CN107365860A - 猪源性成分pcr检测用阳性标准分子、制备及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了猪源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法，该阳性标准分子为能够自主复制的质粒分子，所述质粒分子中包含猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列。本发明制备得到的猪源性成分PCR检测用阳性标准分子，具有制备过程简单、可长时间保存、特异性强以及灵敏度高的优势，该阳性标准分子不需要依赖标准猪材料的供应，可以替代猪基因组DNA用于猪成分的PCR定性、定量测量及分析，保证实验检测结果的可靠性，解决了食品监管工作中缺乏阳性对照的难题。

Description

猪源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种猪源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法。
背景技术
为合理监管肉制品市场，保障消费者的合法权益，有关部门得以准确检测出食品中 相应动物源成分的含量，是加强肉制品检测，防止劣质产品流通的必要举措。
荧光定量聚合酶链式反应(real-time Fluorescent Quantitative PolymeraseChain Reaction ，FQ-PCR)方法是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术的一种，是公认的目前核酸检测的最常用定量检测方法。实时荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入能特异标记PCR产物的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对样品进行定量分析，实现了PCR技术由定性到定量的飞跃。
使用FQ-PCR技术对样品进行检测时需要阳性参考物质作为对照，以保证实验结果的可靠性。因此，阳性参考物质的质量与实验结果的准确性密切相关。现阶段，对于动物源性成分的检测过程中所用的阳性参考物质通常是动物基因组DNA。其中，猪成分检测过程中，提取猪基因组DNA过程复杂，制备非常不方便。由于猪基因组DNA的稳定性不能满足长期贮存及经常性使用的需要，因此，每次进行猪成分检测时，都需要重新制备猪基因组DNA作为阳性参考物质，影响猪成分测量的稳定性。
发明内容
本发明提供了猪源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法，以解决PCR检测过程中阳性参考物质制备复杂、储存困难的问题。
第一方面，本发明提供了一种猪源性成分PCR检测用阳性标准分子，所述阳性标准分子为能够自主复制的质粒分子，所述质粒分子中包含猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列。
第二方面，本发明还提供了一种用以制备第一方面所述阳性标准分子的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别设计猪18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R和猪线粒体COXI基因序列的扩增引物PCOXI-F、PCOXI-R；
猪18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R为：
18S-F ：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；
18S-R ：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；
猪线粒体COXI基因序列的扩增引物PCOXI-F、PCOXI-R为：
PCOXI-F：5'- ACATCTGCCACAATAATCATTG-3'；
PCOXI-R：5'- TCATAGTATTGCGGGTGATCATTT-3'；
（2）以猪基因组为模板基因组，用猪18SrRNA基因序列的扩增引物和猪线粒体COXI基因序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列；
（3）将所述猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列分别连接至pMD18-T载体，得到猪18SrRNA重组子和猪线粒体COXI重组子；
（4）将所述猪18SrRNA重组子和猪线粒体COXI重组子通过限制性内切酶酶切并拼接，得到阳性标准分子。
可选地，所述限制性内切酶为Sal I酶和Pst I酶。
可选地，步骤（2）中，所述PCR扩增的反应体系为10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，模板基因组3μL，Taq酶12.5μL，加ddH2O调整反应体系的体积为25 μL；所述PCR扩增的反应条件为94℃变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行40次循环，得到PCR产物；将所述PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的产物用胶回收试剂盒纯化，得到PCR纯化产物，即为猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列。
可选地，步骤（3）中，将所述猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列分别与pMD18-T载体进行连接，4℃下过夜连接，得到猪18SrRNA重组子18S-pMD18-T和猪线粒体COXI重组子PCOXI-pMD18-T。
可选地，步骤（4）中，将所述猪18SrRNA重组子和猪线粒体COXI重组子分别用Sal I酶和Pst I酶进行双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，将回收片段连接，4度过夜连接，摇床均匀混匀2小时进行质粒转化，得到转化质粒；将所述转化质粒进行凝胶电泳分离，回收大分子质粒条带进行重组克隆质粒筛选回收，得到重组克隆；将所述重组克隆通过常规PCR 验证、Sal I 和Pst I 的酶切验证及酶切产物测序验证，得到的质粒分子18S - PCOXI-pMD18-T即为阳性标准分子。
第三方面，本发明还提供了一种用以检测第一方面所述阳性标准分子特异性的检测方法，具体地，利用特异性检测引物和探针，以所述阳性标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，所述特异性检测引物和探针包括以下两组：
猪18SrRNA基因序列的特异性检测引物18S-F、18S-R和探针18S-P：
18S-F：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；
18S-R：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；
