CN104928391A - 鉴别4种犬科动物源性成分的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别4种犬科动物源性成分的引物探针组合物，包括一对同时适合狐狸、水貂、貉子和狗的通用引物和狐狸、水貂、貉子、狗4种特异探针，还包括内标和内标探针。本发明还公开了一种试剂盒及多重实时荧光PCR检测方法。本发明通用引物和特异探针灵敏度高、精确度好，检测狐狸、水貂、貉子、狗动物源性时能有效指示假阴性出现，具有准确稳定、操作简单，灵敏度极高，特异性强，通量大等多个优势，为饲料和食品中动物源性成分的鉴定探索了新的途径。

Description

鉴别4种犬科动物源性成分的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别饲料和食品中4种犬科动物源性成分的引物探针组合物及其试剂盒，还涉及采用多重实时荧光PCR检测方法检测这4种犬科动物源性成分的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

饲料和食品安全隐患问题与动物生产、环境污染、和人类健康密切相关，已成为全球性关注的热点问题。2014年，据农业部统计数据，在我国北方河北、山东等地，狐狸、水貂和貉子的年饲养量大约为10000万只。这些动物毛皮由于其保暖性好被用作名贵衣服的布料，但是这些动物的肉类去向不明。据报道这些肉被不法商贩大量低价收购，掺假到价格较高的肉里，最有可能掺入到羊肉、狗肉和驴肉中，经加工制成肉卷、肉串、香肠等流通到市场，另外内脏骨头等下脚料可能掺入到动物饲料原料肉骨粉中。狐狸、貉子、水貂作为皮毛经济动物，养殖过程中有时需要添加激素类饲料，并且要定期注射一些抗生素药品，因此体内常残留超标的激素和抗生素，故这些皮毛动物不能作为人类常用肉类供人食用。这种假冒制品因为激素抗生素超标不仅危害人类健康，也严重损害了消费者的利益。此外，为防止疯牛病、痒病的传播，包括我国在内的欧盟、美国等很多国家先后颁布多个法规，规定禁止在反刍动物饲料中添加以哺乳类动物为原料的动物性饲料产品，以有效防止哺乳动物的病原体从动物传染到别的动物和人类。

在食品和饲料的生产中，各种原料被加工成食品和饲料成品后，食品和饲料的真实属性与标签是否相符一致，已无法从外观对其组成源性进行鉴别，鉴于此尽快建立可靠有效的狐狸、水貂、貉子和狗4种犬科动物源性成分检测方法，对于确保食品和饲料标签真实准确，加强食品和饲料标识管理，改善食品和饲料原料安全，保护人类健康具有重要意义。

目前，饲料和食品中动物源性成分鉴别的主要方法有物理、化学、免疫学和分子生物学方法，其中尤以分子生物学方法最为快速、准确、稳定、高效、灵敏，常采用DNA分子水平的检测方法。DNA水平检测方法与蛋白质水平的检测方法相比，目标DNA比较稳定，不易受到外界环境及加工工艺的影响，而蛋白质在高温加工后构象会改变，不稳定，每个物种不一致，鉴别起来困难，而且DNA提取简单，易操作。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、闭管反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。

鉴于线粒体基因组(mtDNA)结构比较简单、稳定、分子量小，每个细胞中有1000-10000个拷贝，容易从组织中分离提取。现在很多学者研究了mtDNA在动物种属鉴定中的应用，与核DNA分子标记相比，mtDNA具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定容易操作等优势。16SrRNA基因是线粒体基因组中研究较多的基因，为生物所共有，功能相同，既含有保守序列，又含有可变序列其序列变化与进化距离相适应，常用来做物种源性鉴定。基于动物mtDNA的分子标记技术的上述特点，加之多重实时荧光PCR的快速、灵敏、高通量等特点，在动物源性成分鉴别检测中具有广泛的应用前景。

