CN112980930B

CN112980930B - 转基因玉米2a-7品系特异pcr精准定量检测的引物组以及检测方法

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Publication number: CN112980930B
Application number: CN202110480831.3A
Authority: CN
Inventors: 刘文娟; 宋君; 常丽娟; 梁晋刚; 王东; 赵海铭; 代晓航; 魏超; 熊梅
Original assignee: ANALYSIS AND DETERMINATION CENTER SICHUAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: ANALYSIS AND DETERMINATION CENTER SICHUAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2041-04-30
Also published as: CN112980930A

Abstract

本发明公开了转基因玉米2A‑7品系特异PCR精准定量检测的引物组以及检测方法，本发明属于基因定量检测技术领域。本发明包括2A‑7转化体特异性序列引物组2A‑7F、2A‑7R及其探针2A‑7P，和zSSIIb内标基因特异性序列引物组zSSIIb‑F、zSSIIb‑R及其探针zSSIIb‑P，6条核酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示，对标准品和试样同时进行实时荧光PCR扩增。根据标准样品模板拷贝数与Ct值间的线性关系，分别绘制2A‑7转化体和zSSIIb内标基因的标准曲线，计算待测样品中2A‑7转化体和zSSIIb内标基因的拷贝数，通过计算式C＝n_2A‑7/n_zSSIIb*100％即可算出2A‑7转化体的百分含量C，可将2A‑7品系特异定量PCR检测的检出极限和定量极限分别降至0.05％(100ng DNA中2A‑7转化体为18个拷贝)和0.1％(100ng DNA中2A‑7转化体为36个拷贝)。

Description

转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的引物组以及检测方法

技术领域

本发明属于基因定量检测技术领域，具体涉及转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的引物组以及检测方法。

背景技术

转基因作物商业化以来，总种植面积已累计达到2.5×10⁹hm²。在作物生长过程中，虫害的发生严重危害着其产品品质和产量。通过转基因技术导入抗虫基因可有效降低靶标害虫的数量，在保证作物正常生长的基础上减少杀虫剂的使用。作为中国最重要的粮食及饲料作物之一，国内转基因玉米研发工作进展也较为迅速，目前有多个转基因玉米优良品系进入环境释放阶段，申请商业化种植。

在转基因作物迅猛发展的同时，也伴随着人们对其环境安全和食用安全的关注。因此，研究和制定转基因作物及其产品成分检测标准，对加强转基因作物安全管理，营造良好的转基因作物产业化氛围具有重要意义。

转mCry1Ab和mCry2Ab基因抗虫玉米2A-7由中国农业大学育成，表现出对鳞翅目昆虫侵袭的抗性。目前，尚未有专门的转基因玉米2A-7品系特异定量PCR检测方法，仅有对其定性判断的方法(例如公开号CN112280743A记载的方法)。定性PCR检测技术操作简便、仪器试剂成本低，但存在重复性差、假阳性高等问题。定量PCR方法则具有快速、准确、灵敏、自动化程度高、重现性好、污染少等特点，所以相比定性PCR检测技术来说，更有优势。目前，Taqman探针实时荧光PCR是国际标准中普遍使用的定量方法，国内标准中有部分涉及到定量PCR检测方法，但并不能实现对产品的精确定量，无法满足转mCry1Ab和mCry2Ab基因抗虫玉米2A-7的定量要求。

因此，针对转mCry1Ab和mCry2Ab基因抗虫玉米2A-7，亟需开发一套特异定量PCR精准检测的引物和探针及方法，以便分析2A-7转化体的相对含量。

发明内容

本发明的目的在于提供一组转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的引物组及其检测方法，通过测定2A-7转化体特异性序列(2A-7的外源插入片段3’端与玉米基因组的连接区序列，包括玉米基因组序列及转化载体T-DNA部分序列)和玉米zSSIIb内标基因序列拷贝数及其比值，可分析样品中2A-7转化体的相对含量。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的引物组，包括2A-7转化体特异性序列引物组2A-7F、2A-7R及其探针2A-7P，和zSSIIb内标基因特异性序列引物组zSSIIb-F、zSSIIb-R及其探针zSSIIb-P，6条核酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示：

zSSIIb基因(玉米内源基因)

zSSIIb-F：5’-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3’

zSSIIb-R：5’-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3’

zSSIIb-P：5’-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-3’

