CN105755149A - 基于线粒体coⅰ基因的畜禽肉中猪牛羊源性成分鉴别pcr专用引物对及pcr鉴定方法和试剂盒 - Google Patents
基于线粒体coⅰ基因的畜禽肉中猪牛羊源性成分鉴别pcr专用引物对及pcr鉴定方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于线粒体COⅠ基因的畜禽肉中猪牛羊源性成分PCR专用引物对及鉴定方法与试剂盒，属于食品检测技术领域。根据猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅9种动物COⅠ基因的差异位点，设计猪、牛、羊三种动物特异性引物，见序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。鉴定方法：提取待测物种总DNA，进行PCR扩增。试剂盒，包括SEQ ID NO.1?6。本发明引物均仅对各自物种目标片段进行特异性扩增，不会与其他物种发生反应，方法灵敏度较高，简便快速，能有效鉴别出畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，从而抵御牛、羊肉掺杂掺假现象。同时，将所设计的引物SEQ ID NO.1?6配合相关的试剂可以制成试剂盒，具有良好的工业化生产应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及引用PCR方法快速有效地鉴别畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，适用于上述三种动物肉类源性快速检测与真假鉴别。
背景技术
伴随着我国食品工业的飞速发展，食品掺假方式越来越多，范围越来越广，内容越来越复杂。目前国内市场上肉与肉制品销售中，利用掺杂掺假、以次充好的手段欺骗消费者谋取暴利的事件频频出现。例如部分不法企业为了谋取不当利益，使用猪肉为原料，通过加工处理后冒充牛肉、羊肉进行销售，假冒的牛羊肉卷已多次被媒体曝光，严重损害了消费者利益，扰乱了市场秩序，特别是“牛肉膏”事件的曝光使得肉类掺假进一步成为公众关注的焦点。在这样的实际形势下，传统的以经验为主的感官鉴别方法已不能满足科学监管的需要，迫切需要建立一种科学、准确、快速的食品中肉类成分种属鉴定技术，以便打击肉与肉制品掺假现象，从而维护市场秩序。
近10 多年来，应用分子生物学方法对食品中肉类成分进行鉴别的技术不断发展，其中以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为了肉类种属鉴定的核心方法。PCR技术具有特异性强、操作简便、快速高效等特点，在肉类掺假检测方面具有巨大的应用价值。研究者根据不同物种基因序列中的位点差异，设计物种特异性引物进行PCR扩增，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源，从而对包括肉类在内的食品本质进行确认。而在目标基因的选择方面，线粒体基因组DNA序列具有高度的种属保守性以及物种特异性，且拷贝数多，并具有抗腐蚀、耐高温的特点，因此线粒体DNA多态性位点是设计肉类成分定性鉴别方法的首选靶点。
近年来，国内外根据线粒体编码基因的差异进行食品鉴定的方法不断出现，哺乳动物线粒体编码的细胞色素b基因、12s rRNA基因等均成为设计物种特异性扩增引物的良好靶标。然而，基于线粒体DNA COⅠ基因建立畜禽肉中猪、牛、羊源性成分鉴别的方法还未见相关报道。
针对我国畜禽类肉食品市场贸易中动物源性成分检测的迫切需要，建立能够鉴别大量常见物种包括猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅等动物肉中猪、牛、羊源性成分的PCR方法，对食品进行动物源性成分鉴定，是提高肉品真假鉴别效率的有效途径之一，对打击牛、羊肉假冒伪劣，规范市场秩序，提升食品安全监管能力具有重要意义，有利于肉类产业健康发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种畜禽肉猪、牛、羊源性快速鉴别的PCR专用引物对及PCR方法与试剂盒，利用所设计的引物对组合和方法可快速准确的检测畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，并可对牛、羊肉真伪和掺假进行识别。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明通过比对分析猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅九种动物线粒体DNA COⅠ基因的差异性位点，设计猪、牛、羊的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其它物种没有目的扩增信号。
本发明提供了猪、牛、羊三种动物PCR鉴定用引物体系，由下列引物对组成：
（1）对猪COⅠ基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
正向引物序列为：GTTTTGGTAACTGACTCGTA，
反向引物序列为：CTTCTACTATTGAGGATGCC；
（2）对牛COⅠ基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
正向引物序列为：CCTAACAGCAGTTATACTAATAG，
反向引物序列为：GTGGTTAAGTCTACAGTCAAG；
（3）对羊COⅠ基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
正向引物序列为：CTAACTATTTTCTCCCTACATC，
反向引物序列为：ACAAGGGGGTTTGATAC。
本发明还提供了一种猪肉、牛肉、羊肉的PCR鉴定方法。以样品总DNA为模板，利用所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据1.5%琼脂糖凝胶电泳判定结果，所述样品总DNA模板来自猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅肌肉样品的混合，或上述各物种肌肉样品的一种。