18S-P：5'-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3'
猪线粒体COXI基因序列的特异性检测引物PCOXI-F、PCOXI-R和探针PCOXI-P：
PCOXI-F：5'- ACATCTGCCACAATAATCATTG-3'；
PCOXI-R：5'- TCATAGTATTGCGGGTGATCATTT-3'；
PCOXI-P：5'- ATTAGCTACCCTGCACGGCGGCA-3'。
可选地，所述探针的5'端修饰有荧光报告基团，3'端修饰有荧光淬灭基团。
本发明制备得到的猪源性成分PCR检测用阳性标准分子，具有制备过程简单、可长时间保存、特异性强以及灵敏度高的优势，该阳性标准分子不需要依赖标准猪材料的供应，可以替代猪基因组DNA用于猪成分的PCR定性、定量测量及分析，保证实验检测结果的可靠性，解决了食品监管工作中缺乏阳性对照的难题。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明制备的阳性标准分子的结构示意图；
图2为猪18SrRNA基因序列实时荧光PCR扩增曲线对比图；
图3为猪线粒体COXI基因序列实时荧光PCR扩增曲线对比图；
图4为本发明制备的阳性标准分子的灵敏度检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
1、DNA提取：采用QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit提取猪肉基因组DNA，用分光光度计检测DNA纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8-1.9左右，浓度在10ng/μL以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。
2、引物及特异性探针设计：对GeneBank中搜索猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列，根据获得的猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列，利用Primer 5.0设计两对PCR引物，分别用于扩增猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列，设计两种特异性探针，用以检测最终制备的阳性标准分子是否构建成功。探针的5'端修饰有荧光报告基团，3'端修饰有荧光淬灭基团。引物和探针如下表所示：
表1 用于扩增（特异性检测）猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列的引物及探针
3、猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列的克隆
以猪基因组为模板基因组，利用表1 中的引物对18S-R和18S-P 进行PCR扩增，得到猪18SrRNA基因序列。以猪基因组为模板基因组，利用表1 中的引物对PCOXI-F 和PCOXI-R进行PCR扩增，得到猪线粒体COXI-R基因序列。具体地，PCR扩增的反应体系为10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，模板基因组3μL，Taq酶12.5μL，加ddH2O调整反应体系的体积为25 μL；所述PCR扩增的反应条件为94℃变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行40次循环，得到PCR产物；将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的产物用胶回收试剂盒纯化，得到PCR纯化产物，即为猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列。
将猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列分别与pMD18-T载体进行连接，4℃下过夜连接，得到猪18SrRNA重组子18S-pMD18-T和猪线粒体COXI重组子PCOXI-pMD18-T。
4、阳性标准分子的构建
将猪18SrRNA重组子和猪线粒体COXI重组子分别用Sal I酶和PstI酶进行双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，将回收片段连接，4度过夜连接，摇床均匀混匀2小时进行质粒转化，得到转化质粒；将转化质粒进行凝胶电泳分离，回收大分子质粒条带进行重组克隆质粒筛选回收，得到重组克隆；将重组克隆通过常规PCR 验证、Sal I 和Pst I 的酶切验证及酶切产物测序验证，得到的质粒分子18S - PCOXI-pMD18-T即为阳性标准分子。18S - PCOXI-pMD18-T的具体结构如图1所示。
实施例二
1、阳性标准分子的构建结果
以实施例一制备的18S - PCOXI-pMD18-T为模板，分别用表1中的引物和探针对其进行PCR扩增，并测序验证后发现扩增序列与预期片段一致。结果表明构建的阳性标准分子包含猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列，即阳性标准分子构建成功。
2、阳性标准分子的特异性检测结果
以表1中的引物和探针对猪基因组、阴性样本和阳性标准分子进行实时荧光PCR扩增，扩增曲线结果如图2和图3所示，其中，图2为猪18SrRNA基因序列实时荧光PCR扩增曲线对比图，图3为猪线粒体COXI基因序列实时荧光PCR扩增曲线对比图。结合图2和图3可以看出，针对猪18SrRNA和猪线粒体基因序列所设计的引物和探针，不论对猪基因组还是本发明的阳性标准分子都能检测出阳性信号。猪18SrRNA基因检出的Ct值为猪基因组14个循环，阳性标准分子10个循环，而阴性样本则没有信号；猪线粒体COXI基因检出的Ct值为猪基因组23个循环，阳性标准分子13个循环，而阴性对照则没有信号，同时对30个常见动植物物种进行基因组提取和线粒体COXI基因特异性检测，均没有信号，说明本发明制备的阳性标准分子能被特异性的探针检测到，具有很好的特异性。
3、阳性标准分子的灵敏度检测结果
对阳性标准分子进行十倍梯度稀释（10-1至10-8），采用表1中的探针进行实时荧光PCR检测，反应体系及反应条件同特异性检测相同，每个反应重复3次。建立标准曲线，根据检测扩增效率和相关系数分析阳性标准分子的均匀性。结果如图4所示，表明最低检测值均为达到10-8稀释度，说明本发明制备的阳性标准分子灵敏度较高。
4、阳性标准分子的稳定性检测结果
一般短期稳定性研究4-8周，长期稳定性进行6个月或1年。按ISO导则35，关于稳定性评价的方法对标准物质的长期稳定性进行评价。
将制备的阳性标准分子置于室温25℃条件下，放置六个月，进行实时荧光PCR检测，对获得的Ct值进行统计分析阳性标准分子的稳定性。对每次实时荧光PCR检测每个反应6个重复的Ct值平均值进行相对标准偏差分析结果见表2。结果表明室温条件下阳性标准分子储存一个星期后才开始出现显著性差异，而这种显著性差异在阳性标准分子储存超过一个月后消失。因此推断本发明制备的阳性标准分子热稳定性较好，不易降解，但随着时间延长，整个基因组也表现出不稳定，一个月以后阳性标准分子开始产生明显变化。