扩增片段大小为151bp。

2A-7转化体特异性序列

2A-7F：5’-GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAA-3’

2A-7R：5’-TGCCGGAGAAGACCTCGTT-3’

2A-7P：5’-CCACGCGCATCACCTGCGTC-3’

扩增片段大小为114bp。

注：zSSIIb-P为zSSIIb基因的TaqMan探针，2A-7P为2A-7转化体的TaqMan探针，其5’端标记荧光报告基团(如FAM、HEX等)，3’端标记对应的荧光淬灭基团(如TAMRA、BHQ1等)。

基于上述引物组，本发明还提供了转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测方法，包括如下步骤：

(1)提取标准样品DNA，配置一系列梯度模板拷贝数浓度的标准溶液；

(2)利用2A-7转化体特异性序列引物组2A-7F、2A-7R及其探针2A-7P，和zSSIIb内标基因特异性序列引物组zSSIIb-F、zSSIIb-R及其探针zSSIIb-P，分别对系列标准液分别进行2A-7转化体PCR扩增和zSSIIb基因的PCR扩增操作，测量每组反映的荧光信号值Ct，绘制标准曲线y＝ax+b，其中，y是测试样品的Ct值，a是标准曲线的斜率，x是模板拷贝数以10为底数的对数，b是标准曲线的截距；

(3)提取待测样品的DNA，利用2A-7转化体特异性序列引物组2A-7F、2A-7R及其探针2A-7P，和zSSIIb内标基因特异性序列引物组zSSIIb-F、zSSIIb-R及其探针zSSIIb-P，分别进行2A-7转化体PCR扩增和zSSIIb基因的PCR扩增操作，测量每组反映的荧光信号值Ct，根据步骤(2)中绘制的标准曲线，分别计算待测样品的2A-7转化体、zSSIIb基因的模板拷贝数n_2A-7、n_zSSIIb，待测样品的2A-7转化体的百分含量C通过计算式C＝n_2A-7/n_zSSIIb*100％即可算出。。

作为优选地，步骤(1)中，所述系列标准溶液中至少包含5个浓度梯度，最低浓度不大于18copies/μL，最高浓度不小于7.30×10³copies/μL。

进一步地，配置标准溶液的溶剂为0.1×TE缓冲液或水。

作为优选地，提取DNA的方法采用CTAB法。

作为优选地，所述2A-7转化体PCR扩增体系包括：TagMan反应缓冲液、10μmol/L2A-7F、10μmol/L 2A-7R、10μmol/L 2A-7P、样品DNA、ddH2O，根据TaqMan反应液的浓度确定其体积，并相应调整ddH2O的体积，使其反应体系总体积达到25.0μL。

作为优选地，所述zSSIIb基因的PCR扩增体系包括：TagMan反应缓冲液、10μmol/LzSSIIb-F、10μmol/L zSSIIb-R、10μmol/L zSSIIb-P、样品DNA、ddH2O，根据TaqMan反应液的浓度确定其体积，并相应调整ddH2O的体积，使其反应体系总体积达到25.0μL。。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明根据抗虫转基因玉米2A-7转化体特异性序列(2A-7的外源插入片段3’端与玉米基因组的连接区序列，包括玉米基因组序列及转化载体T-DNA部分序列)和zSSIIb内标基因特异性序列，设计专用的引物和TaqMan荧光探针，对标准品和试样同时进行实时荧光PCR扩增。根据标准样品模板拷贝数与Ct值间的线性关系，分别绘制2A-7转化体和zSSIIb内标基因的标准曲线，计算待测样品中2A-7转化体和zSSIIb内标基因的拷贝数，通过计算式C＝n_2A-7/n_zSSIIb*100％即可算出2A-7转化体的百分含量C，可将2A-7品系特异定量PCR检测的检出极限和定量极限分别降至0.05％(100ng DNA中2A-7转化体为18个拷贝)和0.1％(100ng DNA中2A-7转化体为36个拷贝)。