所述PCR扩增实验中特定的反应体系为20 μL体系：2×PCR Mix 10 ul，10 μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，10 μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，模板DNA 1 μL，双蒸灭菌水8.4 μL。
所述PCR扩增实验中特定的反应程序为：先进行95℃ 预变性5 min；然后95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 60 s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
本发明所述鉴定方法中进行琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别扩增出的DNA片段大小，其中
猪物种的引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为129bp，129 bp扩增片段见以下序列的划线部分：
ATGTTCGTAAATCGTTGACTATACTCAACAAACCACAAAGACATCGGCACCCTGTACCTACTATTTGGTGCCTGAGCAGGAATAGTGGGCACTGCCTTGAGCCTACTAATTCGCGCTGAACTAGGTCAGCCCGGAACCCTACTTGGCGATGATCAAATCTATAATGTAATTGTTACAGCTCATGCCTTTGTAATAATCTTCTTTATAGTAATACCCATTATGATTGGGGGTTTTGGTAACTGACTCGTACCGCTAATAATCGGAGCTCCCGATATGGCCTTTCCACGTATAAACAACATAAGTT TCTGACTACTTCCACCATCCTTCCTATTACTACTGGCATCCTCAATAGTAGAAGCCGGGGCGGGTACTGGATGAACCGTATACCCACCTTTAGCTGGAAACTTAGCCCATGCAGGAGCTTCAGTTGATCTAACAATTTTCTCCCTACACCTTGCAGGTGTATCATCAATCCTAGGGGCTATTAATTTCATTACCACAATTATTAACATAAAACCTCCCGCAATGTCTCAATACCAAACACCCCTGTTTGTCTGATCAGTACTAATCACAGCCGTACTACTTCTACTATCCCTGCCAGTTCTAGCAGCTGGCATTACTATACTACTGACAGACCGCAACCTGAACACAACCTTTTTTGATCCAGCAGGTGGTGGAGACCCTATCCTTTATCAACACTTGTTCTGATTTTTCGGACACCCAGAAGTATATATTCTCATCTTACCAGGGTTCGGAATAATCTCCCACATTGTAACCTACTATTCAGGTAAAAAAGAACCATTTGGATATATAGGCATAGTATGAGCCATAATGTCCATTGGATTCTTAGGTTTTATCGTATGGGCTCACCACATATTCACCGTAGGAATAGACGTGGATACCCGAGCATACTTTACATCTGCCACAATAATCATTGCTATTCCCACTGGAGTAAAAGTATTTAGTTGATTAGCTACCCTGCACGGCGGCAATATTAAATGATCACCCGCAATACTATGAGCTCTGGGCTTCATCTTCCTATTCACCGTAGGAGGTCTAACGGGCATTGTACTAGCTAACTCCTCCCTAGACATTGTATTACATGATACATATTATGTAGTCGCACACTTCCACTATGTCTTATCTATAGGAGCAGTGTTTGCCATTATAGGGGGCTTTGTTCACTGATTCCCCCTATTCTCCGGGTACACACTCAACCAAGCATGAGCAAAAATTCACTTTGTAATTATATTCGTAGGAGTAAATATAACATTCTTTCCACAACACTTTCTAGGACTATCCGGAATACCTCGACGATACTCCGATTATCCTGACGCATACACAGCATGAAATACTATTTCCTCAATAGGCTCATTCATCTCACTAACAGCAGTGATATTAATAATCTTCATTATCTGAGAAGCATTTGCATCAAAACGAGAAGTATCTGCAGTAGAACTGACAAGCACAAACCTAGAATGACTACACGGATGTCCTCCTCCCTATCACACATTTGAAGAACCAACATATATCAACCTAAAATAA。
牛物种的引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为84bp，84 bp扩增片段见以下序列的划线部分：
ATGTTCATTAACCGCTGACTATTCTCAACCAACCATAAAGATATTGGTACCCTTTATCTACTATTTGGTGCTTGGGCCGGTATAGTAGGAACAGCTCTAAGCCTTCTAATTCGCGCTGAATTAGGCCAACCCGGAACTCTGCTCGGAGACGACCAAATCTACAACGTAGTTGTAACCGCACACGCATTTGTAATAATCTTCTTCATAGTAATACCAATCATAATTGGAGGATTCGGTAACTGACTTGTTCCCCTAATAATTGGTGCTCCCGATATAGCATTTCCCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTCCCTCCCTCATTCCTACTACTCCTCGCATCCTCTATAGTTGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCTCCCTTAGCAGGCAACCTAGCCCATGCAGGAGCTTCAGTAGATCTAACCATTTTCTCTTTACACTTAGCAGGAGTTTCCTCAATTTTAGGAGCCATCAACTTCATTACAACAATTATCAACATAAAGCCCCCCGCAATGTCACAATACCAAACCCCTCTGTTCGTATGATCCGTAATAATTACCGCCGTACTACTACTACTCTCGCTCCCTGTATTAGCAGCCGGCATCACAATGCTATTAACAGACCGGAACCTAAATACAACCTTCTTCGACCCGGCAGGAGGAGGAGACCCTATTCTATATCAACACTTATTCTGATTCTTTGGACACCCCGAAGTCTATATTTTAATCTTACCTGGGTTTGGAATAATCTCTCATATCGTGACCTACTACTCAGGAAAAAAAGAACCATTCGGATATATGGGAATAGTTTGGGCTATAATGTCAATCGGATTTCTAGGTTTCATCGTATGAGCCCACCATATATTCACTGTCGGAATAGACGTCGACACACGAGCCTACTTCACATCAGCCACTATAATTATTGCTATTCCAACCGGGGTAAAAGTCTTCAGCTGATTGGCAACACTTCATGGAGGTAATATCAAATGGTCTCCTGCTATAATGTGAGCCCTAGGCTTTATTTTCTTATTTACAGTAGGGGGTTTAACTGGAATTGTCTTAGCCAACTCTTCCCTCGATATTGTTCTTCACGACACATACTACGTTGTCGCACATTTCCACTATGTTTTATCAATAGGAGCTGTATTTGCTATTATAGGGGGATTTGTTCATTGATTCCCACTATTCTCAGGTTATACTCTCAACGATACATGAGCCAAAATCCACTTCGCAATTATATTTGTAGGCGTCAATATAACCTTCTTCCCACAACACTTTCTAGGACTATCTGGCATGCCTCGACGATACTCCGACTACCCAGATGCATACACAATATGAAATACTATCTCATCAATAGGCTCATTCATTTCCCTAACAGCAGTTATACTAATAGTTTTCATCATCTGAGAAGCATTTGCATCTAAACGAGAAGTCTTGACTGTAGACT TAACCACGACAAATCTAGAATGATTAAACGGATGCCCTCCACCATATCACACATTTGAAGAACCCACCTATGTTAACCTAAAATAA。
羊物种的引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为118bp，118bp扩增片段见以下序列的划线部分：
ATGTTCATCAACCGCTGATTATTTTCAACCAACCACAAAGATATCGGCACCCTTTACCTTCTATTTGGTGCCTGAGCTGGTATAGTAGGAACCGCCTTAAGCCTACTAATTCGCGCCGAACTAGGCCAACCCGGAACTCTACTCGGAGATGACCAAATCTACAACGTAATTGTAACCGCACATGCATTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCTATTATAATCGGTGGATTCGGCAACTGACTAGTTCCTCTGATAATTGGAGCCCCTGATATAGCATTTCCTCGGATAAATAACATAAGCTTTTGACTTCTTCCCCCATCTTTCCTGTTACTCCTAGCATCCTCTATGGTTGAGGCCGGAGCAGGAACAGGTTGAACCGTATACCCTCCTCTAGCAGGCAACCTAGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGATCTAACTATTTTCTCCCTACATCTGGC AGGTGTCTCTTCAATTCTAGGAGCCATTAATTTTATTACAACTATTATTAATATAAAACCCCCTGCGATGTCACAGT ATCAAACCCCCTTGTTTGTATGATCTGTACTAATTACTGCCGTACTTCTCCTTCTCTCACTTCCTGTATTAGCAGCTGGTATCACAATACTACTAACGGACCGAAACCTGAATACAACCTTTTTTGACCCAGCAGGAGGAGGAGACCCTATCCTATATCAACACCTATTCTGATTCTTTGGGCACCCTGAAGTATATATTCTTATTTTACCTGGGTTTGGGATAATCTCCCATATTGTGACCTACTATTCAGGAAAAAAAGAACCATTCGGATATATAGGAATAGTATGAGCCATAATATCAATTGGGTTCCTAGGATTCATTGTATGAGCCCACCATATATTCACAGTCGGAATAGACGTCGATACACGGGCTTACTTCACGTCAGCTACTATAATTATCGCCATCCCAACAGGAGTAAAAGTATTCAGTTGACTAGCAACGCTTCATGGGGGTAATATCAAATGATCTCCTGCCATAATATGAGCCCTAGGTTTCATCTTTCTTTTTACAGTCGGAGGCTTAACTGGAATTGTTCTAGCCAACTCCTCCCTTGACATTGTCCTCCATGACACATATTATGTAGTAGCACATTTCCACTACGTATTATCAATAGGAGCTGTATTTGCTATTATAGGAGGATTTGTACATTGATTTCCCCTATTCTCAGGCTATACTCTCAATGATACATGAGCCAAAATCCACTTTGCAATTATATTTGTAGGTGTTAACATGACTTTCTTTCCACAACATTTCCTAGGACTATCCGGTATACCACGACGATACTCTGATTATCCAGACGCATATACAATATGAAATACTATCTCATCTATAGGCTCATTTATCTCACTAACAGCAGTAATACTAATAATCTTCATCATCTGAGAAGCATTTGCATCTAAACGAGAAGTCCTAACTGTAGACCTAACCACAACAAACCTAGAATGACTAAACGGATGTCCTCCACCATACCACACATTTGAAGAGCCCACATATGTTAACCTAAAATAA。
