CN107383177B

CN107383177B - 人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1Ab

Info

Publication number: CN107383177B
Application number: CN201710701976.5A
Authority: CN
Inventors: 赖锦盛; 赵海铭; 宋伟彬
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Beijing Liangyuan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2037-08-16
Also published as: CN107383177A

Abstract

本发明公开了人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1Ab。本发明所提供的用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1Ab编码mCry1Ab蛋白。mCry1Ab蛋白为b1)或b2)或b3)：b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；b3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗虫相关的蛋白质。实验表明，mcry1Ab基因较cry1Ab基因更容易获得高表达量的转化体，并且与cry1Ab蛋白相比，mcry1Ab蛋白对玉米螟、黏虫、棉铃虫和桃蛀螟的杀虫活性明显提高，具有重要的推广价值。

Description

人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1Ab

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及用于植物表达的Bt mcry1Ab基因。

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，该菌为革兰氏阳性土壤杆菌，属于芽孢杆菌属，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上)，这些蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫具有特异性的杀虫活性。

1981年Schenpf和Whiteley从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了第一个编码δ-内毒素的cry基因Cry1Aa1。1985年Adang,M.J等从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了Cry1Ac基因，1986年Wabiko,H.等人从苏云金芽孢杆菌中克隆了cry1Ab基因，该基因编码1155个氨基酸，是目前产业化应用较为广泛的抗虫基因。1991年Chambers,J克隆了cry1Fa基因。截止到目前，已确定千余种苏云金芽孢杆菌菌系及万余种的杀虫晶体蛋白。

1983年美国华盛顿大学宣布成功将卡那霉素抗性基因导入烟草细胞，以及同年4月美国威斯康星大学宣布成功将大豆基因转入向日葵共同标志着植物转基因技术的诞生。1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。1990年Gordon-Kamm首次报道用基因枪转化玉米悬浮细胞系获得了可育的转化体。随后，玉米转基因技术开始迅猛发展，大量转基因植物陆续研制开发成功。Koziel(1993)等培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能水平表达Cry1Ab抗虫基因，提升玉米的抗虫性。张秀君(1999)等用基因枪法将两个含高赖氨酸蛋白质基因导入玉米的胚性愈伤组织。刘大文(2000)等将Zm13-Barnase基因转化玉米胚性愈伤组织，经过除草剂筛选得到阳性植株。Ishida(1996)等首次利用超双元载体建立了根癌农杆菌转化玉米自交系的幼胚，Frame(2002)等成功实现了根癌农杆菌利用普通的双元载体转化幼胚。张艳贞(2002)等对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为系统的研究。Huang和Wei(2005)利用根癌农杆菌成功转化了常规玉米自交系。Frame(2006)等和Lee(2007)等分别利用农杆菌成功转化了常规玉米自交系。

我国在转基因技术研究方面，已经建立了比较成熟的玉米转基因技术体系，在国内，中国农业大学较早的开展了玉米遗传转化的工作，1994在国内外首次用子房注射的方法把抗虫基因Bt转入玉米并获得转基因植株，以自主知识产权基因Bt为代表的抗虫玉米已展示了良好的开发前景。同时，在无选择标记、选择标记基因删除和目标基因产物定时降解、植物组织特异性优势表达等核心技术创新方面已具有较强的创新能力。目前已分离的抗虫基因很多，主要的抗虫基因有：①细菌来源的抗虫基因，主要是Bt毒蛋白基因(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2A、Cry3C等)；②植物来源的蛋白酶抑制剂基因，特点在于抗虫谱广、来源于植物本身易于被公众接受；③细菌来源的营养杀虫蛋白(Vip1、Vip2、Vip3等)，广谱抗鳞翅目，特别是对小地老虎、粘虫和甜菜叶蛾具有较强作用。由于基因抗虫能力及昆虫耐受性的影响，转基因抗虫产品主要通过获得更多更有效的抗虫基因、改造已有基因、双抗植物体等途径获得。

美国已成为世界上种植转基因玉米最大的国家，转基因玉米推广面积占美国玉米总面积的比例由2000年的25％上升至2015年的92％。数据显示，由于Bt玉米的使用，农药和杀虫剂的用量明显下降，大大减少了对环境的污染。既减少了农业生产成本，又可以节省劳动力。玉米抗虫的优良性状为社会带来了巨大的经济和环境效益，而在我国转基因玉米品种培育较美国还有较大差距，为此2008年国家启动了《转基因生物新品种培育科技重大专项》来改善目前状况。我国在转基因抗虫玉米品种培育方面虽有些报道，但是却没有能够最终商品化，主要归结于Bt基因的抗虫效果及转化植株的稳定性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物抗虫性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了mCry1Ab蛋白。

本发明所提供的mCry1Ab蛋白，可为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗虫相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由624个氨基酸残基组成。

为了使b1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述b3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述mCry1Ab蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述mCry1Ab蛋白的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：

(a1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述mCry1Ab蛋白的DNA分子；

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述mCry1Ab蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由1875个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述mCry1Ab蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述mCry1Ab蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述mCry1Ab蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的mCry1Ab蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述表达盒的核苷酸序列如序列表中序列5所示。序列表中序列5中，自5’末端起第1至583位为玉米Gly启动子的核苷酸序列，第584至2458位为mCry1Ab基因的核苷酸序列，第2466至2718位为nos终止子的核苷酸序列(用于终止转录)。