2、本发明方法检测方式方便快捷，检测结果满足要求。

附图说明

图1为本实施例1第一次标准实验绘制的标准曲线；

图2为本实施例1第二次标准实验绘制的标准曲线；

图3为本实施例1第三次标准实验绘制的标准曲线；

图4为LOD测试扩增曲线图(0.1％含量)；

图5为LOD测试扩增曲线图(0.05％含量)。

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。

实施例1

1、采用CTAB法提取和纯化玉米种子或叶片DNA，具体步骤如下：

(1)将玉米种子或叶片于液氮中充分研磨成粉末，称取0.1g转移至离心管中。

(2)加入1.0mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样。加入10μLα-淀粉酶溶液，10μL RNA酶A溶液，并轻柔混合。65℃温育30min,期间每3～5min颠倒混匀一次。

(3)12000g离心15min。转移上清至一新离心管，加入0.7倍～1倍体积氯仿，充分混合。12000g离心15min。弃上清。

(4)加入0.6倍体积异丙醇、0.1倍体积乙酸钾溶液，轻柔颠倒混匀，室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。

(5)加入500μL 70％乙醇溶液，并颠倒混合数次。12000g离心10min。弃上清。

(6)干燥DNA沉淀，备用。

2、绘制标准曲线：按照上述方法提取并取用2A-7转化体百分含量为100％的标准样品基因组DNA，用水稀释成5个浓度梯度：1.82×10⁴copies/μL、3.04×10³copies/μL、5.07×10²copies/μL、84.44copies/μL和14.07copies/μL，用作绘制2A-7转化体和zSSIIb基因标准曲线的校准样品。

每个标准溶液均分别进行2A-7转化体PCR扩增和zSSIIb基因的PCR扩增操作，均设置3组平行试验取平均值，并重复三次，其中2A-7转化体PCR扩增反应体系如表1：

表1 2A-7转化体PCR反应体系

zSSIIb基因的PCR扩增反应体系如表2；

表2 zSSIIb基因PCR反应体系

PCR扩增反应结束后，将PCR管放在离心机上，500g～3000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中，运行实时荧光PCR反应。反应程序为95℃、10min；95℃、15s，60℃、60s，循环数40；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。可根据仪器和试剂要求对反应参数作适当调整。实时荧光PCR反应结束后，以PCR刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声情况进行调整，设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值，并记录。

根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板拷贝数的对数间的线性关系，按照公式y＝ax+b分别绘制2A-7转化体和zSSIIb基因的标准曲线。其中，y是测试样品的Ct值，a是标准曲线的斜率，x是模板拷贝数以10为底数的对数，b是标准曲线的截距。结果(图1～3)显示，3次试验中，2A-7转化体和内标基因zSSIIb的标准曲线各项参数均符合要求(决定系数R²≥98％、扩增效率90％～110％、斜率≥-3.6且≤-3.1)。

3、进行正确度和精密度测试，测试过程：配置2A-7转化体百分比含量大约为5％、1％和0.1％(按照反应体系中加入100ng DNA样品测算)的样品，测试2A-7检测方法的正确度和精密度。每个样品重复3次试验，每次试验设置3个平行。3次重复测试结果如表3显示，3个已知浓度待测样品的偏差均小于25％，相对标准偏差(RSD)均小于25％，说明2A-7检测方法的正确度与精密度均符合相关标准要求，重复性较好。

