa#基因的密码子优化方法
Cry2Aa原始基因序列来自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其查询号为AY496458。选择水稻品种日本晴基因组数据库作为分析对象，网址为http://rgp.dna.affrc.go.jp/giot/INE.html。首先筛选蛋白表达量较高、功能注释详细的基因的编码序列作为分析对象，运用CodonW（http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=codonw）及SeqnConverter（http://www.cibj.com/seqnconverter.zip）分析软件，对筛选得到的101条完整的蛋白编码序列进行密码子使用频率分析，结果见表1。
在保持Cry2Aa蛋白氨基酸顺序不变的前提下，把其中RSCU值（即同义密码子相对使用度，指某一密码子所使用的频率与其在无偏性使用时预期频率之间的比值）小于0.5的密码子替换成水稻偏爱的密码子，即在同义密码子组中RSCU值最大的水稻密码子；RSCU值在0.5-1之间的密码子只是部分替换成水稻偏爱的密码子；而RSCU值在1以上的密码子不作改变。同义密码子替换过程中，降低密码子ACG、TCG、GCG、CCG所占的比例，以减少可能发生甲基化的位点。
Cry2Aa基因经过水稻偏爱密码子替换后，已不存在造成植物转录不稳定的AT富集区及PolyA加尾识别信号序列。但仍然存在4处内含子切割识别信号位点，继续通过同义密码子替换法消除内含子切割识别信号位点。
表1人工优化合成的Cry2Aa基因、原始的Cry2Aa基因与水稻编码蛋白基因的密码子相对使用度（RSCU）比较
注:同义密码子相对使用度（RSCU）表示某一密码子所使用的频率与其在无偏性使用时预期频率之比值，括号内数据表示某一密码子在统计中所出现的频次
Mfold软件（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）中具有基于最小自由能模型预测mRNA二级结构的功能。输入以上密码子优化后的序列，根据输出的mRNA二级结构图，利用同义密码子替换法消除二级结构中可能形成的稳定发夹环等二级结构9个，获得SEQIDNo：1所示的DNA序列。
上述密码子优化后的Cry2Aa#基因（SEQIDNo：1）密码子的相对使用度(RSCU)如表1中所示，优化后获得的Cry2Aa#基因序列长度为1899bp，与原始Cry2Aa基因的DNA序列相比，其氨基酸组成与顺序不变，改变碱基492个，占碱基总数的25.91%，更改密码子428个，占整个密码子的67.61%，G+C含量由原始序列的34.81%改变为57.47%。其次，水稻偏爱密码子的分布频率提高了，容易出现DNA序列甲基化的密码子GCG、ACG、CCG和TCG的分布频率降低了。并且以上优化后的Cry2Aa基因已经不存在潜在的Poly（A）加尾信号位点和内含子剪切信号位点。
实施例2
本实施例用于说明本发明的Cry2Aa#基因的构建方法
在实施例1中密码子优化的Cry2Aa#基因序列的5’端添加有利于多肽转运的信号肽DNA序列，即SEQIDNo：3所示的序列（烟草病程相关蛋白PR1a基因的信号肽序列）。在以上优化的Cry2Aa#基因序列的3’端添加有利于多肽在亚细胞器内定位和积累的信号肽DNA序列，即，在以上优化的Cry2Aa#基因序列的3’端添加KDEL内质网滞留信号肽KDEL的DNA序列（如SEQIDNo：4所示）。组合而成新融合的Cry2Aa#基因（SEQIDNo：2）编码的融合蛋白Cry2Aa#（SEQIDNo：5）能快捷转运定位并滞留在内质网等细胞器中，以增加其表达积累量。
实施例3
本实施例用于说明本发明的Cry2Aa#基因的构建方法
在实施例2中优化的Cry2Aa#基因序列的5’端添加acc序列，组成Kozak特征序列accatgg。并且，在上述组合序列的5’端添加限制性内切酶SmaI识别位点序列（cccggg）、3’端添加SacI识别位点序列（gagctc），最终确定如SEQIDNo：6所示的DNA序列。该序列为全新序列，委托大连宝生物公司合成并连接在pMD19T载体上，得到带有Cry2Aa#基因的pMD19T载体。
实施例4
本实施例用于说明植物表达载体pC3300-Cry2Aa#的构建。
