CN116555402B - 端粒检测试剂盒和非疾病诊断目的的端粒长度检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及端粒检测试剂盒和非疾病诊断目的的端粒长度检测方法，属于分子生物学和医学检测技术领域。所述试剂盒，包括DNA稀释液、TERT qPCR Mix、端粒qPCR Mix、TERT质粒和端粒质粒。所述方法包括以下步骤：S1)合成TERT引物和端粒引物，S2)制备TERT质粒和端粒质粒的标准品，S3)提取血液基因组DNA，S4)稀释TERT质粒和端粒质粒的标准品，S5)加样进行荧光定量PCR，S6)上机检测计算出端粒和TERT的标准曲线，S7)样品测试后，计算出端粒长度。本发明所述试剂盒和方法操作快速、简便，成本低，测得端粒长度为端粒绝对长度，数据可靠、灵敏度高、实用性强。

Description

端粒检测试剂盒和非疾病诊断目的的端粒长度检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学和医学检测技术领域，具体涉及端粒检测试剂盒和非疾病诊断目的的端粒长度检测方法。
背景技术
端粒位于染色体末端，由上千个DNA 重复序列（TTAGGG）组成，其作用是保持染色体的完整，端粒的长度可以随着细胞分裂次数的增多而逐渐变短，过短的端粒便无法维持基因组的稳定性，最终导致细胞老化、机体衰老。端粒酶由RNA和蛋白质组成，负责延长缩短的端粒，但是一般在生殖细胞和干细胞中端粒酶活性高，而体细胞中无端粒酶活性或活性很低。端粒的长度决定了细胞的寿命，它不仅可作为生物或细胞衰老的生物标志物，还可作为染色体稳定性、端粒酶活性、增殖能力和衰老过程的有用指标。
目前，测量端粒长度的方法主要有：端粒末端限制性片段分析（terminalrestrictionfragment，TRF），定量PCR（qPCR），单链端粒长度分析（single telomerelength analysis，STELA），荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和流式荧光原位杂交（flow cytometry and flow fluorescence in situhybridization，Flow FISH）。
端粒末端限制性片段分析是最经典的方法，被誉为端粒检测长度的“金标准”。该方法的原理是利用端粒序列特异且重复的特性，使用缺乏端粒识别位点的频繁切割限制性内切酶消化基因组DNA，基因组DNA被消化为短片段，端粒DNA不被切割保留为较长的片段，在琼脂糖凝胶上分离不同长度的DNA消化产物，端粒长度由端粒DNA特异的探针通过Southern blotting方法检测。该方法要求基因组DNA完整，DNA降解使得评估的端粒长度不准确，此外，该方法实验周期长，所需DNA样本量大，并对检测较短端粒不敏感，因此，端粒末端限制性片段分析不适于需要精确测定和来源珍贵的样品。
定量PCR法测量端粒长度的主要原理是用特异的引物来扩增端粒，通过收集荧光估算出端粒的总长度（T），用单拷贝基因的引物扩增单拷贝基因得到拷贝数（S），根据T/S比率，估算出每个二倍体基因组中端粒的平均长度。定量PCR与端粒末端限制性片段分析法均具有很好的一致性，以及具有样本要求低等优点，但是定量PCR所得端粒检测结果是相对长度，并非是绝对长度，无法测量短端粒，移液过程中导致误差大，样本之间可变性较大，并且该方法的引物容易产生非特异性的扩增。
单链端粒长度分析是基于PCR技术，以端粒末端突出的富含G的3'单链为模板，退火并连接一个接头到端粒的5'末端，以接头引物和该条染色体上的特异性亚端粒引物扩增单个染色体端粒单链区，扩增产物用Southern blotting分析。由于不是所有染色体末端都有适用于设计亚端粒引物的特异性序列，该方法仅仅适合几个特征性染色体末端。该方法对技术要求高，测定时间长，能检测单个染色体末端端粒长度的微小变化，其结果并不能代表细胞整体端粒长度，因此，该方法不适合分析较长的端粒。
荧光原位杂交用荧光标记的可识别端粒区域的肽核酸探针与分裂中期细胞的变性端粒DNA重复序列杂交，荧光信号可以被荧光显微镜检测，通过软件与已知端粒长度的标准品比对来分析端粒长度。该方法无法检测不能分裂细胞、衰老细胞和高度畸形细胞的端粒长度，并且检测时间较长、操作繁琐、工作量大，要求高灵敏度和高稳定性的显微镜，直接得到的结果是荧光的强度，因此，该方法可能存在较大误差。
