CN114369611A - 一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子及其应用，其空白载体为质粒载体pUC24‑R载体，包含有银鲳鱼细胞色素氧化酶亚基I基因序列，其全碱基序列如SEQ NO.1所示。本发明首次构建了含有银鲳鱼特异基因序列的标准质粒分子pUC‑SA。本发明构建的质粒分子pUC‑SA是一种适用于鱼种属鉴定的标准物质，可用于实时荧光PCR检测银鲳鱼成鱼、苗种、鱼卵、鱼肉及其加工产品等物种鉴定工作中的质量控制，适用性强、稳定性好，对实际样品的检测结果准确，很好的解决了银鲳鱼检测过程中阳性标准物质缺乏的问题，使得检测过程和检测结果有参考，保证鉴定结果的可靠性，填补了银鲳鱼检测领域的技术空白，具有极高的应用价值与市场前景。

Description

一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子及其应用
技术领域
本发明涉及一种银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因标准样品的建立，属于分子生物学领域。
背景技术
银鲳鱼(Pampus argenteus)，俗称车片鱼、白鲳、鲳鱼等，属于硬骨鱼纲，辐鳍亚纲，鲈形目，广泛分布于我国黄渤海、东海、南海，是作为海洋养殖的重要候选品种之一。其肉质鲜美且具有很高的营养价值而深受消费者喜爱，并且人工养殖困难，多数依靠海水捕捞，因此具有较高的经济价值。不少商家为了谋求高额利润，在海产品捕捞、加工处理、市场流通等环节，存在以次充好(如用较为便宜的金鲳代替银鲳)、乱贴标签的现象。因此，对银鲳的快速鉴定非常重要。
目前鉴定鱼类的方法主要有：传统的形态学鉴定分析，蛋白质分析和DNA检测。对传统形态特征的分析要求鉴定人员具有相当的专业背景，由于鱼类的多样性和形态可塑性，结果很容易受到主观判断的影响。尽管蛋白质方法操作方便，但鱼肉样品在处理后可能会变性或降解，因此结果不准确。关于DNA检测的报道很多，包括线粒体DNA(mtDNA)，限制性片段长度多态性(RFLP)，DNA条形码和微卫星。虽然这些方法具有高特异性和灵敏度，但它们存在耗时长、操作复杂、重复性差等缺点。
目前基于实时PCR的检测方法作为一种高效、快速、特异的检测技术，已被广泛用于鉴定肉类物种。然而在实际检测中，阳性标准样品非常关键，其中质粒标准物质是一种含有特异基因片段的重组DNA序列，它具有制备方便、操作简便、稳定性好、纯度高等优点，也被广泛应用在核酸检测标准品中，使得检测过程和检测结果有参考，从而保证鉴定结果的可靠性。目前国内有类似鱼类标准样品，如黑线鳕鱼核酸标准样品，但国内外尚无银鲳鱼核酸标准样品。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒，解决银鲳鱼检测中标准物质缺乏的难题。
一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子pUC-SA，其空白载体为质粒载体pUC24-R载体，包含有银鲳鱼细胞色素氧化酶亚基I基因序列，其全碱基序列如SEQ NO.1所示。
上述标准质粒分子pUC-SA的构建方法，包括如下步骤：
(1)设计PCR特异性引物：根据银鲳鱼细胞色素氧化酶亚基I基因设计PCR特异引物：
SA-1F：5'-CACGAAATCACCACCCACGA-3'；
SA-1R：5'-CCTGTAAGAGGGGGGA-3'；
(2)获取目的片段：利用上述PCR特异性引物扩增目的片段；
(3)质粒的构建：上述得到的PCR产物回收后，通过连接酶连接到pUC24-R载体上；连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α上培养，再提取核酸采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序验证，鉴定为阳性质粒的即为于银鲳鱼特异性质粒分子pUC-SA；
所述步骤(1)中，PCR特异性引物为一对，序列如下：
SA-1F：5'-CACGAAATCACCACCCACGA-3'；
SA-1R：5'-CCTGTAAGAGGGGGGA-3'；
所述步骤(2)中，获取目的片段的具体步骤如下：扩增所用引物为SA-1F和SA-1R，扩增体系为2×Taq Master Mix 12.5μL，10μmol/L SA-1F引物1μL，10μmol/L SA-1R引物1μL，模板DNA 1μL，加水补足至25μL；反应程序为：95℃3min预变性；95℃15s，58℃15s，72℃60s，重复30个循环；72℃5min。
标准质粒分子pUC-SA的性能评估方法，包括以下步骤：
(1)均匀性检测：随机抽样法抽取20管，编号201-220，每管重复检测3次。测试顺序：第1次，201～220；第2次，220～201；第3次，单数201～219，偶数202～220，分别检测质粒的质量与质量浓度，数据通过方差分析及F检验判断管间样品均匀性.