将实施例3得到的带有Cry2Aa#基因的pMD19T载体与pC3300-Ubi-Ω-OsbHLH1载体（该载体已包含Ubi启动子和Ω增强子序列，载体来源参考：罗伯祥等，OsbHLHl基因过表达载体构建及转化水稻研究.生物技术通报，2009(7):76-81.）双酶切（上游酶切位点为SmaI，下游酶切位点为SacI）、回收、再连接，将SEQIDNo：6所示的序列替换掉OsbHLHl基因得到pC3300-Cry2Aa#重组载体，载体构建流程图如图1所示。将该重组载体转化进大肠杆菌DH5α菌株，通过卡那霉素抗性培养基筛选，挑取单菌落培养，提取质粒，进行PCR和相应的酶切鉴定阳性克隆（上游引物如SEQIDNo：14所示，下游引物如SEQIDNo：15所示；PCR扩增产物大小为496bp；反应程序为：95℃5min,94℃1min,58℃45s,72℃45s,35个循环后72℃延伸10min）。PCR和酶切鉴定结果证明pC3300-Cry2Aa#重组载体构建成功。
实施例5
本实施例用于说明检测优化基因Cry2Aa#在B2A4008S中的整合与蛋白表达
1）转基因植株的PCR检测
首先，通过SDS法提取植株总DNA，方法参考《植物基因工程》（科学出版社，第二版）。
然后，通过PCR分析：(1)试验材料：转基因植株B2A4008S-1至B2A4008S-8；阴性对照4008S；阳性对照质粒DNA。(2)PCR检测Cry2Aa#基因的上游引物PCry2Aa-1序列见SEQIDNo：14，下游引物PCry2Aa-2序列见SEQIDNo：15；检测Bar基因的上游引物PBar-1序列见SEQIDNo：16，下游引物PBar-2序列见SEQIDNo：17；（3）反应程序为：95℃5min,94℃1min,58℃45s,72℃45s,35个循环后72℃延伸10min。
对Cry2Aa#基因的检测结果如图2a所示。其中，泳道M为1kbplusDNAMarker，目标条带如箭头所示为496bp，泳道+为阳性对照，泳道-为非转基因植株的阴性对照，泳道1-8为B2A4008S-1至B2A4008S-8的8个转基因株系的检测结果，从图2a可以看出，泳道1-8都观察到了目标条带，说明B2A4008S-1至B2A4008S-8转基因株系都成功转入了Cry2Aa#基因。
对Bar基因的检测结果如图2b所示。目标条带如箭头所示为486bp，检测结果说明B2A4008S-1至B2A4008S-8号的转基因株系也都成功转入了Bar基因。
2）转基因植株的Southern检测
选取以上室外抗虫效果显著的转基因株系做Southern杂交检测。通过SDS法提取植株总DNA，方法参考《植物基因工程》（科学出版社，第二版）。水稻总DNA约30μg，选取HindIII酶切过夜，用1.0%琼脂糖凝胶分离，利用盐桥法转移到带正电荷的尼龙膜上。Cry2Aa#基因探针用Cry2Aa#基因酶切产物为模板，扩增引物与Cry2Aa#基因的检测引物相同（上游引物如SEQIDNo：14所示，下游引物如SEQIDNo：15所示），用地高辛标记试剂盒(LabKit,China)标记Southern杂交探针。采用地高辛标记核酸检测试剂盒DIGD-110(LabKit,China)进行Southern杂交和化学发光检测。
对Cry2Aa#基因的Southern检测结果如图3所示。其中，泳道+为阳性质粒对照，泳道CK为非转基因植株的阴性对照，泳道1-6为B2A4008S-1至B2A4008S-6的6个转基因株系的检测结果。如图3所示，B2A4008S-1至B2A4008S-6的6个转基因株系都有特异性条带产生，说明外源基因Cry2Aa#已整合到B2A4008S转基因株系的基因组中。
3）转基因植株的RNA水平检测
利用Trizol法提取水稻叶片总RNA，采用Fermentas逆转录试剂盒合成cDNA，详细方法参照Fermentas逆转录试剂盒说明书进行。根据优化Cry2Aa#基因的cDNA序列，设计RT-PCR引物（上游引物如SEQIDNo：18所示，下游引物如SEQIDNo：19所示）；反应程序为：95℃5min,94℃30s,57℃30s,72℃40s,35个循环后72℃延伸10min。
对Cry2Aa#基因的RT-PCR检测结果如图4所示，目标条带如箭头所示的为153bp。其中，泳道M为DNAMarkerⅠ，泳道B为空白对照，泳道-为非转基因植株的阴性对照，泳道1-5为B2A4008S-1至B2A4008S-5的5个转基因株系的检测结果。从图4可以看出，泳道1-5都观察到了目标条带，说明B2A4008S-1至B2A4008S-5转基因株系都可以转录出Cry2Aa#基因的mRNA。
4）转基因植株的Cry2Aa蛋白的定量检测
取T1代转基因植株20mg新鲜叶片，加入蛋白提取缓冲液研磨成浆，采用Envirologix蛋白定量试剂盒APP005（Envirologix,USA）测定Cry2Aa蛋白含量。Cry2Aa蛋白的定量操作步骤参照试剂盒EnvirologixkitsAPP005说明书，各株系的蛋白定量检测结果如表2和图5所示。转基因株系之间蛋白表达差异比较明显，以2号株系表达量最高，达到18.88μg/g叶片鲜重。