流式荧光原位杂交通过荧光标记的特异识别端粒区域的肽核酸探针与固定、打孔的细胞杂交，端粒荧光信号用流式细胞仪分析，与标准品对比获得单个细胞内的整体端粒平均长度。该方法适于具有稳定的有丝分裂间期并且具有完整细胞核的二倍体和核型已知的细胞，该方法对细胞核型高度变异的肿瘤细胞误差非常大，PNA探针会非特异结合细胞胞浆中的物质，需选择完整的细胞核，而不是选择细胞，除此之外，该方法无法检测短端粒的信息，耗时不易操作。
基于以上几种端粒长度测量方法的缺陷，亟需开发一种简便、快速、结果稳定可靠并可测定端粒绝对长度的检测方法或试剂盒。
发明内容
本发明实际解决的技术问题是提供端粒检测试剂盒和非疾病诊断目的的端粒长度检测方法，以克服现有技术中端粒检测方法只能检测端粒的相对长度，并且检测方法步骤繁琐、耗时，成本高，检测技术要求高，最终结果误差较大等缺陷。
本发明所述端粒检测试剂盒和非疾病诊断目的的端粒长度检测方法检测到的是端粒绝对长度，并非端粒的相对长度。
TERT标准质粒和端粒标准质粒的浓度换算
TERT标准质粒：1 ng/μl与copies/μl的换算方式如下（通过SnaGene软件计算出TERT质粒的分子量为5.46×106 Da，Na为阿伏伽德罗常数，一般取值为6.0221×1023/mol）：
1 ng/μl的TERT标准质粒浓度相当于1.1029×108 copies/μl，计算过程如下：
端粒标准质粒：1 ng/μl与copies/μl的换算方式如下（通过SnaGene软件计算出端粒质粒的分子量为1.79×106 Da）：
1 ng/μl的端粒标准质粒浓度相当于3.3647×108 copies/μl，计算过程如下：
1 ng/μl的端粒标准质粒浓度相当于2.8263×107 kb/μl，计算过程如下：
为实现本发明的目的，本发明提供非疾病诊断目的的端粒长度检测方法，包括以下步骤，S1)合成TERT引物和端粒引物，S2)制备TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，S3)提取血液基因组DNA，S4)稀释TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，S5)加样进行荧光定量PCR，S6)上机检测计算出端粒标准曲线和TERT标准曲线，S7)样品测试后，计算出端粒长度；
所述TERT的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；
所述TERT的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；
所述端粒的正向引物序列如SEQ ID NO.3所示；
所述端粒的反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。
另一方面，本发明还提供端粒检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：
Buffer1:DNA稀释液；
Buffer2:TERT qPCR Mix；
TERT qPCR Mix包含TERT正向引物、TERT反向引物、SYBR Green qPCR Mix、ddH2O；
所述TERT正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述TERT反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；
Buffer3:端粒qPCR Mix；
端粒qPCR Mix包含端粒正向引物、端粒反向引物、SYBR Green qPCR Mix、ddH2O；
所述端粒正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述端粒反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；
标准品A:TERT质粒；
标准品B:端粒质粒。
所述TERT的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示:
所述端粒的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示，
