CN104292314B - 密码子优化的Cry1Ca#基因与重组载体以及改变作物抗性的方法 - Google Patents

密码子优化的Cry1Ca#基因与重组载体以及改变作物抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人工优化设计的Cry1Ca#基因，其中，该Cry1Ca#基因具有SEQ ID No.1所示的序列，且该Cry1Ca#基因能够编码对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体插入有如上所述的Cry1Ca#基因，并能使所插入的Cry1Ca#基因得到表达。再一方面，本发明还提供了一种改变作物抗性的方法，其中，该方法包括将上述重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在所述作物中表达。通过上述技术方案，杀虫蛋白的表达量显著提高，能够为水稻提供对稻纵卷叶螟等水稻害虫的高抗性。

Description

密码子优化的Cry1Ca#基因与重组载体以及改变作物抗性的 方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种密码子人工优化设计的Cry1Ca#基因、一种重组载体和一种改变作物抗性的方法。
背景技术
来自于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的Bt基因编码的杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫具有特异性的杀虫活性。Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最有效的抗虫基因。1981年，Schnepft和Whiteley首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫蛋白基因Cry1Aa，迄今为止，已先后分离并克隆了600多个杀虫蛋白基因。研究较为深入的是Cry1类基因，它编码130kD的杀虫晶体蛋白，主要对鳞翅目昆虫有毒，其中Cry1C类基因编码的134kD的晶体蛋白对鳞翅目和双翅目均有毒性。
来自于细菌的原始Bt基因中存在很多在真核生物中导致表达不稳定的元件，如类似植物的poly(A)信号序列、内含子切割信号位点、富含AT的序列等，可导致基因编码的mRNA不稳定；与植物基因相比，细菌的原始Bt基因G/C含量和密码子的使用频率都有很大差异，不适合在植物中高效表达。虽然通过将原始Bt基因转化植物获得了转基因烟草（Vaceket al.,Transgenic plants protected from insect attack.Nature,1987,328:33-37；Adang et al.,Application of a Bacillus thuringiensis crystal protein forinsect control.In:Amtzen C J,Ryan C,eds.,Molecular strategies for cropprotection.New York,USA,1987,pp.345-353；Barton et al.,Bacillus thuringiensisδ-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance tolepidopteran insects.Plant Physiology,1987,85:1103-1109）、番茄（Fischhoff etal.,Insect tolerant transgenic tomato plants.Biotechnology,1987,5:807-813）、棉花（Perlak et al.,Insect resistance cotton plants.Biotechnology,1990,8:939-943）等转基因植物，但Bt杀虫蛋白（Insecticidal Crystal Protein,ICP）在植物中的表达水平普遍偏低，抗虫效果也较差，毒蛋白的含量只占可溶性蛋白的0.001％或低至无法检测的水平，难以满足生产应用的要求。1990年以后对Bt基因的改造研究逐步深入，修饰改造的CrylA(b)和CrylA(c)在转基因棉花（Gossypium hirsutum L.）中的表达水平大大提高，杀虫蛋白含量为植株可溶性总蛋白的0.05-0.1%，达到了抗虫目的，从而使转Bt基因作物在农业生产上的应用成为可能。