此外，目前对饲料和食品中动物源性的荧光定量PCR检测研究均缺乏阳性扩增内标(IAC)对反应体系进行监控，无法避免由反应抑制因素而造成假阴性结果的产生，导致检测结果不准确。当前，在国际上，添加有外源扩增内标的饲料和食品中动物源性多重荧光定量PCR检测方法还是空白。因此，建立有外源扩增内标的，针对饲料和食品中狐狸、水貂、貉子和狗源性的多重荧光定量PCR检测方法将对饲料安全和食品安全的快速监管具有重要的创新实践意义。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的组合物，该组合物含有灵敏度高、特异性好的引物和探针，能快速鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分。

本发明还提供了含有上述组合物的PCR检测试剂盒，该试剂盒操作方便，不易污染，准确稳定。

本发明还提供了一种多重实时荧光PCR检测方法，该方法快速方便，能快速鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分，且能有效指示假阴性出现，灵敏准确。

为实现上述目的，本发明可以通过以下技术方案来实现：

本发明应用实时荧光定量PCR技术及荧光探针核酸DNA分子标记技术，采用多重多色荧光PCR检测体系，实现了狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成份的定性检测。引物和探针是实现本发明的关键。本发明根据狐狸、水貂、貉子和狗的线粒体16S rRNA基因序列，应用同源分析工具Mega5.0软件进行同源性比对，利用引物设计软件Primer 5.0根据筛选出的核心片段两端相似序列设计一对同时适合狐狸、水貂、貉子和狗的通用引物，使用Primer3.0根据可变区序列设计狐狸、水貂、貉子和狗的4种TaqMan特异探针。使用本发明通用引物和TaqMan特异探针，仅一管PCR反应即可同时检测狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成份。

本发明设计的同时适合狐狸、水貂、貉子和狗的通用引物如下：

上游引物：5'CTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATAC 3'

下游引物:5'TCCGAGGTCACCCCAACCTAAA 3'。

本发明设计的狐狸TaqMan特异探针(简称狐狸特异探针，下同)为：

5'TTAGCCCAAACCCATGAAATCCAAACCCCT 3'。

本发明设计的水貂TaqMan特异探针(简称水貂特异探针，下同)为：

5'CCCATAATAATTTATAAACTCACCTACCAGGTCTAA 3'。

本发明设计的貉子TaqMan特异探针(简称貉子特异探针，下同)为：

5'CTTTAATTACTTAACCCAAATTTATGGCCAA 3'。

本发明设计的狗TaqMan特异探针(简称狗特异探针，下同)为：

5'CTAACCCAAACTTATGGATACTAGATACCTACA 3'。

在PCR检测时，因为多种因素容易出现PCR反应假阴性的现象，为了有效指示假阴性，本发明还设计构建阳性扩增内标(简称内标，下同)及其相应的内标TaqMan探针(简称内标探针，下同)，提高检测的准确性。内标的DNA序列如SEQ ID NO：7所示，为：CTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATACAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTTTTAGGTTGGGGTGACCTCGGA，共107bp。其构建方法为：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，在NCBI中BLAST无与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上下游分别连接上狐狸、水貂、貉子和狗4种犬科动物源性的通用引物序列，从而形成107bp的阳性扩增内标DNA序列。在PCR体系使用时，内标以重组质粒的形式加入PCR体系中，重组质粒为内标的DNA序列插入质粒PMD18-T中形成，也可称之为含有内标DNA的重组质粒，该重组质粒构建方法为：将阳性扩增内标序列委托人工基因合成，合成片段连接到PMD18-T载体上，转化感受态DH5a，质粒提取，经DNA测序验证与目的片段一致，即为内标DNA重组质粒。

上述内标TaqMan探针为：5'AAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTC 3'。

本发明还提供了一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的组合物，该组合物包括上述一对通用引物和上述狐狸、水貂、貉子和狗4种TaqMan特异探针。

进一步的，该组合物还包括上述内标和内标TaqMan探针。其中，所述内标以重组质粒的形式存在，所述重组质粒为上述将内标的DNA序列插入质粒PMD18-T中形成的含有内标DNA的重组质粒。