优选地，所述非疾病诊断目的的端粒长度检测方法，所述步骤S2)制备TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，端粒正向引物与反向引物浓度比采用1:2-1:4的比例；TERT正向引物与反向引物浓度比采用3:1-1:3的比例。所述端粒检测试剂盒，端粒正向引物与反向引物浓度比采用1:2-1:4的比例；TERT正向引物与反向引物浓度比采用3:1-1:3的比例。所述端粒检测试剂盒，所述端粒正向引物浓度为0.05-1μM，所述端粒反向引物浓度为0.15-3μM。
在本发明另一实施例中，所述端粒检测试剂盒和非疾病诊断目的的端粒长度为平均每条染色体端粒长度，计算公式为平均每条染色体端粒长度=端粒总长度÷TERT拷贝数÷2÷46，端粒总长度和TERT拷贝数分别通过端粒标准曲线和TERT标准曲线计算获得。
优选地，所述非疾病诊断目的的端粒长度检测方法，所述端粒正向引物浓度为0.05-1μM，端粒反向引物浓度为0.15-3μM。
优选地，所述荧光定量PCR反应程序中，TERT退火温度为50-60℃，TERT退火时间为5-60s，端粒退火温度为50-60℃，端粒退火时间为10s-5min。
所述的端粒检测试剂盒在生物学年龄评价中的应用。
所述的端粒检测试剂盒在制备端粒长度检测产品中的应用。
本发明所述端粒检测试剂盒和非疾病诊断目的的端粒长度检测方法检测的是端粒的绝对长度。本发明中TERT引物与TERT的引物同义，TERT正向引物和TERT的正向引物同义，TERT反向引物和TERT的反向引物同义，端粒引物与端粒的引物同义，端粒正向引物和端粒的正向引物同义，端粒反向引物和端粒的反向引物同义。
本发明有益的技术效果：
（1）本发明测得的端粒长度为端粒绝对长度，并非是端粒相对长度；
（2）本发明借助特定的TERT质粒制备TERT标准曲线计算细胞数，计算方式准确；
（3）本发明通过特定计算公式计算出端粒长度，计算公式：平均每条染色体端粒长度=端粒总长度÷TERT拷贝数÷2÷46得到最终的端粒长度。
（4）本发明抽血量少，检测试剂盒和非疾病诊断目的的检测方法简洁、快速、准确地反应某一样本在所有样本中的端粒长度，检测结果具有统计学意义，检测灵敏度高、重复性好、结果准确可靠，为端粒长度检测提供一个良好的方法参考。
附图说明
图1为构建好的端粒载体的图谱。
图2为实施例1端粒的扩增曲线图。
图3为实施例1TERT的扩增曲线图。
图4为实施例1端粒的标准曲线图。
图5为实施例1TERT的标准曲线图。
图6为实施例2不同细胞代次的ucMSC端粒绝对长度检测结果图。
图7为实施例2不同细胞代次的nMSC端粒绝对长度检测结果图。
图8为实施例3中25个样本的端粒绝对长度检测结果图。
图9为根据图8所示信息作出的分类统计图，图9中A图代表不同年龄段端粒绝对长度对比图；图9中B图代表20-29岁男女端粒绝对长度对比图；图9中C图代表30-39岁男女端粒绝对长度对比图；图9中D图代表40-60岁男女端粒绝对长度对比图。
图10为对比例1中端粒的扩增曲线图。
图11为对比例1端粒的标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。显然，所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
实验主要包括以下步骤:
1）合成TERT引物和端粒引物
TERT引物和端粒引物序列如下：
TERT引物序列如SEQ ID NO.1-2所示:
端粒引物序列如SEQ ID NO.3-4所示：
2）制备TERT质粒标准品和端粒质粒标准品
一段人工合成的84bp（14个TTAGGG重复序列）的寡核苷酸序列连接到pUCM-T载体上构建标准品，构建好的端粒载体图谱如图1所示，使用大肠杆菌体外扩增端粒质粒标准品。
TERT质粒为TERT pcDNA3.1-3xFlag-C，从长沙瑞英生物科技有限公司购买获得。
将端粒质粒、TERT质粒菌液取100μL加入到5mL LB培养液中过夜培养；收集菌液，按照天根质粒小提试剂盒（DP103-03）说明书提取质粒标准品；取1μL质粒，用核酸微量检测分光光度计测量DNA的浓度和纯度。
引物溶解开盖前先将引物试管4000rpm离心30-60s，加入适量缓冲溶液充分震荡混匀使TERT引物（包括正向引物和反向引物）和端粒引物（包括正向引物和反向引物）工作浓度为10μM，分装到不同离心管中后可置于-20℃长期冻存，后续可直接使用。
该实验中端粒长度的引物较为特殊，端粒正向和反向引物浓度比采用1：3的比例；而TERT正向和反向引物浓度比采用1：1的比例。