通过农杆菌介导法，共获得了65个转基因单株。对其进行PCR和Southern检测，发现所获得的65个转基因单株都是阳性的。RT-PCR和ELISA试验表明Cry2Aa#基因可以成功地转录并翻译出Cry2Aa蛋白，Cry2Aa蛋白表达量达到7.25~18.88μg/g叶片鲜重。
表2转基因植株B2A4008S的Cry2Aa蛋白的定量检测结果
| 株系 | Cry2Aa蛋白叶片含量（μg/g叶片鲜重） | 标准误 |
| 1 | 8.62 | 0.48 |
| 2 | 18.88 | 0.53 |
| 3 | 16.44 | 0.52 |
| 4 | 16.64 | 0.31 |
| 5 | 7.25 | 0.25 |
| 6 | 10.22 | 0.45 |
实施例6
本实施例用于说明转基因植株抗虫能力检测。
在T1代转基因B2A4008S植株及对照水稻抽穗期时，从稻株中随机剪取生长期大致相同的叶片，每4片叶片用湿润滤纸包好放入玻璃管中。每管接入12头1龄稻纵卷叶螟幼虫，管口用棉塞包裹后，两端用黑布遮盖避光，然后将接好虫的玻璃管放入培养箱中（温度28℃，光照14h/d，相对湿度85%）。实验设计了三组，每组有三个重复，三个组分别定在48h（2天）、96h（4天）及120h（5天）后观察幼虫的存活情况。
饲喂两天组饲喂两天后，观察发现非转基因植株叶片损伤较严重，幼虫平均死亡率为5.55%，存活的幼虫发育正常，基本上达到二龄阶段。喂食转基因B2A4008S植株中幼虫的平均死亡率为61.11%，存活的幼虫发育迟缓，均处于一龄阶段。
饲喂四天组饲喂4天后，观察发现非转基因植株叶片损伤严重，幼虫平均死亡率2.78%，存活的幼虫发育正常，都达到二龄或二龄以上。转基因B2A4008S植株中幼虫的平均死亡率为83.33%，存活的幼虫极小且发育迟缓，基本上均处于一龄阶段。
饲喂五天组饲喂5天后，观察发现非转基因植株叶片损伤很严重，并伴有大量虫粪，稻纵卷叶螟幼虫平均死亡率2.78%，发育正常，都达到二龄以上。喂食转基因植株B2A4008S的幼虫100%死亡。结果可见图6和表3。
表3转基因植株B2A4008S室内稻纵卷叶螟幼虫生物测定结果
实施例7
本实施例用于说明转基因植株的草铵膦抗性检测。
用750mg/L的草铵膦涂抹非转基因植株4008S和T1代转基因植株B2A4008S各株系，7天后观察植株生长情况。结果如图7所示，其中，CK为非转基因植株4008S，1-8为转基因株系B2A4008S-1～B2A4008S-8，非转基因植株4008S叶片已经枯死，而转基因的植株叶片正常。所得T2代转基因植株幼苗期喷洒剂量为0.375g/M2的草铵膦，7天后检测转基因水稻植株抗草铵膦的能力。结果如图8所示，其中CK为非转基因植株4008S，B2A4008S为T2代转基因植株B2A4008S，T2代转基因水稻植株在喷洒除草剂草铵膦后仍能正常生长，而非转基因水稻则因不具有除草剂抗性而死亡。说明本发明的方法获得的转基因水稻具有极好的抗草铵膦的性能。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (14)
1.一种Cry2Aa # 基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该Cry2Aa # 基因的序列为SEQIDNo：1所示的序列，且该Cry2Aa # 基因能够编码对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
2.一种Cry2Aa # 基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该Cry2Aa # 基因的序列为：SEQIDNo：1所示序列的5’端连接有信号肽序列，其中所述信号肽序列为SEQIDNo：3所示的序列，且该Cry2Aa # 基因的3’端连接有内质网滞留信号序列，其中所述内质网滞留信号序列为SEQIDNo：4所示的序列，且该Cry2Aa # 基因能够编码N端具有PR1a信号肽序列、C端具有KDEL内质网滞留信号序列并对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
3.根据权利要求2所述的Cry2Aa # 基因，其中，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNo：5所示。
4.一种Cry2Aa # 基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该Cry2Aa # 基因的序列为：SEQIDNo：1所示序列的5’端连接有信号肽序列，其中所述信号肽序列为SEQIDNo：3所示的序列，且该Cry2Aa # 基因的3’端连接有内质网滞留信号序列、转录终止子序列，其中所述内质网滞留信号序列为SEQIDNo：4所示的序列，所述转录终止子序列为SEQIDNo：10所示的序列并能够终止Cry2Aa # 基因的转录，且该Cry2Aa # 基因能够编码N端具有PR1a信号肽序列、C端具有KDEL内质网滞留信号序列并对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