(2)稳定性检测：①运输稳定性：随机抽取样本分别置于-20、0、4、25、37℃条件下，放置2周。每个温度下放置4管，进行质粒电泳观察条带完整性；②储存稳定性：在-20℃条件下，于5、10、15、20和25个月各时间点随机取样4管，每管重复测试3次质量和纯度，数据通过方差分析及F检验判断储存稳定性，并将质粒进行电泳观察条带完整性。
(3)多家单位协作定值：根据《标准物质/标准样品生产者能力认可准则——CNAS/CL04》要求，采用8家单位协作定值的方式，采用紫外分光光度计共同对制定的标准样品进行定制。每家单位随机发放5管样品，每管测量1次，共计40次。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明首次构建了含有银鲳鱼特异基因序列的标准质粒分子pUC-SA。本发明构建的质粒分子pUC-SA可用于实时荧光PCR检测银鲳鱼成鱼、苗种、鱼卵、鱼肉及其加工产品等物种鉴定工作中的质量控制，适用性强、稳定性好，对实际样品的检测结果准确，很好的解决了银鲳鱼检测过程中阳性标准物质缺乏的问题，使得检测过程和检测结果有参考，保证鉴定结果的可靠性，填补了银鲳鱼检测领域的技术空白，具有极高的应用价值与市场前景。
附图说明
图1为银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子pUC-SA均匀性检测qpcr结果图；YC为质粒样本；NC为空白对照。
图2a、图2b、图2c分别为银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子pUC-SA检测运输稳定性0、7、14天qpcr结果图；NC为空白对照。
图3a、图3b、图3c、图3d分别为银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子pUC-SA检测储存稳定性1、2、3、4个月qpcr结果图；YC为质粒样本；NC为空白对照。
图4a、图4b、图4c为银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子pUC-SA在-20℃条件下储存第5个月、10个月、15个月的电泳检测结果图；M为DNA marker；1-4为标准样品。
具体实施方式
实施例1银鲳鱼特异基因序列的标准质粒分子pUC-SA的构建
步骤如下：
(1)经过文献分析，选择细胞色素氧化酶亚基I基因进行同源性分析，确定特异性目标序列；
(2)设计PCR特异性引物：利用GenBank等数据库进行生物信息学分析，根据银鲳鱼细胞色素氧化酶亚基I基因设计PCR特异引物，引物序列如下：
SA-1F：5'-CACGAAATCACCACCCACGA-3'；
SA-1R：5'-CCTGTAAGAGGGGGGA-3'；
(3)获取目的片段：利用上述PCR特异性引物扩增目的片段；采用动物组织DNA提取试剂盒提取银鲳鱼基因组DNA，使用引物SA-1F和SA-1R进行PCR扩增，扩增体系为：2×TaqMaster Mix 12.5μL，10μmol/L SA-1F引物1μL，10μmol/L SA-1R引物1μL，模板DNA 1μL，加水补足至25μL；反应程序为：95℃3min预变性；95℃15s，58℃15s，72℃60s，30个循环；72℃5min。
(4)质粒的构建：上述得到的PCR产物回收后，通过连接酶连接到pUC24-R载体上；连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α，采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序验证，其序列如SEQ NO.1所示。
(5)克隆产物序列比对：转化后选取阳性单菌落过夜培养，提核酸后进行PCR扩增验证是否含有目的基因。当PCR扩增为阳性时，将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，进行测序验证，确认序列结果与银鲳鱼相似度。当序列相似性≥99％时，保菌备用，放置于-80℃。
(5)质粒的提取及纯度测定：根据细菌质粒DNA提取纯化试剂盒提取质粒，测试每份质粒DNA的A260/280比值，以测定质粒纯度，纯度均在1.8～2.0之间。同时对每份质粒进行电泳观察带型，所得电泳结果显示质粒无明显杂带，提示质粒完整性较好。
(6)标准样品的制备：选取纯度和完整性均合格的质粒，将溶液混合在一起，测定质量和纯度。调整浓度至10μg/mL，按2μg/管进行分装，共450管。将制备好的标准样品置于-80℃冰箱保存。
实施例2标准质粒分子pUC-SA纯度的多家单位协作定值
按照国家标准GB/T 24310-2009规定，以及《标准物质/标准样品生产者能力认可准则——CNAS/CL04》要求，测试每份质粒DNA的A260/280比值，以测定质粒纯度，并采用8家单位协作定值的方式，每家单位随机发放5管样品，每管测量1次，共计40次，用紫外分光光度计共同对制定的标准样品进行定制。
表1标准质粒分子pUC-SA紫外光谱扫描数据分析
Figure BDA0003449847250000061
Figure BDA0003449847250000071