3）提取血液基因组DNA
采集新鲜抗凝外周血3mL，上下颠倒防止血液凝固；红细胞裂解：在血液样品中加入3倍体积红细胞裂解液（例如，3ml血液加入9ml红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次，10000rpm离心1分钟，吸去上清，留下白细胞沉淀进行后续操作。
取分离的白细胞，用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304-03）提取淋巴细胞基因组DNA；取1μL DNA，用核酸微量检测分光光度计测量DNA的浓度和纯度；实验前，所有样品取部分基因组DNA将其稀释为2ng/μL待用。在进行qPCR实验时，每个样品取5μL（即10ng的DNA）进行检测。
4）TERT质粒标准品和端粒质粒标准品的稀释
用DNA稀释液（购自生工生物工程（上海）股份有限公司，货号BN39270-0001）将1ng/μl（1.1029×108 copies/μl）的TERT标准质粒按照1:10的梯度稀释7个点，每孔加5μL，输入电脑的理论拷贝数分别为：5.5145×108 copies、5.5145×107 copies、5.5145×106copies、5.5145×105 copies、5.5145×104 copies、5.5145×103 copies、5.5145×102copies。
同理，将4ng/μl端粒标准质粒按照1:5的梯度稀释5个点，每孔加5μL，输入电脑的理论长度分别为：5.6526×108 kb、1.13052×108 kb、2.26104×107 kb、4.52208×106 kb、9.04416×105 kb。
5）加样进行荧光定量PCR（qRT-PCR）反应
TERT的qRT-PCR的反应体系如下：
储存的TERT引物（包括正向引物和反向引物）工作浓度为10μM，在TERT的qRT-PCR的反应体系中TERT正向引物（Primer F)0.6μL，TERT正向引物在总体积20μL中的浓度为10(μM)×0.6(μL)/20(μL)，即TERT正向引物在总体积20μL中的浓度为0.3μM，同理TERT反向引物在总体积20μL中的浓度为0.3μM。
端粒的qRT-PCR 的反应体系如下。
储存的端粒引物（包括正向引物和反向引物）工作浓度为10μM，在端粒的qRT-PCR的反应体系中端粒正向引物（Primer F)0.1μL，端粒正向引物在总体积20μL中的浓度为10(μM)×0.1(μL)/20(μL)，即端粒正向引物在总体积20μL中的浓度为0.05μM，同理端粒反向引物在总体积20μL中的浓度为0.15μM。
同一样品DNA需同时作为TERT和端粒qRT-PCR 的模板，每个重复3个复孔。提前配置除模板外的基因反应混液，需按照实际孔+1孔的标准配置，以防止误差导致最后一孔的反应混液不足，配置好后需充分振荡、离心混匀。加入15μL反应混液与5μL DNA，PCR管离心充分混匀。
6）上机检测
TERT输入电脑的理论拷贝数分别为：5.5145×108 copies、5.5145×107 copies、5.5145×106 copies、5.5145×105 copies、5.5145×104 copies、5.5145×103 copies、5.5145×102 copies。
端粒输入电脑的理论长度分别为：5.6526×108kb、1.13052×108kb、2.26104×107kb、4.52208×106kb、9.04416×105kb。
TERT反应程序如下：
端粒反应程序如下：
7) 制作标准曲线
本次实验通过以上步骤分别得到图2所示的端粒扩增曲线图，图3所示的TERT扩增曲线图。通过端粒扩增曲线的Ct值以及制备标准品的浓度值拟合而成图4所示的端粒标准曲线图，计算获得端粒标准曲线的相关系数为-1.000，端粒标准曲线的扩增效率为106.28%；通过TERT扩增曲线的Ct值以及制备标准品的浓度值拟合而成图5所示的TERT标准曲线图，计算获得TERT标准曲线的相关系数为-0.992，TERT标准曲线的扩增效率为86.81%。根据端粒标准曲线图和TERT标准曲线图分别计算出如下标准曲线计算公式：
端粒总长度标准曲线计算公式：y = -0.2736x+10.994
TERT拷贝数标准曲线计算公式：y=-0.265x+11.676
