CN104531884A - 鉴别阿胶中多种动物源性的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴别阿胶中多种动物源性的引物探针组合物,该组合物特异性好,灵敏度高。本发明还公开了含有该探针和引物的试剂盒,该试剂盒能同时鉴定阿胶中驴、马、牛和猪4种动物源性成分,准确度高、高通量、使用方便,本发明还公开了一种鉴别阿胶中多种动物源性的多重实时荧光定量PCR检测方法,该方法能同时对阿胶中驴、马、牛和猪4种动物成分进行定性检测,既适用于动物皮张类检测,也适用于深加工的阿胶中动物源性检测,方便快捷。

Description

鉴别阿胶中多种动物源性的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别阿胶真伪的方法,具体涉及一种鉴别阿胶中驴、马、猪及牛源性多重来源的引物探针组合物、试剂盒以及多重实时荧光定量PCR检测方法,属于分子生物学技术领域。
背景技术
阿胶在中国有数千年的历史,它是由马科动物驴的去毛之皮经熬制而成的胶状物,作为医疗保健价值广泛,具有补血养血、美容养颜、延年益寿、强筋健骨,增强免疫力等五大功能优势。从产品特征来看,正品阿胶一般为长方形块状,规则平整,大小厚薄均匀。它的表面为棕褐色或棕黑色,平滑有光泽,有纵纹,无气孔、油孔。质硬而脆,一拍即碎,碎片对光照略透明。气微香,味微甜,以棕褐色、光亮、透明、无腥臭、经夏天不软者为佳。砸碎后放入杯中,加沸水适量5分钟左右胶块即可溶化,胶液澄清无异物。除了块状固体阿胶,阿胶产品还包括阿胶口服液、阿胶固元膏、阿胶颗粒、即食阿胶等其他含有阿胶的制品。
作为阿胶原料驴皮,从生物分类学上看,驴(Equus asinus)属于奇蹄目马科驴属,包括非洲野驴、西藏野驴,中亚野驴及家驴等品种,其中中国饲养的家驴主要是:德州驴,凉州驴、云南驴及蒙古驴等众多地方种驴。
然而随着胶类市场的不断发展,随着熬胶原料供应的紧张和原料价格上涨,一些不法分子在利益的驱使下,用马皮、骡子皮、牛皮甚至猪皮等低廉皮张冒充驴皮现象越来越多,给医药保健品市场安全带来巨大隐患。为了取缔和预防假冒伪劣阿胶产品,需要质量监管部门加大执法力度,而首要前提是具备科学可靠的检测方法。
传统的阿胶鉴别方法主要靠感官检测,包括阿胶的色泽,切面纹理,水性,气味或风味等。但感官指标容易带来判断不准确、缺乏足够说服力等情况。
随着分子生物学技术的发展,一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来,DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别,它可以突破依据感官检测的局限性,与传统分析方法相比,更加具有客观性和准确性。以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术已逐步成为了食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性,并使得成分含量的定量溯源成为可能,由于荧光定量整个检测过程为闭管操作,所以有效的减少了实验过程中的污染的危险,目前广泛应用于各个领域。
近年国内有科研机构开展了PCR-RFLP鉴定驴皮等动物皮张,但该方法只适用于动物皮而不适合成品阿胶鉴定,阿胶经过高温高压长时间作用,其DNA含量很少,均已降解为小片段,很难扩增出长片段的PCR产物。也有报道采用荧光定量PCR快速检测阿胶中牛源性,马源性、驴源性或猪源性成分,但都是单重源性的定性鉴定,目前还未见利用多重实时荧光PCR方法定性检测多种动物源性的报道。因此,建立一种利用多重实时荧光PCR方法同时鉴别驴、马、猪及牛源性的定性检测试剂盒将对阿胶及阿胶制品安全的快速监管具有重要的创新性的实践意义。
发明内容
针对现有技术中无法快速检测阿胶中多种动物源性的不足,本发明提供了一种能够同时鉴别阿胶中驴源性、马源性、猪源性及牛源性多种动物源性的引物探针组合物,该引物探针组合物特异性好,灵敏度高,可以实现阿胶中多种动物源性的快速定性鉴别。
本发明还提供了还有该引物探针组合物的试剂盒,该试剂盒使用方便、无污染。
本发明还提供了利用该引物探针组合物鉴别阿胶中驴源性、马源性、猪源性及牛源性成分的多重实时荧光定量PCR检测方法,该方法快速方便、准确度高。
为了达到同时检测阿胶中多种动物源性成分的目的,选择特异性好、灵敏度高的引物和探针是本发明的关键,为了克服多对引物对PCR反应体系带来相互干扰的弊端,本发明尽量采用少的引物。在引物设计方面,根据阿胶深度加工导致DNA高度降解的特点,采用哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)作为分子标记,其原因在于mtDNA在遗传上相对独立,是双链超螺旋DNA大分子,具有基因组小、生物个体内无组织特异性但物种之间具有很高的遗传差异性、相比核基因拷贝数相当高等特点,因此用mtDNA分子标记鉴别动物源性成分与核DNA分子标记相比具有灵敏度高、精确度高、降解小(加工过程mtDNA保持相对完整)、稳定易操作等优势。此外,本发明通过比对驴、马、猪和牛的线粒体DNA序列,根据16srDNA基因保守区创新性的获得猪和牛2种动物共有的一对引物,以及马和驴共有的一对引物,同时在同源性相对低的区域设计上述四种动物的特异性荧光探针(即特异探针),大大减少了由多对引物对PCR反应体系带来的相互干扰。