分别使用猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉以及鹅肉来源的DNA模板，对引物进行特异性验证和比较，三种目标肉类均在设计位置观察到特异性条带，未见明显非特异性扩增。
将猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉以及鹅肉来源的DNA模板以及双蒸灭菌水按照1：1：1：1：1：1：1：1：1：1等比例混合，对引物特异性进行研究，三种目标肉类引物仅与对应肉类DNA发生扩增反应，均与其他肉类DNA无交叉反应。
将157.67ng/ul猪肉来源DNA模板原液、141.46ng/ul牛肉来源DNA模板原液以及206.52ng/ul羊肉来源DNA模板原液，分别进行10倍梯度稀释，并进行灵敏度检测。猪、羊目标DNA稀释104倍后，牛目标DNA稀释105倍后，均仍可观察到微弱的特异性扩增，检测灵敏度达到皮克级。
本发明又提供了一种畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定用试剂盒，包括所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ。可以将本发明所述3组引物对以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中所述相关试剂可以为本发明中所述的特定PCR反应体系中除了总DNA模板以外的其他试剂，也可以为其它适用的除样品总DNA模板以外的试剂。此外本发明试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。
本发明的试剂盒可以由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器可以分别装有本发明中各物种的引物对。根据需要该引物可以是冻干形式或者溶于缓冲液中的状态。
本发明所述试剂盒可用于单物种总DNA模板以及多物种混合总DNA模板进行猪肉、牛肉和羊肉源性鉴定。所述试剂盒尤其适用于牛、羊肉掺假判定。
本发明的有益效果是：通过使用本发明的引物对组合，可以有效检测多种畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，检测方法快速简单，准确性高，不仅能为检测牛源性和羊源性食品提供新的方法，而且能够抵御牛羊肉掺假，维护消费者利益；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，为工业化生产及应用提供可能，有较好的应用前景。
附图说明
图1是以本发明所述猪COⅠ基因引物对Ⅰ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图。
图2是以本发明所述牛COⅠ基因引物对Ⅱ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图。
图3是以本发明所述羊COⅠ基因引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图。
图4是以本发明所述引物对Ⅰ灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。
图5是以本发明所述引物对Ⅱ灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。
图6是以本发明所述引物对Ⅲ灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。
图1-3中1-12孔分别表示：1：阴性对照；2：9种畜禽肉混合样；3：羊肉；4：牛肉；5：猪肉；6：兔肉；7：鸽肉；8：鹌鹑肉；9：鸡肉；10：鸭肉；11：鹅肉；12：DL 2000 DNA marker。
图4-6中1-9孔分别表示：1：稀释102倍；2：稀释103倍；3：稀释104倍；4：稀释105倍；5：稀释106倍；6：稀释107倍；7：稀释108倍；8：阴性对照；9：DL 2000 DNA marker。
图1-6中DL 2000 DNA marker为标准核酸分子量标签，该标签自下向上以此为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例所使用的主要材料、试剂与仪器具体如下：
样品：新鲜猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉购于超市和农贸市场。
试剂：离心柱式组织基因组DNA抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；2×PCRMix （南京博尔迪公司）；电泳上样缓冲液等PCR生化反应试剂（宝生物工程（大连）有限公司）；琼脂糖（Promega公司）；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；DNA测序由上海华大基因科技有限公司完成。
仪器和设备：PCR仪（德国EPPENDORF公司）；凝胶成像系统（基因有限公司）；核酸蛋白检测仪（德国EPPENDORF公司）；高速冷冻离心机（日本日立）。
实施例1
各物种肌肉总DNA提取：将新鲜猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉以及鹅肉分别充分搅碎混匀，采用上述离心柱式组织基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，提取好的总DNA样品分别溶于100ul洗脱液TE中，1%琼脂糖凝胶电泳检测，核酸蛋白测定仪测定260nm和280nm处吸光度值，计算DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。