人工改造合成的CrylC在转基因紫花苜蓿（Medicago sativaL.）和烟草中表达的杀虫蛋白含量为可溶性总蛋白的0.01-0.2%，并对灰翅夜蛾（Spodoptera littoralis）和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）表现出较高水平的抗性（Strizhov et al.,A synthetic cryIC gene,encoding a Bacillus thuringiensisδ-endotoxin,confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco.Proceedings ofthe National Academy of Sciences,1996,93:15012-15017）。Zaidi等（Zaidi et al.,Transgenic Rice Plants Expressing a Modified cry1Ca1 Gene are Resistant toSpodoptera litura and Chilo suppressalis.Molecular Biotechnology,2009,43:232-242.）将按照水稻偏爱密码子改造的CrylCa1基因导入粳稻秀水11中，获得的转基因植株对斜纹夜蛾（Prodenia litura）和二化螟（Chilo suppressalis）表现高度抗性，转基因植株中杀虫蛋白为可溶性总蛋白的0.34%。Tang等（Tang et al.,Development of insect-resistant transgenic indica rice with a synthetic Cry1C*gene.MolecularBreeding,2006,1(18):1-10）和Ye等（Ye et al.,Development of insect-resistanttransgenic rice with Cry1C*-free endosperm.Pest Management Science,2009,9(65):1015-1020）分别将按照植物偏爱密码子人工修饰改造后的CrylC*基因导入籼稻恢复系明恢63和粳稻中花11号中，转基因后代及其杂交种对稻纵卷叶螟和水稻螟虫表现为高度抗性，ELISA检测转基因水稻明恢63在抽穗期Bt蛋白含量为1.38μg/g叶片鲜重；转基因水稻中花11号在分蘖期Bt蛋白含量为0.87-3.13μg/g叶片鲜重，在灌浆期Bt蛋白含量为0.71-0.86μg/g叶片鲜重。
但按照Tang等和Ye等的方法对Cry1Ca5基因进行改造，并将改造后的Cry1Ca5基因导入植物中进行表达，其表达效果不很理想。
发明内容
本发明的目的是提供克服原始Bt杀虫蛋白在植物中表达水平低、抗虫效果差的缺陷，提供一种在植物中表达水平高、抗虫效果好的Bt杀虫蛋白。
本发明的发明人通过比较前人密码子优化的方法发现，他们采用的优化策略单一，也没有发现专门针对苏云金杆菌原始的Cry1Ca5基因进行密码子优化。
因此，一方面，本发明提供了一种人工优化设计的Cry1Ca#基因，其中，该Cry1Ca#基因具有SEQ ID No.1所示的序列，且该Cry1Ca#基因能够编码对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
优选地，该Cry1Ca#基因的5’端还具有信号肽序列、3’端还具有亚细胞器定位信号序列。
优选地，该Cry1Ca#基因的5’端还具有限制性内切酶识别序列和Kozak序列，且该Cry1Ca#基因的3’端还具有限制性内切酶识别序列。
优选地，该Cry1Ca#基因的5’端还具有启动子序列和增强子序列、3’端还具有转录终止子序列。
另一方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体插入有本发明提供的如上所述的Cry1Ca#基因，该重组载体能够使所插入的Cry1Ca#基因得到表达。
另一方面，本发明还提供了一种改变作物抗性的方法，其中，该方法包括将如上所述的重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在所述作物中表达。