所述重组载体可为将编码所述mCry1Ab蛋白的核酸分子(即序列表中序列1所示的DNA分子)插入出发质粒得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab。所述重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab为将载体pCAMBIA3301的限制性内切酶HindIII和BstEII识别序列间的小片段替换为序列表中序列5自5’末端起第1至2458位所示的双链DNA分子。重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab表达序列表中序列2所示的mcry1Ab蛋白。

所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。

所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述重组微生物具体可为EHA105/pCAMBIA3301+mCry1Ab。EHA105/pCAMBIA3301+mCry1Ab是将重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab转化根癌农杆菌EHA105得到的重组农杆菌。

所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述mCry1Ab基因(即mCry1Ab蛋白的编码基因)转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

所述mCry1Ab蛋白，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的应用也属于本发明的保护范围；所述mCry1Ab蛋白，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的应用可为e1)或e2)或e3)：e1)提高植物抗虫性；e2)制备具有抗虫效果的产品；e3)培育抗虫性提高的转基因植物。

上述应用中，所述产品可为药物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：将编码所述mCry1Ab蛋白的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗虫性增强。

上述方法中，编码所述mCry1Ab蛋白的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：

(a1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

上述方法中，所述“将编码所述mCry1Ab蛋白的核酸分子导入受体植物中”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述mCry1Ab蛋白的核酸分子得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为所述重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。

本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述mCry1Ab蛋白的含量和/或活性，从而增加抗虫性。

上述植物育种方法中，所述“增加植物中所述mCry1Ab蛋白的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述mCry1Ab蛋白的含量和/或活性的效果。

上述任一所述植物可为c1)至c5)中的任一种：c1)单子叶植物；c2)双子叶植物；c3)禾本科植物；c4)玉米；c5)玉米品种X178。

上述任一所述抗虫性可为抗鳞翅目昆虫。所述鳞翅目昆虫可为d1)至d5)中的任一种：d1)玉米螟；d2)东方黏虫；d3)棉铃虫；d4)桃蛀螟；d5)亚洲玉米螟。

Cry1Ab基因对鳞翅目昆虫(如玉米螟、黏虫和棉铃虫等)有很强的毒性，但是原始的基因不能在植物中高效表达，达不到植物保护的要求。本发明的发明人对Cry1Ab蛋白的活性区域进行了细致的分析，在保证进一步提高其表达水平的前提下，按照单子叶植物编码特征对Cry1Ab蛋白进行了基因编码框及密码子改造。改造后的Cry1Ab蛋白命名为mcry1Ab蛋白。mcry1Ab蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。编码mcry1Ab蛋白的基因(即改造后的Cry1Ab基因，以下简称为mcry1Ab基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。本发明的发明人将改造后的mcry1Ab基因连在玉米Gly为启动子的表达载体上。通过农杆菌转化的方法，把mcry1Ab基因转到具有高效转化效率的玉米自交系中，然后通过回交的方法获得了含有mcry1Ab基因的转基因玉米骨干自交系。实验表明，经过密码子优化的mcry1Ab基因较密码子优化前更容易获得高表达量的转化体，并且与cry1Ab蛋白相比，mcry1Ab蛋白对玉米螟、黏虫、棉铃虫和桃蛀螟的杀虫活性明显提高，具有重要的推广价值。

附图说明

图1为实施例3步骤五的实验结果。

图2为实施例3步骤六的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

N6E培养基的溶质及其浓度为4g/L的N6盐、5mL/L的N6vitamin Stock(200×)、2mg/L的2，4-D、0.1g/L的肌醇、2.76g/L的脯氨酸、30g/L的蔗糖、0.1g/L的酪蛋白水解物、2.8g/L的植物凝胶和3.4mg/L的硝酸银；溶剂为蒸馏水；pH值为5.8。

N6vitamin Stock(200×)：含甘氨酸0.4g/L、烟酸0.1g/L、VB₁ 0.2g/L和VB₆ 0.1g/L的水溶液。

N6E固体平板：将约55℃的N6E培养基倒入培养皿，冷却后得到N6E固体平板。

浸染培养基：将蔗糖68.4g、N6大量(20×)50mL、B5微量(100×)10mL、N6铁盐(100×)10mL、RTV有机(200×)5mL和100μmol的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.2。

N6大量(20×)：含(NH₄)₂SO₄ 9.26g/L、KNO₃ 56.60g/L、KH₂PO₄ 8.00g/L、MgSO₄·7H₂O 3.70g/L和CaCl₂·2H₂O 3.32g/L的水溶液。

B5微量(100×)：含MnSO₄·H₂O 0.7600g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.2000g/L、H₃BO₃0.3000g/L、KI 0.0750g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.0250g/L、CuSO₄·5H₂O 0.0025g/L和CoCl₂·6H₂O 0.0025g/L的水溶液。

N6铁盐(100×)：含乙二胺四乙酸钠铁盐1.8300g/L的水溶液。

RTV有机(200×)：将氯化胆碱0.0196g、VB₂ 0.0098g、D-生物素0.0200g、烟酸0.0400g、叶酸0.0097g、VB₁ 0.0944g、D-泛酸钙0.0200g、VB₆ 0.0400g、对氨基苯甲酸0.0098g和400μL浓度为0.75mg/100mL的VB₁₂水溶液溶于1L蒸馏水。