在以上思路的指引下,本发明获得了2对引物和4种特异探针,通过它们的组合实现了阿胶真伪的快速鉴别,具体技术方案如下:
一种鉴别阿胶中多种动物源性的组合物,包括2对扩增引物和4种特异探针,如下:
第一扩增引物:牛和猪通用的引物
上游引物:5' AAGACGAGAAGACCCTATGGAG 3'
下游引物:5' CTCCGAGGTCACCCCAACCGAA 3'
第二扩增引物:驴和马通用的引物
上游引物:5' TTTCTCCTCGCATAAGCCTATATC 3'
下游引物:5' GTTCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCT 3'
驴特异探针:5'CCAACATACAAACCTAACCCTCAGGGAGTTGG 3'
马特异探针:5'CGCCAACACACAAACCTAACCTTCAGGGACTGGCG 3'
猪特异探针:5'CGGATGGTTAAACAACTCAACCACAAAGGGCATCCG3'
牛特异探针:5'CGGCGGCCCAAAGAGAATAGATTTAACCACCGCCG3'。
 进一步的,为了监测和避免因样本含有PCR抑制物而产生的假阴性结果,该组合物还可引入真核生物18SrRNA基因保守序列设计通用引物及通用探针作为内标质控体系,通用引物定义为内参照引物,通用探针定义为内参照探针,如下:
内参照引物:
上游引物:5’-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3’
下游引物:5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’
内参照探针:5’ TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3’。
进一步的,上述4种特异探针和内参照探针的5’端修饰有报告基团,3’端修饰有淬灭基团。所述报告基团可以为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5等,所述淬灭基团可以为Dabcyl、BHQ1、BHQ2等。
本发明还提供了一种鉴别阿胶中多种动物源性的试剂盒,该试剂盒包括上述鉴别阿胶中成分来源的组合物。
上述试剂盒还包括一些其他成分,例如:PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶、超纯水,加上上述扩增引物、特异探针、内参照引物、内参照探针即可组成完整的试剂盒。
上述试剂盒中,各成分的用量可以参照现有技术中通用的用量规则来加入,例如各引物加入量相同,各探针加入量也相同。
本发明还提供了一种鉴别阿胶中多种动物源性的多重实时荧光定量PCR检测方法,包括:使用上述鉴别阿胶中多种动物源性的试剂盒来鉴别阿胶的中成分来源。
上述多重实时荧光定量PCR检测方法,能够同时鉴别阿胶是否含有驴、马、猪、牛源性成分。
上述实时荧光定量PCR检测方法,包括以下步骤:
(1)提取阿胶的基因组DNA,备用;
(2)将提取的基因组DNA加入试剂盒中,利用多重实时荧光定量PCR法检测;
(3)收集PCR扩增过程中的荧光信号,通过所得扩增曲线鉴定阿胶中是否含有驴、马、猪、牛源性成分。
上述步骤中,本领域技术人员可以按照现有技术中公开的方法和试剂盒提取阿胶的基因组DNA,该操作是容易实现的。优选的,可以采用发明人自行研发的方法提取阿胶的基因组DNA,其方法在专利201410317118.7中有详细的记载,在此不再赘述。
上述多重实时荧光定量PCR检测步骤中,优先选用20μl的PCR扩增体系。
上述多重实时荧光定量PCR检测步骤中,PCR扩增条件为:95℃ 1min; 95℃ 10s,60℃+3℃,35s,在此收集荧光信号,45个循环。
上述多重实时荧光定量PCR检测步骤中,使用所述的试剂盒进行PCR扩增时,扩增阶段反应需在至少5通道型号的荧光定量PCR仪上进行,根据不同型号的定量PCR仪的不同要求可以对标记荧光素进行相应的调整。
本发明有益效果在于:本发明公开了鉴定阿胶真伪的四种动物特异引物及探针及试剂盒,特异性好,灵敏度高,能同时鉴定阿胶中驴、马、牛和猪4种动物源性成分,准确度高、高通量、使用方便。本发明还公开了鉴别阿胶中多种动物源性的荧光定量PCR方法,该方法能同时对阿胶中驴、马、牛和猪4种动物成分进行定性检测,既适用于动物皮张类检测,也适用于深加工的阿胶中动物源性检测,方便快捷,耗费时间短。
附图说明