通过上述技术方案，提高了优化基因中GC含量和水稻偏爱密码子的比例，消除了原始基因中的Poly A加尾识别信号序列和内含子切割识别序列。大大提高了优化后的Cry1Ca#基因在植物中的表达水平。优选情况下，在Cry1Ca#基因的5’端添加转运信号肽序列、3’端添加内质网定位序列；且该Cry1Ca#基因的5’端还具有限制性内切酶识别序列和Kozak序列，3’端还具有限制性内切酶识别序列，所获得的Bt杀虫蛋白的表达量能够达到35.07μg/g叶片鲜重，可以为水稻提供对稻纵卷叶螟等水稻害虫的高抗性。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：植物表达载体pC3300-Cry1Ca的构建流程。
图2：转基因水稻中Cry1Ca#基因（右）和Bar基因（左）的PCR扩增产物的凝胶电泳图。其中：M为DNA分子量标记；P为质粒pC3300-Cry1Ca；B为水空白对照；CK为非转基因水稻R893；1-6为转基因水稻B1C893的6个株系。
图3：转基因水稻B1C893的Southern杂交印迹图。其中：P为质粒pC3300-Cry1Ca；CK为非转基因水稻R893；1-6为转基因水稻B1C893的6个株系。
图4：转基因水稻B1C893的不同株系苗期不同器官的Cry1Ca#蛋白浓度测定结果。其中：CK为非转基因水稻R893；4-6为转基因水稻B1C893的第4、第5和第6株系。
图5：转基因水稻B1C893对稻纵卷叶螟抗性的生物测定结果。其中：R893为非转基因水稻R893；B1C893为转基因水稻B1C893。
图6：T1代转基因植株B1C893的草铵膦抗性检测结果。其中：CK为非转基因水稻R893；1-6为转基因水稻B1C893的6个株系。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种人工优化设计的Cry1Ca#基因，其中，该Cry1Ca#基因具有SEQIDNo.1所示的序列，且该Cry1Ca#基因能够编码对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
本发明提供的密码子优化的Cry1Ca5基因，其命名为Cry1Ca#基因，相比原始的Cry1Ca5基因，按照水稻偏爱密码子分布进行了密码子优化，基本替换掉了原始Cry1Ca5基因中存在的水稻稀有密码子，以使其密码子相对使用度与水稻保持一致，同时也大大降低了密码子ACG、TCG、GCG、CCG所占的比例，减少了可能发生甲基化的位点。密码子优化的Cry1Ca5基因的RSCU（密码子相对使用概率）值与原始Cry1Ca5基因RSCU值的比较如表1所示。与原始Cry1Ca5基因的DNA序列相比，其氨基酸组成保持不变，改变碱基407个，占碱基总数的21.53%，更改密码子364个，占整个密码子的57.78%；G+C含量由原始序列的36.51%提高到55.47%；并且消除了原始序列中存在的富含AT序列的位点23处及内含子剪切信号位点18处。这些位点的存在可能会造成转录本的不正常剪切，从而导致成熟mRNA的不完整性。
根据本发明的Cry1Ca#基因，该Cry1Ca#基因的5’端还具有信号肽序列、3’端还具有亚细胞器定位信号序列和翻译终止密码子。
根据本发明，所述信号肽序列、亚细胞器定位信号序列和翻译终止密码子可以选择本领域常规的信号肽序列、亚细胞器定位信号序列和翻译终止密码子。优选的，Cry1Ca#基因的序列如SEQ ID No.2所示；SEQ ID No.2所示的序列是在以上密码子优化的Cry1Ca#基因序列（SEQ ID No.1）的5’端添加SEQ ID No.3所示的PR1a信号肽序列，3’端添加SEQ IDNo.4所示的内质网滞留信号KDEL序列和翻译终止密码子tgatta得到的。并且该Cry1Ca#基因（SEQ ID No.2）能够编码N端具有PR1a信号肽序列、C端具有内质网滞留信号序列的对鳞翅目昆虫具有致死活性的Cry1Ca#蛋白（SEQ ID No.5）；其中，信号肽和定位信号肽可以使表达后的Cry1Ca#蛋白靶向性的运输到细胞的内质网等质体内中积累，提高了杀虫蛋白的表达量。
优选地，根据本发明的Cry1Ca#基因的5’端还具有限制性内切酶识别序列和Kozak特征序列，且3’端还具有限制性内切酶识别序列。
其中，术语“Kozak特征序列”是指用来增强真核基因翻译效率，避免核糖体出现漏洞扫描（leaky scan）的序列。
优选的情况下，在上述组合序列（SEQ ID No.2）5’端添加的所述限制性内切酶序列为SmaI的识别序列（cccggg），所述Kozak特征序列为accatgg，3’端添加的所述限制性内切酶序列为SacI的识别序列（gagctc）。最终形成的Cry1Ca#基因的序列如SEQ ID No.6所示。