紫外光谱扫描数据的均值结果如表1所示，提取后的质粒经过浓度和纯度测定，平均纯度均在1.8～2.0之间，且电泳结果显示质粒无明显杂带，提示其完整性较好。证明标准质粒分子pUC-SA纯度良好，满足实际使用要求。
实施例3标准质粒分子pUC-SA的均匀性检验
按照《JJG 1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，对于制备好的银鲳鱼物种鉴定标准质粒样品，随机抽样法抽取20管，每管重复检测3次，检测质粒的质量与质量浓度，并通过分析变异系数判断管内和管间样品均匀性。
表2银鲳鱼标准质粒分子pUC-SA均匀性检验结果分析
Figure BDA0003449847250000072
Figure BDA0003449847250000081
测得管内的质粒质量与质量浓度的均值如表2所示，质量管间平均值为2.03，变异系数为0.05；纯度管间平均值为1.85，变异系数为0.05。
结果显示质粒的质量和纯度管间变异系数分别为5％和5％，质粒的质量和纯度管内变异系数均小于等于5％，说明样品管内及管间均无显著性差异，样品均匀性符合要求。
实施例4标准质粒分子的pUC-SA稳定性测定结果
(1)运输稳定性检测结果：
由以下可知，质粒储存在于-20、0、4、25、37℃条件下性能均稳定。特别是在37℃条件下质粒性能稳定，说明其满足短期运输需要。银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因核酸标准样品在-20℃条件下运输稳定性检测结果如表3所示。
表3
样本编号 质量/μg 纯度
1 2.02 1.89
2 2.03 1.78
3 1.97 1.87
4 2.07 1.83
平均值 2.07 1.86
变异系数 0.02 0.03
银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因核酸标准样品在0℃条件下运输稳定性检测结果如表4所示。
表4
样本编号 质量/μg 纯度
1 2.08 1.88
2 2.13 1.82
3 2.05 1.89
4 2.00 1.83
平均值 2.02 1.88
变异系数 0.03 0.01
银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因核酸标准样品在4℃条件下运输稳定性检测结果如表5所示。
表5
样本编号 质量/μg 纯度
1 2.04 1.89
2 2.08 1.86
3 2.99 1.88
4 2.01 1.83
平均值 2.28 1.86
变异系数 0.19 0.01
银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因核酸标准样品在25℃条件下运输稳定性检测结果如表6所示。
表6
样本编号 质量/μg 纯度
1 2.11 1.93
2 2.07 1.91
3 2.01 1.86
4 2.06 1.81
平均值 2.06 1.87
变异系数 0.02 0.03
银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因核酸标准样品在37℃条件下运输稳定性检测结果如表7所示。
表7
样本编号 质量/μg 纯度
1 1.99 1.83
2 1.93 1.80
3 1.99 1.88
4 2.04 1.85
平均值 1.99 1.84
变异系数 0.02 0.02
(2)储存稳定性检测结果：
由以下结果可知，质粒在-20℃条件下保存15个月性能均稳定。
银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因核酸标准样品在-20℃条件下储存第5个月的稳定性检测结果如表8所示。
表8
Figure BDA0003449847250000101
银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因核酸标准样品在-20℃条件下储存第10个月的稳定性检测结果如表9所示。
表9
Figure BDA0003449847250000111
银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因核酸标准样品在-20℃条件下储存第15个月的稳定性检测结果如表10所示。
表10
Figure BDA0003449847250000112
。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 640
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cacgaaatca ccacccacga gcagtagaag catccactaa atatttttta atccaagcaa 60
ccgctgccgc catattacta tttgctagcg ctactgaagc ctgaattacc ggagggtgac 120
aaattagtca actaacggac ccattcacta ccactattat tacaattgcc ctagcactca 180
aaattggttt agcaccagct catgcctgaa taccagaagt catacaagga ttagacctcc 240