共培养培养基：将MS盐4.33g、MS Vitamins(500×)2mL、盐酸硫胺0.5mg、蔗糖30.0g、L-脯氨酸1.38g、2,4-D 0.5mg、6-BA 0.01mg、植物凝胶3.5g和100μmol的AS溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7。

MS Vitamins(500×)：含甘氨酸1g/L、烟酸0.25g/L、VB₁ 0.05g/L和VB₆ 0.25g/L的水溶液。

恢复培养基：将MS盐4.33g、MS Vitamins(500×)2mL、盐酸硫胺0.5mg、蔗糖30.0g、L-脯氨酸1.38g、2,4-D 0.5mg、6-BA 0.01mg、植物凝胶3.5g、Tim 100mg、双丙氨膦3.0mg和AgNO₃3.4mg溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7。

一次选择培养基：含1.5mg/L双丙氨磷的MS固体培养基。

二次选择培养基：含3.0mg/L双丙氨磷的MS固体培养基。

再生培养基Ⅰ：将MS盐4.33g、MS Vitamins(500×)2mL、盐酸硫胺0.5mg、蔗糖10.0g、葡萄糖20g、L-脯氨酸0.7g、植物凝胶3.5g、酪蛋白水解物0.2g、甘氨酸0.04g、肌醇0.1g和双丙氨膦3.0mg溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7。

再生培养基Ⅱ：将MS盐2.165g、蔗糖30.0g、植物凝胶3.5g和双丙氨膦3.0mg溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.7。

原核表达载体pEASY-E1为北京全式金生物技术有限公司的产品。

实施例1、Cry1Ab基因的改造和mCry1Ab基因的获得

Cry1Ab蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。编码Cry1Ab蛋白的基因(以下简称为Cry1Ab基因)的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

本发明的发明人对Cry1Ab蛋白的活性区域进行了细致的分析，在保证进一步提高其表达水平的前提下，按照单子叶植物编码特征对Cry1Ab蛋白进行了基因编码框及密码子改造。改造后的Cry1Ab蛋白命名为mcry1Ab蛋白。mcry1Ab蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。编码mcry1Ab蛋白的基因(即改造后的Cry1Ab基因，以下简称为mcry1Ab基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

mcry1Ab基因与Cry1Ab基因的序列同源性只有68％，同源区域仅为53％，编码框长度由原来的1155个氨基酸变为624个氨基酸，而G+C含量也由原来的38.8％变为59.7％，改造前后密码子使用率详见表2。

表2

实施例2、mcry1Ab蛋白对鳞翅目昆虫的生测

一、mcry1Ab蛋白的体外表达及纯化

mcry1Ab蛋白的体外表达及纯化的步骤具体如下：

1、人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子。

2、将步骤1合成的双链DNA分子与原核表达载体pEASY-E1连接，得到重组质粒pEASY-mcry1Ab。

对重组质粒pEASY-mcry1Ab进行测序。测序结果表明，重组质粒pEASY-mcry1Ab中含有序列表中序列1所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的mcry1Ab蛋白。

3、将重组质粒pEASY-mcry1Ab导入大肠杆菌transetta，得到重组菌，将该重组菌命名为transetta-mcry1Ab。

4、取transetta－mcry1Ab的单克隆，接种至100mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄霉素)，37℃、200rpm振荡培养12h，得到培养菌液。

5、取培养菌液，按体积比为1:100接种至50mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄霉素)，37℃、200rpm振荡培养至OD_600nm值为0.6，然后加入IPTG并使其浓度为1mM，28℃、220rpm振荡培养4h，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体沉淀。

6、取菌体沉淀，加入100mL pH 8.0、100mM的Tris-HCl缓冲液，重悬后超声破碎(超声波功率600W，循环程序为：破碎4s，停6s，共20min)，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液甲。

7、取上清液甲，4℃、12000rpm离心10min，收集上清液乙。

8、采用GE公司生产的镍柱对上清液乙进行纯化(纯化的具体步骤参考镍柱的说明书)，然后采用赛默飞世尔公司生产的蛋白定量试剂盒对mcry1Ab蛋白进行定量。

按照上述方法，将步骤1中“人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子”替换为“人工合成序列表中序列3所示的双链DNA分子”，其它步骤均不变，得到cry1Ab蛋白。

二、mcry1Ab蛋白对鳞翅目害虫的生测

根据Jing Xue(2008)报道的生测方法对mcry1Ab蛋白和cry1Ab蛋白进行活性比较，分别测定两种蛋白(mcry1Ab蛋白和cry1Ab蛋白)对四种鳞翅目昆虫(亚洲玉米螟、东方黏虫、棉铃虫和桃蛀螟)的杀虫活性。

实验结果见表3。结果表明，mcry1Ab蛋白对四种鳞翅目昆虫的杀虫活性明显好于cry1Ab蛋白，cry1Ab基因对亚洲玉米螟、棉铃虫、黏虫和桃蛀螟的抗虫活性明显提高。

表3

实施例3、转mCry1Ab基因玉米的获得及抗虫性鉴定

一、重组载体的构建

构建重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab并测序。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab进行结构描述如下：将载体pCAMBIA3301的限制性内切酶HindIII和BstEII识别序列间的小片段替换为序列表中序列5自5’末端起第1至2458位所示的双链DNA分子。重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab表达序列表中序列2所示的mcry1Ab蛋白。