优选地，本发明进一步在SEQ ID No.6所示的DNA序列的5’端还添加有能够启动和增强Cry1Ca#基因的转录的启动子序列和增强子序列，3’端还添加有能够终止Cry1Ca#基因转录的转录终止子序列，从而构建了基因表达框。所述启动子序列和增强子序列可以为本领域公知的任何能够启动和增强基因转录的序列。
其中，所述启动子序列优选为SEQ ID No.8所示的序列，且能够启动Cry1Ca#基因的转录；所述增强子序列优选为SEQ ID No.9所示的序列，且能够增强Cry1Ca#基因的转录。所述转录终止子序列优选为SEQ ID No.10所示序列并能够终止Cry1Ca#基因的转录。因此，根据本发明的Cry1Ca#基因的植物表达框的DNA序列优选如SEQ ID No.7所示，它的5’端具有如SEQ ID No.8（即Ubi启动子）和SEQ ID No.9（即Ω增强子序列）所示的序列，作为表达Cry1Ca#基因的启动子和增强子，3’端具有如SEQ ID No.10所示的序列，作为终止Cry1Ca#基因转录的转录终止子。
根据本发明的Cry1Ca#基因能够编码对鳞翅目等昆虫具有致死活性的多肽。
本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体插入有如上所述的Cry1Ca#基因，该重组载体能够使所插入的Cry1Ca#基因得到表达。
本发明中，所述重组载体由上述基因序列和载体组成，所述载体可以为T载体、原核表达载体和真核表达载体中的至少一种，其中，T载体和原核表达载体的主要作用是初步验证基因和目标蛋白的功能，并表达目标蛋白进行检测和安全性评价，而真核表达载体的作用是为了后续将其转化进作物中，并使该基因在作物中高效表达。因此，能够满足上述应用目标的各种T载体（例如，pMD18-T、pMD19-T等）、原核表达载体（pET32a等）和真核表达载体（pCAMBIA3300、pCAMBIA3301等）均可用于本发明。
根据本发明的重组载体，其中，该重组载体还插入有Bar基因，作为筛选标记基因，并且能使Bar基因得到表达；所述Bar基因具有SEQ ID No.12所示的序列，且所述Bar基因能够编码具有抗草铵膦活性的多肽。优选地，所述重组载体由上述Cry1Ca#基因序列和真核表达载体（pCAMBIA3300、pCAMBIA3301等）组成。
根据本发明的重组载体，其中，所述Bar基因的5’端还具有启动子序列，且3’端还具有终止子序列；所述启动子序列包括SEQ ID No.11所示的序列，且能够启动Bar基因的转录；所述终止子序列包括SEQ ID No.13所示的序列，且能够终止Bar基因的转录。优选地，筛选标记基因的表达框依次由CaMV35S启动子（SEQ ID No.11）、筛选标记基因Bar基因（SEQID No.12）以及CaMV35S polyA终止子（SEQ ID No.13）组成。
本发明还提供了一种改变作物抗性的方法，其中，该方法包括将如上所述的重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在所述作物中表达。
根据本发明，术语“作物”为本领域公知的概念，指大面积栽种或大面积收获，供盈利或口粮用的植物。本发明的基因不仅可用于转入水稻，也可以用于转入玉米、高粱、小麦、棉花、油菜、大豆、土豆、蔬菜等。优选地，所述作物为水稻，所述水稻包括各种水稻，如各亚种（籼稻、粳稻、爪哇稻）、各生态型（早稻、中稻、晚稻）水稻等。优选地，本发明中选水稻恢复系R893（龙和平,唐俐,钟其全.高产优质杂交籼稻新组合准两优893的选育与应用.杂交水稻,2010,25(5):15-16）作为转化的受体作物。
实现转基因的方法有本领域公知的农杆菌介导转化法、基因枪法和花粉管通道法等。优选地，本发明所用的转化方法为农杆菌介导转化法。所述农杆菌介导转化法可以为传统的常规法，如Yukoh Hiei等（Transformation of rice mediated by Agrobacteriumtumefaciens.Plant Molecular Biology,1997,35,205-218）报道的方法，也可采用Seiichi Toki 等（Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allowshigh-speed transformation of rice.The Plant Journal,2006,47,969-976）报道的快速转化方法。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