将样品的Ct值代入标准曲线计算公式可计算端粒总长度和TERT拷贝数。每次实验前需要重新制作标准曲线，因此，每次实验所作出的标曲会有差异。
8）数据分析：
根据电脑Ct值（x）和两条标准曲线计算公式得到端粒总长度（y）和TERT拷贝数（y）；
平均每条染色体端粒长度即为端粒长度，
计算公式为：平均每条染色体端粒长度=端粒总长度÷TERT拷贝数÷2÷46（一个细胞中含46条染色体）。
实施例2
按照实施例1相同的方法进行以下实验步骤，S1)合成TERT引物和端粒引物，S2)制备TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，S3)提取血液基因组DNA，S4)稀释TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，S5)加样进行荧光定量PCR，S6)上机检测计算出端粒标准曲线和TERT标准曲线，S7)样品测试后分别带入端粒和TERT标准曲线计算公式计算出端粒总长度和TERT拷贝数。按照上述方法分别检测了脐带来源间充质干细胞（ucMSC）和脑类器官来源间充质干细胞（nMSC）的端粒长度，图6为脐带来源间充质干细胞（ucMSC）在第4代次、第10代次、第15代次、第20代次（P4、P10、P15、P20）时的端粒绝对长度，图7为脑类器官来源间充质干细胞（nMSC）在第4代次、第10代次、第15代次、第20代次（P4、P10、P15、P20）时的端粒绝对长度，由图6和图7可见，本发明所述非疾病诊断目的的端粒检测方法可以区分出不同代次细胞的端粒的绝对长度，可为科研实验选择细胞提供参考。
实施例3
按照实施例1相同的方法进行以下实验步骤，S1)合成TERT引物和端粒引物，S2)制备TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，S3)提取血液基因组DNA，S4)稀释TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，S5)加样进行荧光定量PCR，S6)上机检测计算出端粒标准曲线和TERT标准曲线，S7)样品测试后分别带入端粒和TERT标准曲线计算公式计算出端粒总长度和TERT拷贝数。按照上述方法检测了25个志愿者的端粒长度，表1为25个样本端粒绝对长度，表1中第一栏每个编号（即每个样本）代表一位志愿者，每个编号（样本）检测3次，表1中端粒绝对长度为3次检测结果计算出的平均值。图8为25个样本的端粒绝对长度检测结果图，图8的检测结果与表1所展示的数据对应，图9为根据图8所示信息作出的分类统计图，图9中A图代表展示不同年龄段（20-29岁、30-39岁、40-49岁、50-60岁）端粒绝对长度对比图；图9中B图代表20-29岁男女端粒绝对长度对比图；图9中C图代表30-39岁中男女端粒绝对长度对比图；图9中D图代表40-60岁男女端粒绝对长度对比图。通过表1、图8和图9所示信息可知，本发明所述非疾病诊断目的的端粒长度检测方法可将样本之间的端粒绝对长度检测出，随着年龄的增大，端粒在逐渐变短，在不同年龄段，女性的平均端粒绝对长度均大于男性平均端粒绝对长度，检测结果具有统计学意义。由上述检测结果表明，本发明所述非疾病诊断目的端粒长度检测方法检测灵敏度高、重复性好、结果准确可靠，为端粒长度检测提供一个良好的方法参考。
实施例4
端粒检测试剂盒，试剂盒包括以下组分：Buffer1:DNA稀释液；Buffer2:TERT qPCRMix；TERT qPCR Mix包含TERT正向引物、TERT反向引物、SYBR Green qPCR Mix、ddH2O；TERT正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；TERT反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；Buffer3:端粒qPCR Mix；端粒qPCR Mix包含端粒正向引物、端粒反向引物、SYBR Green qPCR Mix、ddH2O；端粒正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示；端粒反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；标准品A:TERT质粒；标准品B:端粒质粒。端粒试剂盒中，端粒正向引物与反向引物浓度比采用1:2-1:4的比例；TERT正向引物与反向引物浓度比采用3:1-1:3的比例，端粒正向引物浓度为0.05-1μM，端粒反向引物浓度为0.15-3μM。端粒检测试剂盒在生物学年龄评价或在制备端粒长度检测产品中的应用。