本发明中，所述狐狸、水貂、貉子和狗4种TaqMan特异探针和内标TaqMan探针的5’端均修饰有报告基团，3’端均修饰有淬灭基团。所述报告基团可以为FAM、JOE、CY3、CY5、ROX等，所述淬灭基团可以为TAMRA、BHQ等。

本发明还提供了一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的PCR检测试剂盒，该试剂盒中包括：a.一对上述通用引物；b.狐狸、水貂、貉子和狗4种TaqMan特异探针；c.含有内标的重组质粒；d.内标TaqMan探针。所述含有内标的重组质粒为内标DNA序列与质粒PMD18-T重组得到的重组质粒。

进一步的，本发明试剂盒中还可以包括2×Premix、Taq酶和双蒸水。

上述试剂盒中，各成分的用量可以参照现有技术中通用的用量规则来加入，例如各引物加入量相同，各探针加入量也相同。

本发明还提供了一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性的多重实时荧光PCR检测方法，该方法包括使用本发明鉴别驴、马、狐狸动物源性的PCR检测试剂盒，鉴别待检样本中是否含有狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的步骤。

上述多重实时荧光定量PCR检测方法中，使用本发明试剂盒能够同时鉴别待检样本中是否含有狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分。

上述多重实时荧光定量PCR检测方法中，具体包括以下步骤：

(1)提取待检样本的基因组DNA，备用；

(2)将提取的基因组DNA加入鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的PCR检测试剂盒中，利用多重实时荧光定量PCR法检测；

(3)收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号鉴别待检样本中是否含有狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分。

上述方法中，可以检测饲料和食品中是否含有这四种动物源性，所述待检样本可以为动物饲料，也可以是动物冷鲜肉、肉类加工制品(如火腿肠、肉卷)等食品。本领域技术人员可以按照现有技术中公开的方法和试剂盒提取待检样本的基因组DNA，该操作是容易实现的。

在PCR检测时，将试剂盒中的引物、探针、内标等各种试剂加入一支荧光定量PCR反应管中，然后加入模板DNA形成荧光定量PCR反应体系，该体系经过PCR扩增即可得到是否含有狐狸、水貂、貉子和狗源性成分，操作简便。

上述方法中，PCR扩增条件为：预变性95℃10min；,95℃10s，58℃35s，在此收集荧光信号，45个循环。

上述方法中，优先选用20μl的PCR扩增体系。

上述方法中，按照以下方式判读是否含有狐狸、水貂、貉子和狗源性成分：

a.当待测样本有水貂、貉子、狐狸和狗的相应荧光信号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct值<35时，则说明待测样本中含有相应的动物源性成分。此种情况下，只要能明显检测出相应的动物源性成分，不管内标是否被检出，都可以判定含有相应的动物源性成分，因为检测样本的浓度高时可能会抑制内标的扩增。

b.当待测样本没有水貂、貉子、狐狸和狗的相应荧光信号检出，仅有内标的荧光信号被检出，且内标荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct值<35时，说明待测样本中没有水貂、貉子、狐狸和狗的动物源性成分。

c.当相应的水貂、貉子、狐狸和狗特异探针没有荧光信号被检出，且内标探针也没有荧光信号被检出时，表示实验失败，需要重新进行实验。

上述方法中，使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应可在5通道的任何型号的荧光定量PCR仪上进行。

与现有的检测技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明基于线粒体基因组DNA设计了适合水貂、貉子、狐狸和狗的通用引物和特异探针，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定容易操作等优势。

2、本发明通过设计人工合成一段外源性内标DNA，在体系中加入内标的特异性探针，内标与靶基因共用一对通用引物，能有效指示假阴性出现，同时降低了多对引物对荧光PCR体系产生干扰的风险。

3、本发明检测水貂、貉子、狐狸和狗四种动物源性成分的5重多色荧光定量PCR反应是在同一管内检测进行的，无需开盖，不易污染，具有准确稳定、操作简单，灵敏度极高，特异性强，通量大等多个优势，为饲料和食品中动物源性成分的鉴定探索了新的途径。