重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab中含有表达盒，该表达盒的核苷酸序列如序列表中序列5所示。序列表中序列5中，自5’末端起第1至583位为玉米Gly启动子的核苷酸序列，第584至2458位为mCry1Ab基因的核苷酸序列，第2466至2718位为nos终止子的核苷酸序列(用于终止转录)。

将重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab中mCry1Ab基因的核苷酸序列替换为Cry1Ab基因的核苷酸序列，其它序列均不变，得到重组质粒pCAMBIA3301+Cry1Ab。重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab表达序列表中序列4所示的cry1Ab蛋白。

二、重组农杆菌的获得

将重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab导入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301+mCry1Ab。

将重组质粒pCAMBIA3301导入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301。

将重组质粒pCAMBIA3301+Cry1Ab导入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301+Cry1Ab。

三、转mCry1Ab基因玉米的获得

1、幼胚的获得及培养

(a)在田间种植玉米品种X178，待自花授粉9-11d后，去除授粉果穗的苞叶，然后把果穗放入盛有消毒液(向700mL的50％(v/v)的漂白剂水溶液或次氯酸钠水溶液(有效氯为5.25％(v/v))中加入一滴Tween 20得到)的烧杯里浸泡20min，然后用无菌水洗涤3次。浸泡过程中，需不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果。

(b)完成步骤(a)后，取果穗，将剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E固体平板，幼胚的密度大约是2cm×2cm(30个/皿)。

(c)完成步骤(b)后，取所述N6E固体平板，用封口膜封住，28℃暗培养2-3d。

2、农杆菌浸染液的获得

(a)将EHA105/pCAMBIA3301+mCry1Ab接种于含33mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kana)和50mg/L链霉素(streptomycin，str)的YEP固体培养基上，19℃培养3天，进行活化。

(b)将步骤(a)得到的EHA105/pCAMBIA3301+mCry1Ab接种于浸染培养基中，25℃、75rpm振荡培养，得到OD_550nm为0.3-0.4的农杆菌浸染液。

3、转mCry1Ab基因玉米的获得

光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)的条件为：25℃。光照培养时的光照强度为15000Lx。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。

(a)取完成步骤1的幼胚，置于离心管中，先用浸染培养基洗涤2次(每次使用浸染培养基2mL)，然后加入农杆菌浸染液，轻轻颠倒离心管20次，再直立静置于暗箱5min(确保幼胚全部浸泡在农杆菌浸染液中)。

(b)完成步骤(a)后，将所述幼胚转移至共培养培养基(使幼胚的胚轴接触共培养培养基表面，同时去除共培养培养基表面多余的农杆菌)，然后20℃暗培养3d。

(c)完成步骤(b)后，将所述幼胚转移至恢复培养基，然后28℃暗培养7d。

(d)完成步骤(c)后，将所述幼胚转移至一次选择培养基，然后28℃光暗交替培养两周。

(e)完成步骤(d)后，将所述幼胚转移至二次选择培养基，然后28℃光暗交替培养两周，得到抗性愈伤。

(f)完成步骤(e)后，将抗性愈伤转移至再生培养基Ⅰ，然后28℃光暗交替培养三周。

(g)完成步骤(f)后，将抗性愈伤转移至再生培养基Ⅱ，然后28℃光暗交替培养三周，得到再生苗。待再生苗生长至3-4片叶时转移至温室，正常培养，得到转mCry1Ab基因玉米。将其中5个转mCry1Ab基因玉米依次命名为mCry1Ab-1至mCry1Ab-5。

按照上述方法，将EHA105/pCAMBIA3301+mCry1Ab替换为EHA105/pCAMBIA3301，其它步骤均不变，得到转空载体玉米。

按照上述方法，将EHA105/pCAMBIA3301+mCry1Ab替换为EHA105/pCAMBIA3301+Cry1Ab，其它步骤均不变，得到转Cry1Ab基因玉米。将其中5个转Cry1Ab基因玉米依次命名为Cry1Ab-1至Cry1Ab-5。

四、分子鉴定

分别提取mCry1Ab-1至mCry1Ab-5的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用引物mCry1AbF：5'-GTGGGACGCCTTCCTTGTGC-3'和引物mCry1AbR：5'-TTCTGTGGTGGAATCTCGTCAAGG-3'组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲。分别提取Cry1Ab-1至Cry1Ab-5的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用引物cry1AbF：5'-TGCCCTTACAACCGCTATTCC-3'和引物cry1AbR：5'-CACGTTGTTATTCTGTGGCGGTA-3'组成的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙。

按照上述方法，将mCry1Ab-1的叶片的基因组DNA替换为水，其它步骤均相同，作为阴性对照。

按照上述方法，将mCry1Ab-1的叶片的基因组DNA替换为转空载体玉米的叶片的基因组DNA，其它步骤均相同，作为对照1。

按照上述方法，将mCry1Ab-1的叶片的基因组DNA替换为玉米品种X178的叶片的基因组DNA，其它步骤均相同，作为对照2。

按照上述方法，将mCry1Ab-1的叶片的基因组DNA替换为重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab，其它步骤均相同，作为阳性对照1。