表3正确度和精密度测试

4、检出极限(LOD)测试：配置2A-7转化体百分比含量为0.1％和0.05％(按照反应体系中加入100ng DNA样品测算)的样品，进行60次测试。结果(图4和图5)显示，0.1％和0.05％的样品，60次平行反应均有扩增信号，因此估测2A-7检测方法的检测极限(LOD)不高于0.05％(100ng DNA中2A-7转化体为18个拷贝)。

5、定量极限(LOQ)测试：设置0.1％(按照反应体系中加入100ng DNA样品测算)的样品，进行15次定量测试。结果如表4所示，15次测试结果的偏差为10.00％，小于25％；相对标准偏差(RSD)为18.18％，小于25％。因此估测2A-7检测方法的定量极限(LOQ)不高于0.1％(100ng DNA中2A-7转化体为36个拷贝)。

表4检测方法的LOQ测试

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川省农业科学院分析测试中心

<120> 转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的引物组以及检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcccaatcc tttgacatct gc 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgatttctc tcttggtgac agg 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaaagtca gagcgctgca atgca 25

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gattagagtc ccgcaattat acatttaa 28

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgccggagaa gacctcgtt 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccacgcgcat cacctgcgtc 20

Claims

1.转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）提取标准样品DNA，配置一系列模板拷贝数浓度梯度的标准溶液；所述标准溶液中至少包含5个浓度梯度，最低浓度不大于18 copies/μL，最高浓度不小于7.30×10³copies/μL；

（2）利用2A-7转化体特异性序列引物2A-7F、2A-7R及其探针2A-7P和zSSIIb内标基因特异性序列引物zSSIIb-F、zSSIIb-R及其探针zSSIIb-P，分别对标准液分别进行2A-7转化体PCR扩增和zSSIIb基因的PCR扩增操作，测量每组反应的荧光信号值Ct，绘制标准曲线y=ax+b，其中，y是测试样品的Ct值，a是标准曲线的斜率，x是模板拷贝数以10为底数的对数，b是标准曲线的截距；

（3）提取待测样品的DNA，利用2A-7转化体特异性序列引物2A-7F、2A-7R及其探针2A-7P和zSSIIb内标基因特异性序列引物zSSIIb-F、zSSIIb-R及其探针zSSIIb-P，分别进行2A-7转化体PCR扩增和zSSIIb基因的PCR扩增操作，测量每组反应的荧光信号值Ct，根据步骤（2）中绘制的标准曲线，分别计算待测样品的2A-7转化体、zSSIIb基因的模板拷贝数n_2A-7、n_zSSIIb，待测样品的2A-7转化体的百分含量C通过计算式C=n_2A-7/n_zSSIIb*100%即可算出；所述转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的引物组由zSSIIb内标基因特异性序列引物zSSIIb-F、zSSIIb-R及其探针zSSIIb-P和2A-7转化体特异性序列引物2A-7F、2A-7R及其探针2A-7P组成，其核酸序列分别如SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的检测方法，其特征在于，配置标准溶液的溶剂为0.1×TE缓冲液或水。

3.根据权利要求1所述的转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的检测方法，其特征在于，提取DNA的方法为CTAB法。

4.根据权利要求1~3任一项所述的转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的检测方法，其特征在于，所述2A-7转化体的PCR扩增体系包括：反应缓冲液、10 μmol/L 2A-7 F、10 μmol/L 2A-7 R、10 μmol/L 2A-7 P、样品DNA、ddH₂O，根据反应缓冲液的浓度确定其体积，并相应调整ddH₂O的体积，使其反应体系总体积达到25.0 μL。

5.根据权利要求1~4任一项所述的转基因玉米2A-7品系特异PCR精准定量检测的检测方法，其特征在于，所述zSSIIb基因的PCR扩增体系包括：反应缓冲液、10 μmol/L zSSIIb-F、10 μmol/L zSSIIb-R、10 μmol/L zSSIIb- P、样品DNA、ddH₂O，根据反应缓冲液的浓度确定其体积，并相应调整ddH₂O的体积，使其反应体系总体积达到25.0 μL。