附图说明

图1.为狐狸源性成分特异性扩增曲线，图中只有FAM荧光检出，且Ct值<35，可视为含狐狸成分；

图2.为水貂源性成分特异性扩增曲线，图中只有CY3荧光被检出时，且Ct值<35，可视为含水貂源成分；

图3.为貉子源性成分特异性扩增曲线，图中只有JOE荧光被检出时，且Ct值<35，可视为含貉子成分；

图4.为狗源性成分特异性扩增曲线，图中只有ROX荧光被检出时，且Ct值<35，可视为含狗源成分；

图5.为阳性内标扩增曲线图，图中只有内标CY5荧光被检出时，且Ct值<35，未检出狐狸、水貂、貉子和狗源性成分；

图6.为貉子源性灵敏度检测图，当模板量为0.001ng时，有扩增曲线且Ct值<35，所以本发明貉子源性检的出限为0.001ng；

图7.为狗源性灵敏度检测图，当模板量为0.001ng时，有扩增曲线且Ct值<35，所以本发明狗源性成分的检出限为0.001ng；

图8.为狐狸源性灵敏度检测图，当模板量为0.001ng时，有扩增曲线且Ct值<35，所以本发明狐狸源性的检出限为0.001ng。

图9.为水貂源性灵敏度检测图，当模板量为0.01ng时，有扩增曲线且Ct值<35，当模板量为0.001ng时，有扩增曲线但Ct值＞35，所以本发明水貂源性的检出限为0.01ng。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中，所用实验材料、试剂与仪器如下：

狐狸肉、水貂肉、貉子肉均来自于山东某养殖场，狗肉、生牛肉、生绵羊肉、生猪肉、生山羊肉、生兔肉、生鸭肉、生鸡肉、生鹅肉、生鱼肉、玉米、小麦等购于济南市农贸市场，饲料肉骨粉：鸡肉粉1，鸡肉粉2，鸡肉粉3，鸡肉粉4，鸡肉粉5，猪肉粉，猪水解蛋白粉，鸭粉等来自于某些生产厂家。五香牛肉、五香驴肉、羊肉卷1-4、牛肉卷1-4、火腿肠1-3均购自济南市场。

动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。Taq^TM Hot Star Version热启动酶(HS-Taq)、dNTP、Mg²⁺、DNA分子量MakerDL1000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。通用引物、特异探针和内标探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。DNA测序由山东省农业科学院生物技术研究中心测序中心完成。PMD18-T质粒购自TAKARA公司。

ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品，凝胶成像仪为BIO-RAD公司产品。

实施例1

1、通用引物设计：从NCBI数据库中分别下载狐狸、水貂、貉子和狗的线粒体16S rRNA基因序列，应用同源分析工具Mega5.0软件进行同源性比对，利用引物设计软件Primer 5.0根据筛选出的核心片段两端相似序列设计一对通用引物。

2、设计构建含有内标DNA的重组质粒：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，在NCBI中BLAST后无与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上下游分别连接上狐狸、水貂、貉子和狗4种犬科动物源性的通用引物序列，从而形成107bp的内标DNA序列。将这段内标序列委托人工基因合成，合成片段连接到PMD18-T载体上，转化感受态DH5a，质粒提取，经DNA测序验证与目的片段一致，得到能同时针对狐狸、水貂、貉子和狗4种物种源性检测体系的含有内标DNA的重组质粒，也可称为重组PMD18-T质粒。

3、四种TaqMan特异探针设计：应用同源分析工具Mega5.0软件对狐狸、水貂、貉子和狗的线粒体16SrRNA基因序列和内标DNA序列进行同源性比对，根据可变区序列使用Primer3.0设计狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性的特异探针，以及内标探针。同时，为了后续使用，在每种探针的5’端用FAM,JOE,CY3,CY5，ROX等发光基团进行修饰，在每种探针的3’端用TAMRA、BHQ等淬灭基团进行修饰。