按照上述方法，将mCry1Ab-1的叶片的基因组DNA替换为重组质粒pCAMBIA3301+Cry1Ab，其它步骤均相同，作为阳性对照2。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明，以mCry1Ab-1至mCry1Ab-5的叶片的基因组DNA或重组质粒pCAMBIA3301+mCry1Ab为模板均能扩增得到大小为1035bp的条带，以Cry1Ab-1至Cry1Ab-5的叶片的基因组DNA或重组质粒pCAMBIA3301+Cry1Ab为模板均能扩增得到大小为844bp的条带，以水、转空载体玉米的叶片的基因组DNA或玉米品种X178的叶片的基因组DNA为模板，均不能扩增得到大小为1035bp的条带或大小为844bp的条带。

经分子鉴定，mCry1Ab-1至mCry1Ab-5均为转mCry1Ab基因玉米，Cry1Ab-1至Cry1Ab-5均为转Cry1Ab基因玉米。

五、检测转mCry1Ab基因玉米中Cry1Ab蛋白的含量

待测样品为mCry1Ab-1的叶片、mCry1Ab-2的叶片、mCry1Ab-3的叶片、mCry1Ab-4的叶片、mCry1Ab-5的叶片、Cry1Ab-1的叶片、Cry1Ab-2的叶片、Cry1Ab-3的叶片、Cry1Ab-4的叶片、Cry1Ab-5的叶片、转空载体玉米的叶片或玉米品种X178的叶片。

Bt Cry1Ab/Ac ELISA试剂盒为美国Agdia公司的产品。

实验重复三次取平均值。具体步骤如下：

(1)准备样品及正对照：液氮研磨待测样品，称量0.1g研磨好的样品加入1mL样品提取缓冲液(试剂盒自带)，同时用2mL样品提取缓冲液稀释试剂盒自带的正对照，充分混匀后低速离心30s，准备加样。

(2)用酶联缓冲液(试剂盒自带)按照100:1的比例稀释抗体(试剂盒自带)，将稀释的抗体加入到酶标板中，每孔加入100μl。分别将不同的样品各取10μL加入到相应的样品孔中，同时分别取0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、50μL、100μL正对照加入相应的样品孔中，用洗板缓冲液(试剂盒自带)将各样品孔补至200μL，室温潮湿环境下孵育1h或4℃过夜。

(3)洗板：用1×PBST(试剂盒自带)洗板7次，每次加洗板缓冲液300μL，加满一板后倒掉，洗完后将酶标板倒置，充分去除内部残留液体。

(4)显色：每孔加入100μL TMB显色缓冲液，室温潮湿环境下孵育20min。

通过Thermo MK3酶标仪在650nm波长下分析不同样品的吸光值，利用正对照的绘制标准曲线进行Cry1Ab蛋白定量，然后统计Cry1Ab蛋白占待测样品鲜重的比例，即获得Cry1Ab蛋白的含量。

部分样品在650nm波长下的吸光值见图1。结果表明，mCry1Ab-1至mCry1Ab-5的叶片和Cry1Ab-1至Cry1Ab-5的叶片中均可检测到Cry1Ab蛋白，转空载体玉米的叶片和玉米品种X178的叶片均不能检测到Cry1Ab蛋白。同时，与Cry1Ab-1至Cry1Ab-5相比，mCry1Ab-1至mCry1Ab-5的叶片中Cry1Ab蛋白的含量有不同程度提高。

六、转mCry1Ab基因玉米的抗虫性鉴定

待测玉米为mCry1Ab-1、mCry1Ab-2、mCry1Ab-3、mCry1Ab-4、mCry1Ab-5、Cry1Ab-1、Cry1Ab-2、Cry1Ab-3、Cry1Ab-4、Cry1Ab-5、转空载体玉米或玉米品种X178。

实验设定至少2次生物学重复，每种待测玉米重复设置4-6个平行实验，具体步骤如下：

1、在田间种植待测玉米，待生长至玉米吐丝期，采集玉米雌穗，然后带回室内，剥去苞叶，轻取花丝并放入养虫盒内。

2、完成步骤1后，向每个养虫盒内接入10头初孵玉米螟幼虫，然后置于28℃、光周期16h：8h(L:D)、相对湿度70-80％的人工气候培养箱中培养(培养期间每48h更换相应的新鲜花丝)。144h后，观察花丝的表型。

实验结果见图2。结果表明，与转cry1Ab基因玉米相比，转mcry1Ab基因玉米的花丝抗虫性明显提高。

<110> 中国农业大学

<120> 人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因mcry1Ab

<160> 5

<170> PatentInversion3.5

<210> 1

<211> 1875

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atggacaaca atcccaacat caacgagtgc attccctaca actgcctttc caatcccgag 60