表2阳性标准分子的稳定性检测结果
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神权利要求指出。应当理解的是，本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。
核苷酸序列表
<110>山东省食品药品检验研究院
<120>猪源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法
<160>6
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
GCGTCGACAG CCTGAGAAAC GGCTACC 27
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>2
AACTGCAGTG CTGGCACCAG ACTTGC 26
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>3
ACATCTGCCA CAATAATCAT TG 22
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>4
TCATAGTATT GCGGGTGATC ATTT 24
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>5
TGCGCGCCTG CTGCCTTCCT 20
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>6
ATTAGCTACC CTGCACGGCG GCA 23

Claims (8)

1.一种猪源性成分PCR检测用阳性标准分子，其特征在于，所述阳性标准分子为能够自主复制的质粒分子，所述质粒分子中包含猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列。
2.一种如权利要求1所述的阳性标准分子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）分别设计猪18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R和猪线粒体COXI基因序列的扩增引物PCOXI-F、PCOXI-R；
猪18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R为：
18S-F ：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；
18S-R ：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；
猪线粒体COXI基因序列的扩增引物PCOXI-F、PCOXI-R为：
PCOXI-F：5'- ACATCTGCCACAATAATCATTG-3'；
PCOXI-R：5'- TCATAGTATTGCGGGTGATCATTT-3'；
（2）以猪基因组为模板基因组，用猪18SrRNA基因序列的扩增引物和猪线粒体COXI基因序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列；
（3）将所述猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列分别连接至pMD18-T载体，得到猪18SrRNA重组子和猪线粒体COXI重组子；
（4）将所述猪18SrRNA重组子和猪线粒体COXI重组子通过限制性内切酶酶切并拼接，得到阳性标准分子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为Sal I酶和Pst I酶。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增的反应体系为10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，模板基因组3μL，Taq酶12.5μL，加ddH2O调整反应体系的体积为25 μL；所述PCR扩增的反应条件为94℃变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，共进行40次循环，得到PCR产物；
将所述PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的产物用胶回收试剂盒纯化，得到PCR纯化产物，即为猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，将所述猪18SrRNA基因序列和猪线粒体COXI基因序列分别与pMD18-T载体进行连接，4℃下过夜连接，得到猪18SrRNA重组子18S-pMD18-T和猪线粒体COXI重组子PCOXI-pMD18-T。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，将所述猪18SrRNA重组子和猪线粒体COXI重组子分别用Sal I酶和Pst I酶进行双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，将回收片段连接，4度过夜连接，摇床均匀混匀2小时进行质粒转化，得到转化质粒；
将所述转化质粒进行凝胶电泳分离，回收大分子质粒条带进行重组克隆质粒筛选回收，得到重组克隆；
将所述重组克隆通过常规PCR 验证、Sal I 和Pst I 的酶切验证及酶切产物测序验证，得到的质粒分子18S - PCOXI-pMD18-T即为阳性标准分子。
7.一种如权利要求1所述的阳性标准分子的检测方法，其特征在于，利用特异性检测引物和探针，以所述阳性标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，所述特异性检测引物和探针包括以下两组：
猪18SrRNA基因序列的特异性检测引物18S-F、18S-R和探针18S-P：
18S-F：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；
18S-R：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；
18S-P：5'-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3'
猪线粒体COXI基因序列的特异性检测引物PCOXI-F、PCOXI-R和探针PCOXI-P：
PCOXI-F：5'- ACATCTGCCACAATAATCATTG-3'；
PCOXI-R：5'- TCATAGTATTGCGGGTGATCATTT-3'；
PCOXI-P：5'- ATTAGCTACCCTGCACGGCGGCA-3'。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述探针的5'端修饰有荧光报告基团，3'端修饰有荧光淬灭基团。
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