所得的通用引物、探针、内标如下表所示：

4、试剂盒的设计：本试剂盒包括上述一对通用引物，狐狸、水貂、貉子和狗4种TaqMan特异探针，含有内标DNA的重组质粒和内标TaqMan探针。除此之外，还包括一些PCR反应所必须的试剂，例如2×Premix，Taq酶，双蒸水。

上述试剂盒中，各成分的用量可以参照现有技术中公开的用量规则来选择，当试剂盒PCR反应体系为20μl时，体系中各成分含量可以按照以下用量选择：预混物2×Premix(pH值为8.9，镁离子浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM)，HS-Taq酶的用量为1U，通用引物终浓度为0.4-1μM，5种TaqMan探针的终浓度为0.4-1μM，含有内标DNA的重组质粒浓度为1pg/μL。

实施例2检测方法

1、DNA提取：将待测样本50g研磨充分混匀，取50mg进行DNA提取，可用动物组织提取试剂盒提取DNA，也可用经典手提法(参照分子克隆手册动物组织DNA提取方法)。Nanodrop核酸检测仪检测提取DNA浓度和纯度，要求浓度在1-20ng/μL，OD值1.7-1.8之间。

2、待测样品DNA的实时荧光PCR扩增

在PCR反应管中按照下表1的20μL反应体系进行配制，将配制好的PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：扩增程序：95℃预变性10min；95℃10s，58℃35s，在此收集荧光信号，45个循环。

表1

试剂名称	浓度	用量(μL)
			HS-Taq酶	5U/μL	0.2
Premix	2×	10
			通用引物混合物	5μM	2
探针混合物	5μM	2
			内标质控重组质粒	1pg/μl	1
DNA模板	1-20ng/μL	2
			双蒸水		2.8
总体积		20

3、应用荧光定量PCR仪分析软件，分析扩增结果。为了确保检测结果的准确性，在进行实际样品检测时，需要同时进行阴性对照(Negative Control)实验和阳性对照(Positive Control)实验。实验方法如下：

3.1 Negative Control实验

在将待测样本DNA加入PCR反应体系进行多重实时荧光定量PCR检测的同时，进行以ddH₂O替代待测样本DNA的对照实验，其他条件不变，作为阴性对照。阴性对照实验结果显示正常时实验正常进行，显示结果不正常时修正相应的条件后再进行实验。阴性对照实验检测结果判定标准如下表2所示：

表2

3.2 Positive Control实验

在将待测样本DNA加入PCR反应体系进行多重实时荧光定量PCR检测的同时，进行以纯正的水貂、貉子、狐狸和狗肉的DNA替代待测样本DNA的对照实验，其他条件不变，作为阳性对照。阳性对照实验结果显示正常时实验正常进行，显示结果不正常时修正相应的条件后再进行实验。阳性对照实验检测结果判定标准如下表3所示：

表3

3.3 待测样本检测结果判定：

在同时进行的阴性、阳性对照实验结果正常的情况下，实验结果具有可用性，按照以下标准判定扩增结果：

a.当待测样本有水貂、貉子、狐狸和狗的相应荧光信号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct值<35时，都说明待测样本中含有相应的动物源性成分。此种情况下，只要能明显检测出相应的动物源性成分，不管内标是否被检出，都可以判定含有相应的动物源性成分，因为检测样本的浓度高时可能会抑制内标的扩增。

b.当待测样本没有水貂、貉子、狐狸和狗的相应荧光信号检出，仅有内标的荧光信号被检出，且内标荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct值<35时，说明待测样本中没有水貂、貉子、狐狸和狗的动物源性成分。

c.当相应的水貂、貉子、狐狸和狗特异探针没有荧光信号被检出，且内标探针也没有荧光信号被检出时，表示实验失败，需要重新进行实验。

如图1-5所示是按照上述方法进行检测所得的结果。如图1所示，除了内标荧光外，只有FAM荧光检出，且Ct值<35，则可视为含狐狸源性成分。如图2所示，除了内标荧光外，只有CY3荧光检出，且Ct值<35，则可视为含水貂源性成分。如图3所示，除了内标荧光外，只有JOE荧光检出，且Ct值<35，则可视为含貉子源性成分。如图4所示，除了内标荧光外，只有ROX荧光检出，且Ct值<35，则可视为含狗源性成分。如图5所示，只有CY5荧光检出，且Ct值<35，则可视为不含狐狸、水貂、貉子和狗性成分。