其中，DNA序列SEQ ID No.6委托大连宝生物公司合成并连接在pMD19-T载体上；各种PCR引物的合成和基因测序工作委托华大基因公司进行；各种酶均购自大连宝生物公司；pMD19-T载体购自大连宝生物公司；pCAMIA3300载体由澳大利亚农业分子生物学应用中心（CAMBIA，http://www.cambia.org）提供；质粒的提取、纯化和酶切及其他常规分子生物学操作参考《分子克隆》（科学出版社，第三版）；植物DNA提取、纯化和酶切等常规分子生物学操作参考《植物基因工程》（科学出版社，第二版）。
实施例1
本实施例用于说明本发明的Cry1Ca#基因的密码子优化方法。
以苏云金杆菌的杀虫蛋白基因Cry1Ca5为蓝本，Cry1Ca5原始基因序列来自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其查询号为X96682。选择水稻品种日本晴基因组数据库作为分析对象，网址为http://rgp.dna.affrc.go.jp/giot/INE.html。首先筛选蛋白表达量较高、功能注释详细的基因的编码序列作为分析对象，运用CodonW（http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=codonw）及SeqnConverter（http://www.cibj.com/seqnconverter.zip）分析软件，对筛选得到的101条完整的蛋白编码序列进行密码子使用频率分析，结果见表1。
在保持Cry1Ca5蛋白氨基酸顺序不变的前提下，把Cry1Ca5基因中RSCU值（即同 义密码子相对使用度，指某一密码子所使用的频率与其在无偏性使用时预期频率之间的比值）小于0.5的密码子替换成水稻偏爱的密码子，即在同义密码子组中RSCU值最大的水稻密码子；RSCU值在0.5-1之间的密码子只是部分替换成水稻偏爱的密码子；而RSCU值在1以上的密码子不作改变。同义密码子替换过程中，降低密码子ACG、TCG、GCG、CCG所占的比例，以减少可能发生甲基化的位点。
Mfold软件（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）中具有基于最小自由能模型预测mRNA二级结构的功能。输入以上密码子优化后的序列，根据输出的mRNA二级结构图，利用同义密码子替换法消除二级结构中可能形成的稳定发夹环等二级结构，获得SEQIDNo.1所示的DNA序列。
上述密码子优化后的Cry1Ca5基因，即Cry1Ca#基因（SEQ ID No.1）的密码子的相对使用度（RSCU）如表1中所示，密码子优化后获得的Cry1Ca#基因长度为1890bp，与原始Cry1Ca5基因的DNA序列相比，其氨基酸组成与顺序保持不变，改变碱基407个，占碱基总数的21.53%，更改密码子364个，占整个密码子的57.78%，G+C含量由原始序列的36.51%改变为55.47%。最重要的是，水稻偏爱密码子的分布频率提高了，容易出现DNA序列甲基化的密码子GCG、ACG、CCG和TCG的分布频率降低了。并且消除了原始序列中存在的富含AT序列的位点23处及内含子剪切信号位点18处。优化后获得的Cry1Ca#基因（SEQ ID No.1）不存在潜在的Poly(A)加尾信号位点和常用的酶切位点。
表1人工优化的Cry1Ca5基因、原始的Cry1Ca5基因与水稻编码蛋白基因的密码子相对使用度（RSCU）比较
注:同义密码子相对使用度（RSCU）表示某一密码子所使用的频率与其在无偏性使用时预期频率的比值，括号内数据表示某一密码子在统计中所出现的频率。
实施例2
本实施例用于说明本发明的Cry1Ca#基因的优化方法
对实施例1中经过密码子优化后获得的Cry1Ca#基因进行如下修饰：5’端添加有利于多肽转运的信号肽DNA序列，即SEQ ID No.3所示的序列（烟草病毒相关蛋白基因的信号肽序列PR1a）；3’端添加有利于多肽在亚细胞器内定位和积累的信号肽DNA序列，即SEQ IDNo.4所示的序列（内质网滞留信号肽KDEL的DNA序列），以及翻译终止密码子（序列为tgataa）以终止蛋白质的翻译。组合而成的融合基因Cry1Ca#的序列如SEQID No.2所示，其能编码N端具有PR1a信号肽、C端具有KDEL内质网滞留信号肽的对鳞翅目等昆虫具有致死活性的Cry1Ca#蛋白（SEQ ID No.5），该蛋白能快捷转运定位并滞留在内质网等细胞器中，以增加其表达积累量。