gtggaggtgc ttggtggtga gaggatcgag accggttaca ctcccatcga catctccctt 120

tcccttaccc agttccttct ttccgagttc gtgcccggtg ccggtttcgt gcttggtctt 180

gtggacatca tctggggcat cttcggtccc tcccagtggg acgccttcct tgtgcagatc 240

gagcagctta tcaaccagag gatcgaggag ttcgccagga accaggccat ctccaggctt 300

gagggtcttt ccaaccttta ccagatctac gccgagtcct tcagggagtg ggaggccgat 360

cccaccaatc ccgcccttag ggaggagatg aggatccagt tcaacgacat gaactccgcc 420

cttaccaccg ccatcccact gttcgccgtg cagaactacc aggtgccact gctgtccgtg 480

tacgtgcagg ccgccaacct tcacctttcc gtgcttaggg acgtgtccgt gttcggtcag 540

aggtggggtt tcgacgccgc caccatcaac tccaggtaca acgaccttac caggcttatc 600

ggtaactaca ccgaccacgc cgtgaggtgg tacaacaccg gtcttgagag ggtgtggggt 660

cccgactcca gggactggat caggtacaac cagttcagga gggagcttac ccttaccgtg 720

cttgacatcg tgtccctgtt ccctaactac gactccagga cgtaccctat caggaccgtg 780

tcccagctta ccagggagat ctacaccaac ccagtgcttg agaacttcga cggttccttc 840

cgcggttccg cccagggtat cgaggggtcc atcaggagcc cacaccttat ggacatcctt 900

aactccatca ccatctacac cgacgcccac cgcggtgagt actactggtc cggccaccag 960

atcatggcca gcccagtggg tttctccggt cccgagttca ccttcccact ttacggtacc 1020

atgggtaacg ccgctccaca gcagaggatc gtggcccagc ttggtcaggg tgtgtacagg 1080

accctttcct ccacccttta caggaggccc ttcaacatcg gtatcaacaa ccagcagctt 1140

tccgtgcttg acggtaccga gttcgcctac ggtacctcct ccaaccttcc ctccgccgtg 1200

tacaggaagt ccggtaccgt ggactccctt gacgagattc caccacagaa caacaacgtg 1260

ccaccaaggc agggtttctc ccacaggctt tcccacgtgt ccatgttcag gtccggtttc 1320

tccaactcct ccgtgtccat catcagggct ccaatgttct cctggatcca caggtccgcc 1380

gagttcaaca acatcatccc cagcagccag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440

aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500

cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560

cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620

atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680

ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740

agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800

cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860

cagaaggccg tgtga 1875

<210>2

<211>624

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

35 40 45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

50 55 60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

195 200 205

Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

210 215 220

Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

275 280 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

290 295 300

Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305 310 315 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

325 330 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

340 345 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

355 360 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

405 410 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

420 425 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

450 455 460

Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr

465 470 475 480

Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly

485 490 495

Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg

500 505 510

Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg

515 520 525

Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg

530 535 540

Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn

545 550 555 560

Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn

565 570 575

Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn

580 585 590

Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu

595 600 605

Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val

　　610 615 620

<210> 3

<211> 3468

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atggataaca atccgaacat caatgaatgc attccttata attgtttaag taaccctgaa 60