实施例3特异性试验

为了验证本发明引物和探针的特异性，进行以下实验：

分别从狐狸肉、水貂肉、貉子肉、狗肉、生牛肉、生绵羊肉、生山羊肉、生猪肉、生兔肉、生鸭肉、生鸡肉、生鹅肉、生鱼肉、玉米、小麦中提取基因组DNA，作为DNA模板，按照上述实施例2的检测方法进行荧光定量PCR检测，以测试引物和探针的特异性。

实验结果见下表4，从表中数据可以看出，狐狸肉、水貂肉、貉子肉和狗肉均得到有效扩增，且Ct值<35，而其他样本没有扩增，可见本发明的引物及探针具有很强的物种特异性。

表4

注：N代表Negative，阴性。

实施例4灵敏度试验

为了验证本发明通用引物和特异探针的灵敏度，进行以下实验：

使用动物组织提取试剂盒提取狐狸肉、水貂肉、貉子肉、狗肉和鸡肉基因组DNA，用紫外分光光度计定量到5ng/μL。因现今市场上很多饲料原料都为鸡肉粉，因此以鸡肉作为背景进行灵敏度实验。实验时，按照下表5的比例分别将狐狸、水貂、貉子或狗的全基因组DNA与鸡的全基因组DNA进行混合，使狐狸、水貂、貉子或狗的全基因组DNA在形成的混合物中的比例满足表5中的浓度梯度。然后将混合好的混合物均分别按照10倍，100倍，1000倍，10000倍的浓度梯度进行稀释，稀释后的混合物按照上述实施例2的方法进行检测，检测结果见图6-9，从图6-8中可以看出本试剂盒均能检出0.001ng的狐狸、貉子或狗的全基因组DNA，但只能检出0.01ng的水貂全基因组DNA(见图9)，因此以最低检出限为准，本发明试剂盒的检出限为0.01ng，即1％。

表5

实施例5检测方法的应用

参照实施例2中的检测方法对市售肉制加工食品、饲料原料肉骨粉进行检测，以验证该方法的使用价值。

检测步骤如下：

1、DNA提取：取待测样本50g研磨充分混匀，取50mg进行DNA提取，可用动物组织提取试剂盒提取DNA，也可用经典手提法(参照分子克隆手册动物组织DNA提取方法)。Nanodrop核酸检测仪检测提取DNA浓度和纯度，要求浓度为1-20ng/μL，OD值1.7-1.8之间。

2、待测样品DNA的实时荧光PCR扩增

在PCR反应管中按照下表的20μL反应体系进行配制，将配制好的PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：扩增程序：95℃预变性10min；95℃10s，58℃35s，在此收集荧光信号，45个循环反应。同时，进行阳性对照实验和阴性对照实验。

20μL反应体系如下：

试剂名称	浓度	用量(μL)
			HS-Taq酶	5U/μL	0.2

Premix	2×	10
			通用引物混合物	5μM	2
探针混合物	5μM	2
			内标质控重组质粒	1pg/μl	1
DNA模板	1-20ng/μL	2
			双蒸水		2.8
总体积		20

3、应用荧光定量PCR仪分析软件，分析扩增结果。阳性对照和阴性对照实验显示结果正常，各种待检样品的扩增结果经判读如下表6所示。从表中可以看出，市售肉质加工制品和饲料中存在掺加狐狸肉、水貂肉和貉子肉的现象，未发现有掺加狗肉的情况。