实施例3
本实施例用于说明本发明的Cry1Ca#基因的优化方法
在实施例2中优化的Cry1Ca#基因序列的5’端添加acc序列，与已有序列一起组成Kozak特征序列accatgg；然后，在上述组合序列的5’端再添加限制性内切酶SmaI识别序列cccggg、3’端添加SacI识别序列gagctc，最终形成如SEQ ID No.6所示的DNA序列。该序列为全新序列，委托大连宝生物公司合成并连接在pMD19-T载体上，得到带有Cry1Ca#基因的pMD19-T载体，命为pMD19-T-Cry1Ca。
实施例4
本实施例用于说明植物表达载体pC3300-Cry1Ca的构建。
将实施例3得到的pMD19-T-Cry1Ca载体与pC3300-Ubi-Ω-OsbHLH1载体（该载体已包含Ubi启动子、Ω增强子序列和Nos终止子序列等，载体来源参考：罗伯祥等，OsbHLH1基因过表达载体构建及转化水稻研究.生物技术通报，2009(7):76-81.）双酶切（上游酶切位点为SmaI，下游酶切位点为SacI）、回收、再连接，将SEQ ID No.6所示的序列替换掉原载体中的OsbHLH1基因，组成由Ubi启动子序列（SEQ ID No.8）、Ω增强子序列（SEQ ID No.9）、Cry1Ca#基因序列（SEQ ID No.6）和Nos终止子序列（SEQID No.10）串联而成的Cry1Ca#基因植物表达框序列（SEQ ID No.7），得到的重组载体命名为pC3300-Cry1Ca；该载体还具有由CaMV35S启动子序列（SEQ ID No.11）、Bar 基因序列（SEQ ID No.12）和CaMV35S polyA终止子序列（SEQ ID No.13）串联组成的Bar基因植物表达框序列；两个基因的植物表达框处在两个T边界内，载体构建流程图如图1所示。将该重组载体转化进大肠杆菌DH5α菌株，通过卡那霉素抗性培养基筛选，挑取单菌落培养，提取质粒，进行PCR和相应的酶切鉴定阳性克隆（上游引物如SEQID No.14所示，下游引物如SEQ ID No.15所示；PCR扩增产物大小为287bp；反应程序为：95℃5min，94℃1min，55℃45s，72℃45s，30个循环后72℃延伸10min）。PCR和酶切鉴定结果证明pC3300-Cry1Ca重组载体构建成功。
实施例5
本实施例用于说明检测优化基因Cry1Ca#在B1C893中的整合表达
1）转基因植株的PCR检测
SDS法提取植株总DNA。PCR分析：（1）试验材料：转基因植株B1C893-1至B1C893-6；阴性对照R893；阳性对照质粒DNA。（2）检测引物：Cry1Ca#基因的上游引物PCry1Ca-1序列如SEQ ID No.14，下游引物PCry1Ca-2序列如SEQ ID No.15；检测Bar基因的上游引物PBar-1序列如SEQ ID No.16，下游引物PBar-2序列如SEQ ID No.17。（3）反应程序为：95℃5min，94℃1min，55℃45s，72℃45s，35个循环后72℃延伸10min。
对Cry1Ca#基因和Bar基因的检测结果如图2所示。其中，M为DNA分子量标记，Cry1Ca#基因目标条带大小为287bp，Bar基因的目标条带大小为486bp，P为阳性对照（质粒pC3300-Cry1Ca），B为空白对照（水），CK为阴性对照（非转基因水稻R893），1-6为B1C893-1至B1C893-6的6个转基因株系的检测结果。从图2可以看出，泳道1-6都观察到了目标条带，说明B1C893-1至B1C893-6转基因株系都成功转入了Cry1Ca#基因和Bar基因。
2）转基因植株的Southern检测
SDS法提取植株总DNA。取水稻总DNA约30μg，用HindⅢ和EcoR I分别酶切过夜，用1.0%琼脂糖凝胶分离，利用盐桥法转移到带正电荷的尼龙膜上。Cry1Ca#基因探针以含Cry1Ca#基因酶切产物为模板，扩增引物与Cry1Ca#基因的检测引物相同（上游引物如SEQ IDNo.14所示，下游引物如SEQ ID No.15所示），用地高辛标记试剂盒（LabKit,China）标记Southern杂交探针。采用地高辛标记核酸检测试剂盒DIGD-110（LabKit, China）进行Southern杂交和化学发光检测。
对Cry1Ca#基因的Southern检测结果如图3所示。其中，P为阳性对照（质粒pC3300-Cry1Ca），CK为阴性对照（非转基因水稻R893），1-6为B1C893-1至B1C893-6的6个转基因株系的检测结果。从图3发现，B1C893-1至B1C893-2为同一转化体，B1C893-3至B1C893-6的转基因株系为同一转化体，说明外源基因Cry1Ca#已整合到水稻基因组中。