对比例1
S1)合成TERT引物和端粒引物，S2)制备TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，S3)提取血液基因组DNA，S4)稀释TERT质粒标准品，S5)加样进行荧光定量PCR，S6)上机检测等方法同实施例1，区别在于S4)稀释端粒质粒标准品，端粒正向引物和反向引物采用1：1的比例进行稀释，检测后，电脑拟合出端粒扩增曲线图如图10所示，通过端粒扩增曲线的Ct值以及制备标准品的浓度值拟合而成图11所示的端粒标准曲线图，通过图11所示的端粒标准曲线，端粒标准曲线的线性不佳，相关系数为-0.995，扩增效率为132.07%。扩增效率越接近100%扩增效率越好，将实施例1的扩增效率和对比例1的扩增效率对比可知，对比例1的端粒扩增效率差于实施例1的端粒扩增效率，因此，端粒正向引物和反向引物采用1:1的比例进行稀释不利于端粒扩增。

Claims (2)

1.非疾病诊断目的的端粒长度检测方法，其特征在于，包括以下步骤，S1)合成TERT引物和端粒引物，S2)制备TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，S3)提取血液基因组DNA，S4)稀释TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，S5)加样进行荧光定量PCR，S6)上机检测计算出端粒标准曲线和TERT标准曲线，S7)样品测试后，计算出端粒长度；
所述TERT的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；
所述TERT的反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；
所述端粒的正向引物序列如SEQ ID NO.3所示；
所述端粒的反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；
所述端粒长度的计算公式为平均每条染色体端粒长度=端粒总长度÷TERT拷贝数÷2÷46；端粒总长度和TERT拷贝数分别通过端粒标准曲线和TERT标准曲线计算获得；
所述S2)制备TERT质粒标准品和端粒质粒标准品，端粒正向引物与反向引物浓度比采用1:3的比例；TERT正向引物与反向引物浓度比采用1：1的比例；
所述TERT正向引物的浓度为0.3μM，TERT反向引物的浓度为0.3μM；
所述端粒正向引物浓度为0.05μM，端粒反向引物的浓度为0.15μM；
所述荧光定量PCR的反应程序中，TERT退火温度为50-60℃，TERT退火时间为5-60s，端粒退火温度为50-60℃，端粒退火时间为10s-5min。
2.端粒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：
Buffer1:DNA稀释液；
Buffer2:TERT qPCR Mix；
所述TERT qPCR Mix包含TERT正向引物、TERT反向引物、SYBR Green qPCR Mix、ddH2O；
所述TERT正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述TERT反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；
Buffer3:端粒qPCR Mix；
所述端粒qPCR Mix包含端粒正向引物、端粒反向引物、SYBR Green qPCR Mix、ddH2O；
所述端粒正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述端粒反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；
标准品A:TERT质粒；
标准品B:端粒质粒;
所述TERT正向引物的浓度为0.3μM，TERT反向引物的浓度为0.3μM；
所述端粒正向引物浓度为0.05μM，端粒反向引物的浓度为0.15μM。
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