图1为驴、马、猪和牛4种动物源性序列同源性比对结果,包括引物和探针位置。
图2为马、猪、牛和驴的实时荧光定量PCR扩增曲线图。
其中图2a为以马基因组DNA为模板的扩增曲线;
图2b为以猪基因组DNA为模板的扩增曲线;
图2c为以牛基因组DNA为模板的扩增曲线;
图2d为以驴基因组DNA为模板的扩增曲线。
图3为引物和特异探针特异性验证实时荧光定量PCR扩增曲线图。
其中图3a为猪特异探针的特异扩增曲线图,只有猪基因组DNA被扩增,其它物种均未得到扩增;
其中图3b为牛特异探针的特异扩增曲线图,只有牛基因组DNA被扩增,其它物种均未得到扩增;
其中图3c为马特异探针的特异扩增曲线图,只有马基因组DNA被扩增,其它物种除均未得到扩增;
其中图3d为驴特异探针的特异扩增曲线图,只有驴基因组DNA被扩增,其它物种除均未得到扩增。
图4为引物和特异探针灵敏度验证的实时荧光定量PCR扩增曲线图。
其中图4a为马基因组DNA含量分别为1ng,0.1ng,0.01ng,0.001ng的扩增曲线图;
其中图4b为猪基因组DNA含量分别为1ng,0.1ng,0.01ng,0.001ng的扩增曲线图;
其中图4c为牛基因组DNA含量分别为1ng,0.1ng,0.01ng,0.001ng的扩增曲线图;
其中图4d为驴基因组DNA含量分别为1ng,0.1ng,0.01ng,0.001ng的扩增曲线图。
图5为市售阿胶样品多重实时荧光定量PCR检测图。
其中图5a为1号阿胶样本的扩增曲线图;
图5b为2号阿胶样本的扩增曲线图;
图5c为 3号阿胶样本的扩增曲线图;
图5d为4号阿胶样本的扩增曲线图;
图5e为5号阿胶样本的扩增曲线图。
具体实施方式
以下将参照附图,对本发明的优选实施例进行详细描述。应理解这些实施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
下述实施例中,所用仪器为:ABI7500荧光定量PCR仪、ABI3730xl基因测序仪、TAKARA PCR仪等。所用试剂均购自TAKARA公司,引物及探针合成均由上海英潍捷基公司完成。
实施例1
1、DNA提取:采用专利201410317118.7(一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法)中公开的Chelex-100结合SDS-蛋白酶K消化液加热释放DNA、玻璃奶纯化DNA的方法提取及纯化阿胶产品及生牛皮、猪皮、马皮和驴皮的基因组DNA。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8-1.9左右,浓度在10ng/μl以上,说明DNA纯度较高,浓度适中,符合PCR扩增要求。
2.引物及特异性探针设计:对GeneBank中公布的牛、猪、马、驴4动物线粒体DNA序列信息进行比对,如图1所示,根据驴、马、猪及牛的线粒体序列特点创新性的使用16srDNA基因保守区分别设计猪和牛共用、马和驴共用的引物两对,在同源性相对低的区域设计上述四种动物的特异性荧光探针,大大减少了由多对引物而对PCR反应体系带来的相互干扰,引物和探针如下:
用于快速鉴别阿胶中驴、马、猪及牛源性成分所使用的猪和牛通用的引物为:
上游引物:5'AAGACGAGAAGACCCTATGGAG 3'
下游引物:5'CTCCGAGGTCACCCCAACCGAA 3'
用于快速鉴别阿胶中驴、马、猪及牛源性成分所使用的驴和马通用的引物为:
上游引物:5'TTTCTCCTCGCATAAGCCTATATC 3'
下游引物:5'GTTCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCT 3'
驴特异探针:5'(ROX)CCAACATACAAACCTAACCCTCAGGGAGTTGG(BHQ2) 3'
马特异探针:5'(FAM)CGCCAACACACAAACCTAACCTTCAGGGACTGGCG(BHQ2) 3'
猪特异探针:5'(JOE)CGGATGGTTAAACAACTCAACCACAAAGGGCATCCG(BHQ2) 3'
牛特异探针:5'(CY3)CGGCGGCCCAAAGAGAATAGATTTAACCACCGCCG(BHQ2) 3'
3.试剂盒的设计:试剂盒包括上述2对引物和4种特异探针组成的引物探针组合物,还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶和超纯水,此外,为了防止假阴性结果还引入一对内参照引物和一个内参照探针作为内标质控,如下:
内参照引物:
上游引物:5’-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3’
下游引物:5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’
内参照探针:5’(CY5)TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT(BHQ2)-3’。