3）转基因植株的Cry1Ca#蛋白的定量检测
分别取T2代苗期转基因植株的新鲜叶片、叶鞘及根各约10mg，加入蛋白提取缓冲液研磨成浆，采用Envirologix蛋白定量试剂盒AP007（Envirologix,USA）测定Cry1Ca#蛋白含量，每个样品设3次重复，具体操作参照试剂盒说明书进行。各株系的Cry1Ca#蛋白定量检测结果如图4（CK为非转基因水稻R893；4-6为转基因B1C893的第4、第5、第6株系）和表2所示。转基因植株不同器官及不同株系之间Cry1Ca#蛋白表达量存在明显差异，以新鲜叶片中Cry1Ca#蛋白含量最高，其中又以第6号株系的Cry1Ca#蛋白含量最高，达到35.07μg/g叶片鲜重；新鲜根系中的Cry1Ca#蛋白含量最低。
ELISA检测表明Cry1Ca#基因可以成功地转录并翻译出Cry1Ca#蛋白，新鲜叶片中Cry1Ca#蛋白含量变幅为25.51-35.07μg/g叶片鲜重，平均为31.63μg/g叶片鲜重；新鲜叶鞘中Cry1Ca#蛋白含量变幅为8.89-12.13μg/g叶鞘鲜重，平均为9.71μg/g叶鞘鲜重；新鲜根中Cry1Ca#蛋白含量变幅为3.66-7.17μg/g根鲜重，平均为5.29μg/g根鲜重。
表2转基因水稻B1C893新鲜叶片、叶鞘及根系中Cry1Ca#蛋白相对定量检测结果
实施例6
本实施例用于说明转基因植株抗虫能力检测。
随机剪取生长期大致相同的T2代转基因水稻B1C893（第6号株系）及非转基因水稻R893的叶片，每4片叶片用湿润滤纸包好放入玻璃管中。每管接入10头1龄稻纵卷叶螟幼虫，管口用棉塞包裹后，两端用黑布遮盖避光，然后将接好虫的玻璃管放入培养箱中（温度28℃，光照14h/d，相对湿度85%）。实验组和对照组均设计3个重复，96h（4天）后观察观察幼虫的存活情况。
饲喂4天后观察发现：非转基因对照组的植株叶片损伤严重，幼虫平均死亡率仅13.3%，存活的幼虫发育正常，均达到二龄或二龄以上；转基因水稻B1C893中的幼虫100%死亡。结果可见图5（R893为非转基因水稻R893，B1C893为转基因水稻B1C893）和表3。
表3转基因水稻B1C893室内稻纵卷叶螟幼虫生物测定结果
株系 幼虫死亡率 标准误差
R893（CK） 13.3% 0
B1C893 100% 1.156
实施例7
本实施例用于说明转基因植株的草铵膦抗性检测。
用1g/L的草铵膦涂抹非转基因水稻R893和T1代转基因水稻B1C893各株系叶片，7天后观察植株叶片生长情况。结果如图6所示，其中，CK为非转基因水稻R893，1-6为转基因水稻株系B1C893-1至B1C893-6，非转基因水稻R893叶片已经枯黄，而转基因水稻B1C893的各株系叶片正常生长。说明本发明的方法获得的转基因水稻具有抗草铵膦的性能。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (16)

1.一种人工优化设计的Cry1Ca#基因，其特征在于，该Cry1Ca#基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示，且该Cry1Ca#基因能够编码对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽。
2.一种人工优化设计的Cry1Ca#基因，其特征在于，该Cry1Ca#基因的核苷酸序列为如下的核苷酸序列：在SEQ ID No.1的5’端连接有信号肽序列，3’端连接有亚细胞器定位信号序列。
3.根据权利要求2所述的Cry1Ca#基因，其中，所述信号肽序列为如SEQ ID No.3所示的PR1a信号肽序列，所述亚细胞器定位信号序列为如SEQ ID No.4所示的内质网滞留信号KDEL序列。
4.根据权利要求3所述的Cry1Ca#基因，其中，该Cry1Ca#基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；且该Cry1Ca#基因能够编码N端具有PR1a信号肽、C端具有内质网滞留信号的对鳞翅目昆虫具有致死活性的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