gtagaagtat taggtggaga aagaatagaa actggttaca ccccaatcga tatttccttg 120

tcgctaacgc aatttctttt gagtgaattt gttcccggtg ctggatttgt gttaggacta 180

gttgatataa tatggggaat ttttggtccc tctcaatggg acgcatttct tgtacaaatt 240

gaacagttaa ttaaccaaag aatagaagaa ttcgctagga accaagccat ttctagatta 300

gaaggactaa gcaatcttta tcaaatttac gcagaatctt ttagagagtg ggaagcagat 360

cctactaatc cagcattaag agaagagatg cgtattcaat tcaatgacat gaacagtgcc 420

cttacaaccg ctattcctct ttttgcagtt caaaattatc aagttcctct tttatcagta 480

tatgttcaag ctgcaaattt acatttatca gttttgagag atgtttcagt gtttggacaa 540

aggtggggat ttgatgccgc gactatcaat agtcgttata atgatttaac taggcttatt 600

ggcaactata cagatcatgc tgtacgctgg tacaatacgg gattagagcg tgtatgggga 660

ccggattcta gagattggat aagatataat caatttagaa gagaattaac actaactgta 720

ttagatatcg tttctctatt tccgaactat gatagtagaa cgtatccaat tcgaacagtt 780

tcccaattaa caagagaaat ttatacaaac ccagtattag aaaattttga tggtagtttt 840

cgaggctcgg ctcagggcat agaaggaagt attaggagtc cacatttgat ggatatactt 900

aacagtataa ccatctatac ggatgctcat agaggagaat attattggtc agggcatcaa 960

ataatggctt ctcctgtagg gttttcgggg ccagaattca cttttccgct atatggaact 1020

atgggaaatg cagctccaca acaacgtatt gttgctcaac taggtcaggg cgtgtataga 1080

acattatcgt ccactttata tagaagacct tttaatatag ggataaataa tcaacaacta 1140

tctgttcttg acgggacaga atttgcttat ggaacctcct caaatttgcc atccgctgta 1200

tacagaaaaa gcggaacggt agattcgctg gatgaaatac cgccacagaa taacaacgtg 1260

ccacctaggc aaggatttag tcatcgatta agccatgttt caatgtttcg ttcaggcttt 1320

agtaatagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct 1380

gaatttaata atataattcc ttcatcacaa attacacaaa tacctttaac aaaatctact 1440

aatcttggct ctggaacttc tgtcgttaaa ggaccaggat ttacaggagg agatattctt 1500

cgaagaactt cacctggcca gatttcaacc ttaagagtaa atattactgc accattatca 1560

caaagatatc gggtaagaat tcgctacgct tctaccacaa atttacaatt ccatacatca 1620

attgacggaa gacctattaa tcaggggaat ttttcagcaa ctatgagtag tgggagtaat 1680

ttacagtccg gaagctttag gactgtaggt tttactactc cgtttaactt ttcaaatgga 1740

tcaagtgtat ttacgttaag tgctcatgtc ttcaattcag gcaatgaagt ttatatagat 1800

cgaattgaat ttgttccggc agaagtaacc tttgaggcag aatatgattt agaaagagca 1860

caaaaggcgg tgaatgagct gtttacttct tccaatcaaa tcgggttaaa aacagatgtg 1920

acggattatc atattgatca agtatccaat ttagttgagt gtttatctga tgaattttgt 1980

ctggatgaaa aaaaagaatt gtccgagaaa gtcaaacatg cgaagcgact tagtgatgag 2040

cggaatttac ttcaagatcc aaactttaga gggatcaata gacaactaga ccgtggctgg 2100

agaggaagta cggatattac catccaagga ggcgatgacg tattcaaaga gaattacgtt 2160

acgctattgg gtacctttga tgagtgctat ccaacgtatt tatatcaaaa aatagatgag 2220

tcgaaattaa aagcctatac ccgttaccaa ttaagagggt atatcgaaga tagtcaagac 2280

ttagaaatct atttaattcg ctacaatgcc aaacacgaaa cagtaaatgt gccaggtacg 2340

ggttccttat ggccgctttc agccccaagt ccaatcggaa aatgtgccca tcattcccat 2400

catttctcct tggacattga tgttggatgt acagacttaa atgaggactt aggtgtatgg 2460

gtgatattca agattaagac gcaagatggc catgcaagac taggaaatct agaatttctc 2520

gaagagaaac cattagtagg agaagcacta gctcgtgtga aaagagcgga gaaaaaatgg 2580

agagacaaac gtgaaaaatt ggaatgggaa acaaatattg tttataaaga ggcaaaagaa 2640

tctgtagatg ctttatttgt aaactctcaa tatgatagat tacaagcgga taccaacatc 2700

gcgatgattc atgcggcaga taaacgcgtt catagcattc gagaagctta tctgcctgag 2760

ctgtctgtga ttccgggtgt caatgcggct atttttgaag aattagaagg gcgtattttc 2820

actgcattct ccctatatga tgcgagaaat gtcattaaaa atggtgattt taataatggc 2880

ttatcctgct ggaacgtgaa agggcatgta gatgtagaag aacaaaacaa ccaccgttcg 2940

gtccttgttg ttccggaatg ggaagcagaa gtgtcacaag aagttcgtgt ctgtccgggt 3000

cgtggctata tccttcgtgt cacagcgtac aaggagggat atggagaagg ttgcgtaacc 3060

attcatgaga tcgagaacaa tacagacgaa ctgaagttta gcaactgtgt agaagaggaa 3120

gtatatccaa acaacacggt aacgtgtaat gattatactg cgactcaaga agaatatgag 3180

ggtacgtaca cttctcgtaa tcgaggatat gacggagcct atgaaagcaa ttcttctgta 3240

ccagctgatt atgcatcagc ctatgaagaa aaagcatata cagatggacg aagagacaat 3300

ccttgtgaat ctaacagagg atatggggat tacacaccac taccagctgg ctatgtgaca 3360

aaagaattag agtacttccc agaaaccgat aaggtatgga ttgagatcgg agaaacggaa 3420

ggaacattca tcgtggacag cgtggaatta cttcttatgg aggaataa 3468

<210> 4

<211> 1155

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

35 40 45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

50 55 60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

195 200 205

Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

210 215 220

Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

275 280 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

290 295 300

Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305 310 315 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

325 330 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

340 345 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

355 360 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

405 410 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

420 425 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

450 455 460

Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr

465 470 475 480

Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly

485 490 495

Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg

500 505 510

Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg

515 520 525

Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg

530 535 540

Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn

545 550 555 560

Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn

565 570 575

Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn

580 585 590

Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu

595 600 605

Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val

610 615 620

Asn Glu Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val

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Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser

645 650 655

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660 665 670

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Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln

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Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg

740 745 750

Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr

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805 810 815

Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala

820 825 830

Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu

835 840 845

Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg

850 855 860

Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu

865 870 875 880

Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala

885 890 895

Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser

900 905 910

Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn

915 920 925

Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser

930 935 940

Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly

945 950 955 960

Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn

965 970 975

Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser

980 985 990

Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr

995 1000 1005

Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu

1010 1015 1020

Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu

1025 1030 1035

Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr

1040 1045 1050

Ala Thr Gln Glu Glu Tyr Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg

1055 1060 1065

Gly Tyr Asp Gly Ala Tyr Glu Ser Asn Ser Ser Val Pro Ala Asp

1070 1075 1080

Tyr Ala Ser Ala Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Arg Arg

1085 1090 1095

Asp Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro

1100 1105 1110

Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu

1115 1120 1125

Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe

1130 1135 1140

Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu

　　1145 1150 1155

<210> 5

<211> 2718

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 5

agattacaag gtagtgaatt gtgacatgta ttcgttccta tccgatccgt cgtttttgag 60

cactaggtgc ggtcactgtg acgcgtggac ttggcttcgc ccactgccat cgtggaccca 120

cgtcatcagc aagtgtccat atccaccacc cgacccgacg accgcttgcc gtccgatccg 180

tgtgctcccg agggcaagga tggcatttcg ccacgcgaga tatttttcgg tggcctgcac 240

aggccggcag tgcagcggcc aaaacgaggt caggtcagtc acgctgggcc ccgcctcacg 300

ctcccgtcct gctccgggtc ccaacaaagc cgtccccggg aggtgctcgt gtgctcgtag 360

cgcggtggcg accccgatgc cccgcatatt ccactgggcg tccgcgccgt cggatgggat 420

caggacggcc gcggcggccc cgcgctcggc tataaagacg ctgcggggga cgcattccct 480

ctccgtgctt tcttagaggt gggttggctt ctcctccccc tccggttcgg gttcgggttc 540

gtgaggttct ccggggttcg ggttcgtggg tgagcggatc gagatggaca acaatcccaa 600

catcaacgag tgcattccct acaactgcct ttccaatccc gaggtggagg tgcttggtgg 660

tgagaggatc gagaccggtt acactcccat cgacatctcc ctttccctta cccagttcct 720

tctttccgag ttcgtgcccg gtgccggttt cgtgcttggt cttgtggaca tcatctgggg 780

catcttcggt ccctcccagt gggacgcctt ccttgtgcag atcgagcagc ttatcaacca 840

gaggatcgag gagttcgcca ggaaccaggc catctccagg cttgagggtc tttccaacct 900

ttaccagatc tacgccgagt ccttcaggga gtgggaggcc gatcccacca atcccgccct 960

tagggaggag atgaggatcc agttcaacga catgaactcc gcccttacca ccgccatccc 1020

actgttcgcc gtgcagaact accaggtgcc actgctgtcc gtgtacgtgc aggccgccaa 1080

ccttcacctt tccgtgctta gggacgtgtc cgtgttcggt cagaggtggg gtttcgacgc 1140

cgccaccatc aactccaggt acaacgacct taccaggctt atcggtaact acaccgacca 1200

cgccgtgagg tggtacaaca ccggtcttga gagggtgtgg ggtcccgact ccagggactg 1260

gatcaggtac aaccagttca ggagggagct tacccttacc gtgcttgaca tcgtgtccct 1320

gttccctaac tacgactcca ggacgtaccc tatcaggacc gtgtcccagc ttaccaggga 1380

gatctacacc aacccagtgc ttgagaactt cgacggttcc ttccgcggtt ccgcccaggg 1440

tatcgagggg tccatcagga gcccacacct tatggacatc cttaactcca tcaccatcta 1500

caccgacgcc caccgcggtg agtactactg gtccggccac cagatcatgg ccagcccagt 1560

gggtttctcc ggtcccgagt tcaccttccc actttacggt accatgggta acgccgctcc 1620

acagcagagg atcgtggccc agcttggtca gggtgtgtac aggacccttt cctccaccct 1680

ttacaggagg cccttcaaca tcggtatcaa caaccagcag ctttccgtgc ttgacggtac 1740

cgagttcgcc tacggtacct cctccaacct tccctccgcc gtgtacagga agtccggtac 1800

cgtggactcc cttgacgaga ttccaccaca gaacaacaac gtgccaccaa ggcagggttt 1860

ctcccacagg ctttcccacg tgtccatgtt caggtccggt ttctccaact cctccgtgtc 1920

catcatcagg gctccaatgt tctcctggat ccacaggtcc gccgagttca acaacatcat 1980

ccccagcagc cagatcaccc agatccccct gaccaagagc accaacctgg gcagcggcac 2040

cagcgtggtg aagggccccg gcttcaccgg cggcgacatc ctgcgccgca ccagccccgg 2100

ccagatcagc accctgcgcg tgaacatcac cgcccccctg agccagcgct accgcgtccg 2160

catccgctac gccagcacca ccaacctgca gttccacacc agcatcgacg gccgccccat 2220

caaccagggc aacttcagcg ccaccatgag cagcggcagc aacctgcaga gcggcagctt 2280

ccgcaccgtg ggcttcacca cccccttcaa cttcagcaac ggcagcagcg tgttcaccct 2340

gagcgcccac gtgttcaaca gcggcaacga ggtgtacatc gaccgcatcg agttcgtgcc 2400

cgccgaggtg accttcgagg ccgagtacga cctggagagg gctcagaagg ccgtgtgagg 2460

tcacccgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 2520

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 2580

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 2640

acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 2700

ctatgttact agatcggg 2718

Claims

1.编码mCry1Ab蛋白的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2.含有权利要求1所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

3.权利要求1所述核酸分子或权利要求2所述表达盒、重组载体或重组微生物的应用，为e1）或e2）或e3）： e1）提高植物抗虫性；e2）制备具有抗虫效果的产品；e3）培育抗虫性提高的转基因植物；所述抗虫性为抗鳞翅目昆虫；所述鳞翅目昆虫为亚洲玉米螟、东方黏虫、棉铃虫或桃蛀螟。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。

5.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗虫性增强；所述植物为玉米；所述鳞翅目昆虫为亚洲玉米螟、东方黏虫、棉铃虫或桃蛀螟。

6.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1所述核酸分子编码的mCry1Ab蛋白的含量，从而增加抗虫性；所述抗虫性为抗鳞翅目昆虫；所述鳞翅目昆虫为亚洲玉米螟、东方黏虫、棉铃虫或桃蛀螟；所述植物为玉米。