各种成分混合在一起组成试剂盒,该实施例中试剂盒PCR反应体系优选为20μl,体系中各成分含量为:预混物(pH值为8.6-8.9,镁离子浓度为2-2.5mM,4种dNTP的终浓度各为250μM),Taq酶的用量为1U,引物(扩增引物和内参照引物)终浓度0.2-0.8μM、探针(特异探针和内参照探针)的终浓度为0.2-1μM。
4.阿胶中牛源性、马源性、驴源性及猪源性成分的定性检测
利用牛皮、马皮、驴皮及猪皮分别熬制成阿胶,对其进行DNA提取。利用试剂盒按照实时荧光定量PCR法分别检测各阿胶的成分来源,PCR反应体系为20μl。
20μl反应体系如下:
试剂名称 浓度 用量(μL)
HS-Taq酶 5U/μL 0.2
预混物 10× 2
 引物混合物 5μM 2
探针混合物 5μM 1
DNA模板 1-20ng/μL 2
超纯水   至 20
使用所述的试剂盒进行PCR扩增时,扩增阶段反应需在5通道型号的荧光定量PCR仪上进行,本实施例所用的荧光定量PCR仪为ABI7500。扩增程序为:95℃ 1min; 95℃ 10s,60℃+3℃,35s,在此收集荧光信号,45个循环。
PCR反应结束后保存文件,打开分析软件,分析实验结果,给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线图。 如图2a所示,当FAM标记的马特异探针有扩增曲线,其余无信号时,表明该样本仅含马源性成分;如图2b所示,当JOE标记的猪特异探针有扩增曲线,其余无信号时,表明该样本仅含猪源性成分;如图2c所示,当CY3标记的牛特异探针有扩增曲线,其余无信号时,表明该样本仅含牛源性成分;如图2d所示,当ROX标记的驴特异探针有扩增曲线,其余无信号时,表明该样本仅含驴源性成分。通过多重荧光定量PCR方法可以快速实现阿胶中动物源性的鉴定。
5.引物和探针特异性验证
利用所设计的引物及探针,分别以牛、猪、马、驴、山羊、绵羊、兔、鱼、鸡、鸭、水貂及狐狸等动物皮张或鲜肉中提取的总基因组DNA为模板,按照上述相同的方法进行实时荧光定量PCR检测,验证引物及探针的特异性。检测结果如图3所示,使用猪和牛通用的引物和猪特异探针进行检测时,只有猪样品出现阳性扩增曲线,其余动物源样品则没有信号,如图3a所示。同样的,使用牛和猪通用的引物和牛特异探针进行检测时,只有牛样品出现阳性扩增曲线,其余动物源样品则没有信号,如图3b所示;使用驴和马通用的引物和马特异探针进行检测时,只有马样品出现阳性扩增曲线,其余动物源样品则没有信号,如图3c所示;使用驴和马通用的引物和驴特异探针进行检测时,只有驴样品出现阳性扩增曲线,其余动物源样品则没有信号,如图3d所示。这说明牛和猪通用的引物、驴和马通用的引物以及猪、牛、马、驴特异探针均具有良好的特异性。
6. 引物和特异探针灵敏度检测
将牛、猪、马及驴基因组DNA分别定量到0.2ng/μl、0.02ng/μl,0.002ng/μl和0.0002ng/μl,每个PCR反应分别加牛、猪、马、驴不同浓度的模板DNA5μl,即DNA含量分别为1ng、0.1ng,0.01ng和0.001ng,按照上述PCR体系进行扩增,马、猪、牛、驴四种动物基因组DNA分别为1ng,0.1ng,0.01ng,0.001ng的扩增曲线如图4a-4d所示,从图中可以看出,本发明检测模板DNA浓度下限为0.002ng/μl。
实施例2
使用实施例1特异性好、灵敏度高的引物和特异探针检测市售5种品牌阿胶,方法为:
1、按照专利201410317118.7公开的方法提取阿胶基因组DNA,作为模板,备用;
2、利用试剂盒配制20μlPCR反应体系,组成如下:
试剂名称 浓度 用量(μL)
HS-Taq酶 5U/μL 0.2
预混物 10× 2
引物混合物 5μM 2
探针混合物 5μM 1
DNA模板 10ng/μL 2
超纯水   至 20
3、进行PCR扩增,扩增程序为:95℃ 1min; 95℃ 10s,60℃+3℃,35s,在此收集荧光信号,45个循环。反应结束后进行结果分析,得到各种市售阿胶产品的扩增曲线。如图5a-5e所示,从图中可以看出,荧光定量PCR法可以快速、直观的得出阿胶中动物成分来源。
4、本发明荧光定量PCR法检测的各种市售阿胶产品的扩增曲线如图5a-5e所示,本方法能同时鉴定驴、马、猪和牛成分,读取更直接,耗费时间少,灵敏度高。同时采用DNA测序法检测各种市售阿胶产品的来源,作为对照,结果显示,当阿胶含有单一动物源时,测序法能够很好的检测出来源,但当阿胶样本中同时含有几种动物源性时,测序法得到的是杂峰,无法确认是什么物种。荧光定量PCR法和DNA测序法所得结果见下表1。
表1  市售品牌阿胶检测结果
样品编号 荧光定量PCR法 测序法(mtDNA)
1 检出马、驴和牛源性成分 检出驴和他物种成分
2 检出驴和牛源性成分 检出驴和他物种成分
3 检出马、驴和牛源性成分 检出马、驴和其他物种成分