5.一种Cry2Aa # 基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该Cry2Aa # 基因的序列为：SEQIDNo：1所示序列的5’端还具有启动子序列和增强子序列，所述启动子序列为SEQIDNo：8所示的序列，且能够启动Cry2Aa # 基因的转录；所述增强子序列为SEQIDNo：9所示的序列，且能够增强Cry2Aa # 基因的转录。
6.一种Cry2Aa # 基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该Cry2Aa # 基因的序列为：SEQIDNo：1所示序列的5’端连接有信号肽序列、启动子序列和增强子序列，其中所述信号肽序列为SEQIDNo：3所示的序列，所述启动子序列为SEQIDNo：8所示的序列，且能够启动Cry2Aa # 基因的转录，所述增强子序列为SEQIDNo：9所示的序列，且能够增强Cry2Aa # 基因的转录，且该Cry2Aa # 基因的3’端连接有内质网滞留信号序列，其中所述内质网滞留信号序列为SEQIDNo：4所示的序列，且该Cry2Aa # 基因能够编码N端具有PR1a信号肽序列、C端具有KDEL内质网滞留信号序列并对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
7.一种Cry2Aa # 基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该Cry2Aa # 基因的序列为：SEQIDNo：1所示序列的5’端连接有信号肽序列、启动子序列和增强子序列，其中所述信号肽序列为SEQIDNo：3所示的序列，所述启动子序列为SEQIDNo：8所示的序列，且能够启动Cry2Aa # 基因的转录；所述增强子序列为SEQIDNo：9所示的序列，且能够增强Cry2Aa # 基因的转录，且该Cry2Aa # 基因的3’端连接有内质网滞留信号序列、转录终止子序列，其中所述内质网滞留信号序列为SEQIDNo：4所示的序列，所述转录终止子序列为SEQIDNo：10所示的序列并能够终止Cry2Aa # 基因的转录，且该Cry2Aa # 基因能够编码N端具有PR1a信号肽序列、C端具有KDEL内质网滞留信号序列并对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
8.一种Cry2Aa # 基因，其为密码子优化的Cry2Aa基因，其特征在于，该Cry2Aa # 基因的序列为SEQIDNo：6所示的序列，且该Cry2Aa # 基因能够编码对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
9.一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有权利要求1-8中任意一项所述的Cry2Aa # 基因，该重组载体能使所插入的Cry2Aa # 基因得到表达。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其中，该重组载体还插入有Bar基因，并且能使Bar基因得到表达；所述Bar基因的序列为SEQIDNo：12所示的序列且所述Bar基因能够编码具有抗草铵膦活性的多肽。
11.根据权利要求10所述的重组载体，其中，所述Bar基因的5’端还具有启动子序列，所述Bar基因的3’端还具有终止子序列；所述启动子序列为SEQIDNo：11所示的序列，且能够启动Bar基因的转录；所述终止子序列为SEQIDNo：13所示的序列，且能够终止Bar基因的转录。
12.一种改变作物抗虫、抗草铵膦的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求9-11中任意一项所述的重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在所述作物中表达。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述作物为水稻。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述作物为水稻光温敏核不育系4008S。
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