ccacgggatt aatcatggct acttgacaaa aactagcccc atttacccta ctcattcaaa 300
ttcaccagac agaccaaaac cttttaattt ttctaggcct cacttcaata ctcgtagggg 360
gattagcggg gttaaaccaa acccagctac gaaaaatcat agcttactcc tcaatcgccc 420
acataggatg actagtcctc attatgcaat ttttccaatc aatatccttc cttgccctat 480
tgatctactt tgtaactaca ttttctacct tccttgtatt taaactaaat aaagcaacaa 540
gcatcaatac actagccact tcttgggcca aaactcccgt actaacagcc ctaacacctc 600
ttgttctcct ctcacttggt gggctccccc ctcttacagg 640

Claims (6)

1.一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子pUC-SA，其特征在于含有细胞色素氧化酶亚基I基因片段，其全碱基序列如SEQ NO.1所示。
2.一种权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）设计PCR特异性引物：根据银鲳鱼细胞色素氧化酶亚基I基因片段设计PCR特异引物：
SA-1F：5'-CACGAAATCACCACCCACGA-3'；
SA-1R：5'-CCTGTAAGAGGGGGGA-3'；
（2）获取目的片段：利用上述PCR特异性引物扩增目的片段；
（3）质粒的构建：上述得到的PCR产物回收后，通过连接酶连接到pUC24-R载体上；连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α建立转化感受态细胞，37℃过夜培养，菌落PCR筛选阳性克隆，采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序验证，鉴定为阳性质粒的即为于银鲳鱼特异性质粒分子pUC-SA；
所述步骤(1)中，PCR特异性引物为一对，序列如下：
SA-1F：5'-CACGAAATCACCACCCACGA-3'；
SA-1R：5'- CCTGTAAGAGGGGGGA -3'；
所述步骤(2)中，获取目的片段的步骤如下：扩增所用引物为 SA-1F和SA-1R，扩增体系为2×Taq Master Mix 12.5μL，10μmol/L SA-1F引物1μL，10μmol/L SA-1R引物1μL，模板DNA 1μL，加水补足至 25μL；反应程序为：95℃ 3min预变性；95℃ 15s，58℃ 15s，72℃60s，重复30个循环；72℃ 5 min。
3.权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA的均匀性检测方法，其特征在于包括如下步骤：随机抽样法抽取20管，编号201-220，每管重复检测3次；测试顺序：第1次，201~220；第2次，220~201；第3次，单数201~219，偶数202~220，分别检测质粒的质量与质量浓度，数据通过方差分析及F检验判断管间样品均匀性。
4.权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA的稳定性检测方法，其特征在于包括如下步骤：（1）运输稳定性：随机抽取样本分别置于-20、0、4、25、37℃条件下，放置2周；每个温度下放置4管，进行质粒电泳观察条带完整性，并进行PCR扩增评估其扩增曲线一致性；（2）储存稳定性：在-20℃条件下，于5、10、15、20和25个月各时间点随机取样4管，每管重复测试3次质量和纯度，数据通过方差分析及F检验判断储存稳定性，并将质粒进行电泳观察条带完整性，并进行PCR扩增评估其扩增曲线一致性。
5.权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA实时荧光PCR扩增评估方法，其特征在于包括如下步骤：采用TaqMan 探针实时荧光定量PCR反应体系的配置进行检测，检测体系为：PremixEx Taq PCR Mix 12.5μL，10µmol/L引物各1μL，10µmol/L 探针 0.5µL，质粒分子pUC-SA 2μL，加去离子水补足至 25μL；使用ABI 7500荧光定量PCR仪或QuantStudio™ 6 Flex进行扩增反应，反应程序如下：95℃反应10min；95℃反应15s，60℃反应 60s，45个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号。
6.权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA在定性检测银鲳鱼物种中的应用。
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