4 检出马和驴源性成分 检出马和驴源性成分
5 检出驴源性成分 检出驴源性成分
<110>山东省农业科学院生物技术研究中心
<120>鉴别阿胶中多种动物源性的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光定量PCR检测方法
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<210>4
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GTTCCTTTTACTTCTTTTAA TCTTTCCT                  28
 
<210>5
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<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
CCTGAGAAACGGCTACCAT                             19
 
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>10
CGTGTCAGGATTGGGTAAT                             19
 
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>11
TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT                             20
 

Claims (9)

1.一种鉴别阿胶中多种动物源性的组合物,其特征是,包括2对扩增引物和4种特异探针,如下:
第一扩增引物:牛和猪通用的引物
上游引物:5' AAGACGAGAAGACCCTATGGAG 3'
下游引物:5' CTCCGAGGTCACCCCAACCGAA 3'
第二扩增引物:驴和马通用的引物
上游引物:5' TTTCTCCTCGCATAAGCCTATATC 3'
下游引物:5' GTTCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCT 3'
驴特异探针:5'CCAACATACAAACCTAACCCTCAGGGAGTTGG 3'
马特异探针:5'CGCCAACACACAAACCTAACCTTCAGGGACTGGCG 3'
猪特异探针:5'CGGATGGTTAAACAACTCAACCACAAAGGGCATCCG3'
牛特异探针:5'CGGCGGCCCAAAGAGAATAGATTTAACCACCGCCG3'。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征是:还包括内参照引物和内参照探针,如下:
内参照引物:
上游引物:5’-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3’
下游引物:5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’
内参照探针:5’TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3’。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其特征是:所述特异探针和内参照探针的5’端修饰有报告基团,3’端修饰有淬灭基团。
4.一种鉴别阿胶中多种动物源性的试剂盒,其特征是:包括权利要求1、2或3所述的鉴别阿胶中多种动物源性的组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征是:还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶和超纯水。
6.一种鉴别阿胶中多种动物源性的多重实时荧光定量PCR检测方法,其特征是:使用权利要求4或5中所述的鉴别阿胶中多种动物源性的试剂盒鉴别阿胶的成分来源。
7.根据权利要求6所述的多重实时荧光定量PCR检测方法,其特征是:能够同时鉴别阿胶是否含有驴、马、猪、牛源性成分。
8.根据权利要求6所述的多重实时荧光定量PCR检测方法,其特征是包括以下步骤:
(1)提取阿胶的基因组DNA,备用;
(2)将提取的基因组DNA加入试剂盒中,利用多重实时荧光定量PCR法检测;
(3)收集PCR扩增过程中的荧光信号,通过所得扩增曲线鉴定阿胶中是否含有驴、马、猪、牛源性成分。
9.根据权利要求8所述的多重实时荧光定量PCR检测方法,其特征是:PCR扩增条件为:95℃ 1min; 95℃ 10s,60℃+3℃,35s,在此收集荧光信号,45个循环。
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