5.一种人工优化设计的Cry1Ca#基因，其特征在于，该Cry1Ca#基因的核苷酸序列为如下的核苷酸序列：在权利要求1-4中任意一项所述的Cry1Ca#基因的5’端连接有限制性内切酶识别序列和Kozak序列，且该Cry1Ca#基因的3’端连接有限制性内切酶识别序列。
6.根据权利要求5所述的Cry1Ca#基因，其中，该Cry1Ca#基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
7.一种人工优化设计的Cry1Ca#基因，其特征在于，该Cry1Ca#基因的核苷酸序列为如下的核苷酸序列：在权利要求1-6中任意一项所述的Cry1Ca#基因的5’端连接有启动子序列和增强子序列、3’端连接有转录终止子序列。
8.根据权利要求7所述的Cry1Ca#基因，其中，所述启动子序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示，且能够启动Cry1Ca#基因的转录；所述增强子序列的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，且能够增强Cry1Ca#基因的转录；所述转录终止子序列的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示并能够终止Cry1Ca#基因的转录。
9.根据权利要求8所述的Cry1Ca#基因，其中，该Cry1Ca#基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。
10.一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有权利要求1-9中任意一项所述的Cry1Ca#基因，该重组载体能够使所插入的Cry1Ca#基因得到表达。
11.根据权利要求10所述的重组载体，其中，该载体插入有SEQ ID No.7所示的序列。
12.根据权利要求10或11所述的重组载体，其中，该重组载体还插入有Bar基因，并且能够使Bar基因得到表达；所述Bar基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，且所述Bar基因能够编码具有抗草铵膦活性的多肽。
13.根据权利要求10或11所述的重组载体，其中，该重组载体还插入有Bar基因，并且能够使Bar基因得到表达；所述Bar基因的核苷酸序列为如下的核苷酸序列：在SEQ ID No.12的5’端连接有启动子序列，3’端连接有终止子序列；所述启动子序列的核苷酸序列如SEQID No.11所示，且能够启动Bar基因的转录；所述终止子序列的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，且能够终止Bar基因的转录。
14.一种改变作物抗鳞翅目昆虫活性和/或草铵膦抗性的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求10-13中任意一项所述的重组载体转化进所述作物中，使所述重组载体中插入的基因在所述作物中表达；其中，所述作物为水稻、玉米、高粱和小麦中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述作物为水稻。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述作物为水稻恢复系R893。
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Application publication date: 20150121

Assignee: Hunan Luojia Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: INSTITUTE OF SUBTROPICAL AGRICULTURE, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

Contract record no.: X2024980010218

Denomination of invention: Cry1Ca#gene and recombinant vector optimized by codons, and methods for altering crop resistance

Granted publication date: 20171117

License type: Exclusive License

Record date: 20240722