表6.市售食品和饲料检测结果

注：N代表Negative，阴性。

<110>山东省农业科学院生物技术研究中心

<120>鉴别4种犬科动物源性成分的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光PCR检测方法

<160>8

<210>1

<211>24

<212> DNA

<213>人工合成

<400>1

cttcccgtga agaggcggga atac                                   24

<210>2

<211>22

<212> DNA

<213>人工合成

<400>2

tccgaggtca ccccaaccta aa                                      22

<210>3

<211>30

<212> DNA

<213>人工合成

<400>3

ttagcccaaa cccatgaaat ccaaacccct                               30

<210>4

<211>36

<212> DNA

<213>人工合成

<400>4

cccataataa tttataaact cacctaccag gtctaa                        36

 

<210>5

<211>31

<212> DNA

<213>人工合成

<400>5

ctttaattac ttaacccaaa tttatggcca a                              31

<210>6

<211>33

<212> DNA

<213>人工合成

<400>6

ctaacccaaa cttatggata ctagatacct aca                             33

<210>7

<211>107

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

cttcccgtga agaggcggga atacagcacg ccgtaagctt aacctgacgc tagtaggcaa 60

gtacgctcca ttggtgacct cattttttag gttggggtga cctcgga              107

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

aagtacgctc cattggtgac ctcatttc                                    28

 

Claims (10)

1.一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的组合物，其特征是：包括一对同时适合狐狸、水貂、貉子和狗的通用引物和狐狸、水貂、貉子、狗4种特异探针；所述通用引物和4种特异探针的序列如下：

通用引物：

上游引物：5' CTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATAC 3'；

下游引物：5' TCCGAGGTCACCCCAACCTAAA 3'；

 狐狸特异探针：5' TTAGCCCAAACCCATGAAATCCAAACCCCT 3'；

水貂特异探针：5' CCCATAATAATTTATAAACTCACCTACCAGGTCTAA 3'；

貉子特异探针：5' CTTTAATTACTTAACCCAAATTTATGGCCAA 3'；

狗特异探针：5' CTAACCCAAACTTATGGATACTAGATACCTACA 3'。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征是：还包括内标和内标探针，所述内标的DNA序列如SEQ ID NO：7所示；

所述内标探针为：5' AAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTC 3'。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征是：所述内标以重组质粒的形式存在，所述重组质粒是将内标的DNA序列插入质粒PMD18-T中形成的。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征是：所述狐狸、水貂、貉子、狗4种特异探针和内标探针的5'端均修饰有报告基团，3'端均修饰有淬灭基团。

5.一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的PCR检测试剂盒，其特征是：包括权利要求1-4中任一项所述的鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的组合物。

6.根据权利要求5所述的PCR检测试剂盒，其特征是：还包括2×Premix、Taq酶和双蒸水。

7.一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的多重实时荧光PCR检测方法，其特征是：包括使用权利要求5或6所述的鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的PCR检测试剂盒，鉴别待检样本中是否含有狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的步骤。

8.根据权利要求7所述的多重实时荧光PCR检测方法，其特征是：具体包括以下步骤：

（1）提取待检样本的基因组DNA，备用；

（2）将提取的基因组DNA加入鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的PCR检测试剂盒中，利用多重实时荧光定量PCR法检测；

（3）收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号鉴别待检样本中是否含有狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分。

9.根据权利要求7或8所述的多重实时荧光PCR检测方法，其特征是：所述待检样本为动物冷鲜肉、肉类加工制品或动物饲料；PCR扩增条件为：预变性95℃10min；,95℃10s，58℃ 35s，在此收集荧光信号，45个循环。

10.根据权利要求7或8所述的多重实时荧光PCR检测方法，其特征是：按照以下方式对扩增结果进行判定：

a.当待测样本有水貂、貉子、狐狸和狗的相应荧光信号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct值<35时，则说明待测样本中含有相应的动物源性成分；

b.当待测样本没有水貂、貉子、狐狸和狗的相应荧光信号检出，仅有内标的荧光信号被检出，且内标荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct值<35时，说明待测样本中没有水貂、貉子、狐狸和狗的动物源性成分；

c.当相应的水貂、貉子、狐狸和狗特异探针没有荧光信号被检出，且内标探针也没有荧光信号被检出时，表示实验失败，需要重新进行实验。