特异性引物的设计：根据GenBank上公布的猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅线粒体DNA COⅠ基因序列，经BLAST比对分析，针对各物种特异性碱基位点利用PrimerPremier5.0软件筛选出猪、牛、羊特异性引物对。各引物如下所述：
对猪COⅠ基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
正向引物序列为：GTTTTGGTAACTGACTCGTA（SEQ ID NO.1），
反向引物序列为：CTTCTACTATTGAGGATGCC（SEQ ID NO.2）；
对牛COⅠ基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
正向引物序列为：CCTAACAGCAGTTATACTAATAG（SEQ ID NO.3），
反向引物序列为：GTGGTTAAGTCTACAGTCAAG（SEQ ID NO.4）；
对羊COⅠ 基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
正向引物序列为：CTAACTATTTTCTCCCTACATC（SEQ ID NO.5），
反向引物序列为：ACAAGGGGGTTTGATAC（SEQ ID NO.6）。
实施例2
以实施例1中各物种总DNA样品为模板：
（1）采用实施例1中的3对引物，分别以猪肉、牛肉、羊肉DNA为模板，以其它动物肌肉DNA为对照，以无核酸的双蒸灭菌水为阴性对照，建立PCR检测体系。
（2）20 μL反应体系的配制：2×PCR Mix 10 ul，10 μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，10 μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，模板1 μL，双蒸灭菌水8.4 μL。
（3）PCR反应程序的制定：先进行95℃ 预变性5 min；然后95℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 60 s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
（4）琼脂糖凝胶电泳：取（4）中所得PCR扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1至图3所示：
其中图1是分别采用9种动物肌肉DNA为模板，以猪线粒体DNA COⅠ基因的引物对Ⅰ作为引物进行PCR扩增所得到的DNA条带。结果显示猪物种特异引物对Ⅰ仅对猪肉DNA 模板特异扩增出129bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图2是分别采用9种动物肌肉DNA为模板，以牛线粒体DNA COⅠ基因的引物对Ⅱ作为引物进行PCR扩增所得到的DNA条带。结果显示牛物种特异引物对Ⅱ仅对牛肉DNA 模板特异扩增出84bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图3是分别采用9种动物肌肉DNA为模板，以羊线粒体DNA COⅠ基因的引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增所得到的DNA条带。结果显示羊物种特异引物对Ⅲ仅对羊肉DNA 模板特异扩增出118bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
通过上述实验及实验结果可知，当猪、牛、羊的各自引物对均分别与九种动物总DNA模板进行PCR实验时，确定该引物仅对其自身物种的总DNA模板有反应，而对其它八个物种的总DNA模板没有反应，从而以单物种DNA模板方式验证了猪、牛、羊三个物种引物对的特异性。
实施例3
以9种动物混合总DNA样品为模板：
（1）混合总DNA样品的处理：将实施例1中9种动物总DNA样品等体积混合，其中每种动物肌肉DNA各占0.1体积，并与0.1体积的双蒸灭菌水混匀，作为混合DNA模板。
（2）分别采用实施例1中的3对引物，以混合DNA为模板，以9种动物肌肉DNA为对照，以无核酸的双蒸灭菌水为阴性对照，建立PCR检测体系。
（3）20 μL反应体系的配制：2×PCR Mix 10 ul，10 μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，10 μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，混合DNA模板1 μL，双蒸灭菌水8.4 μL。
（4）PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例2中的反应程序。
（5）琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程同实施例2中的电泳。
所得凝胶成像结果如图1至图3中的2孔所示。该方法以猪、牛、羊三个物种特异性引物分别与混合总DNA模板进行PCR扩增反应，很好的验证了复杂总DNA模板条件下猪、牛、羊特异性引物的有效性和特异性。所述三种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带。
实施例4
以实施例1中猪、牛、羊肌肉DNA分别按照10倍梯度稀释后为模板，进行灵敏度实验：
（1）DNA模板稀释处理：将157.67ng/ul猪肉来源DNA模板原液、141.46ng/ul牛肉来源DNA模板原液以及 206.52ng/ul羊肉来源DNA模板原液，分别稀释102倍、 103倍、104倍、105、106、107以及108倍。
（2）分别采用实施例1中的3对引物，以不同稀释倍数DNA为模板，建立PCR检测体系。
（3）20 μL反应体系的配制：2×PCR Mix 10 ul，10 μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，10 μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，经稀释处理的DNA模板1 μL，双蒸灭菌水8.4 μL。
（4）PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例2中的反应程序。
（5）琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程同实施例2中的电泳。
所得凝胶成像结果如图4至图6所示。猪、羊目标DNA稀释104倍后，牛目标DNA稀释105倍后，均仍可观察到微弱的特异性扩增，检测灵敏度达到皮克级。
根据上述实施例2和实施例3中所述的PCR反应体系，本发明所述的专用引物对可以配合相关试剂组装成不同组合的试剂盒，可用于畜禽肉中猪、牛、羊源性成分鉴定，尤其适用于牛羊食品的真伪和掺假鉴别。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，再不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种畜禽肉中猪牛羊源性成分PCR鉴定专用引物对，其特征在于：所述专用引物对包括：
（1）对猪COⅠ基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
正向引物序列为：GTTTTGGTAACTGACTCGTA；
反向引物序列为：CTTCTACTATTGAGGATGCC；
（2）对牛COⅠ基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
正向引物序列为：CCTAACAGCAGTTATACTAATAG；
反向引物序列为：GTGGTTAAGTCTACAGTCAAG；
（3）对羊COⅠ基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
正向引物序列为：CTAACTATTTTCTCCCTACATC；
反向引物序列为：ACAAGGGGGTTTGATAC。
2.利用权利要求1所述的PCR鉴定专用引物对进行畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR鉴定方法为：提取待测物种总DNA；将提取的待测物种总DNA样品溶于100ul洗脱液TE中，于-20℃保存备用；以待测物种总DNA为模板，利用权利要求1中所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ分别进行PCR扩增，反应完毕后将PCR产物取出，利用1.5%的低溶点琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别扩增出的DNA片段大小，其中
当引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为129bp，判定待测物种为猪；129bp扩增片段为：
GTTTTGGTAA CTGACTCGTA CCGCTAATAA TCGGAGCTCC CGATATGGCC TTTCCACGTA 60
TAAACAACAT AAGTTTCTGA CTACTTCCAC CATCCTTCCT ATTACTACTG GCATCCTCAA 120
TAGTAGAAG129；
当引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为84bp，判定待测物种为牛；84bp扩增片段为：
CCTAACAGCA GTTATACTAA TAGTTTTCAT CATCTGAGAA GCATTTGCAT CTAAACGAGA 60
AGTCTTGACT GTAGACTTAA CCAC84；
当引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为118bp，判定待测物种为羊；118bp扩增片段为：
CTAACTATTT TCTCCCTACA TCTGGCAGGT GTCTCTTCAA TTCTAGGAGC CATTAATTTT 60
ATTACAACTA TTATTAATAT AAAACCCCCT GCGATGTCAC AGTATCAAAC CCCCTTGT 118。
3.根据权利要求2所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增反应体系为20 μL体系：2×PCR Mix 10 ul，10 μmol/L引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ正向引物0.3μL、10 μmol/L引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ反向引物0.3μL，模板DNA 1 μL，双蒸灭菌水8.4μL。
4.根据权利要求2或3所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增反应程序为：先进行95℃ 预变性5 min；然后95℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求4所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述提取待测样本DNA的方法为：采用离心柱式组织基因组DNA抽提试剂盒进行提取。
6.一种畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ。
7.如权利要求6所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定用试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒用于单物种总DNA模板或多物种总DNA模板进行畜禽肉中猪、牛、羊源性鉴定。
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