CN106636385A - 一组用于驴源性的实时荧光pcr检测的特异性引物和探针 - Google Patents

一组用于驴源性的实时荧光pcr检测的特异性引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明提供一组用于驴源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'‑GAGGAGCAACGGTCATTACAA ‑3'，下游引物：5'‑ GGGCTGTGATGATAAAGGGTAGA ‑3'，探针：5'‑ CCTCCTATCAGCAATCCCCTACATCG‑3'，所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。本发明的引物和探针可对驴制品中的驴源性含量进行定性、定量分析，对判断驴制品和肉骨粉中驴源性含量具有重要意义，本发明将在食品微生物检测领域发挥重要作用。

Description

一组用于驴源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一组用于驴源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针。
背景技术
随着人们生活水平的提高及健康意识的增强，人们越来越关心食品的真伪性，食品中动物源性成分鉴别成为社会关注的焦点之一，消费者对肉制品质量与安全性的要求越来越高。目前，国内市场上在肉及肉制品的生产销售过程中，利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者而牟取暴利的事件频出。这不仅仅涉及食品安全、营养与经济价值等问题，更关系到消费者健康、宗教信仰等问题。因此，对食品中原料肉进行掺假、掺杂检验显得尤为重要。
到目前为止，对疯牛病尚无有效的治疗方法，也没有有效的生前检测手段,一般是通过尸检脑组织，经病理检验而确诊的。由于该病潜伏期长(一般2～8年)，但是一旦症状出现，进行性就加重，一般只需2个星期到6个月，疯牛就以死亡而告终。而疯牛病能否传染给其他种属的动物包括人类，则是人们一直关心的问题。因为过去已经发现当牛食用了羊瘙痒病因子的饲料后，经过一段时间就引发了疯牛病，而其他一些动物食用了这些饲料也会患类似的病。因此，科学家认为疯牛病很可能是通过食用带羊瘙痒病的饲料而获得的。随着饲料及其添加剂国际贸易的飞速发展，饲料产品的多样性和杂合性已经引发了使用动物源性饲料的安全问题，也必将给人类的肉食安全带来挑战。为了防止疯牛病、痒病的传入，医学检测技术所设计的一对引物可以专一地从混合性DNA模板中扩增到马或驴的mtDNA片段，检出限达到0.3%，再通过酶切鉴定就能够准确判定片段是源于马还是源于驴。该方法对马、驴源性成分的检测准确性好、特异性强、灵敏度高，将来必定可以投入到进出口饲料马、驴源性成分检测或者是饲料品种鉴定的工作当中，为明确饲料的成分和来源，为全面防御疯牛病、痒病的传入提供坚实的后盾。
过去用于肉食中物种的鉴别主要依赖于电泳法，免疫法，ELISA等蛋白质分析法。蛋白质鉴定技术现已成功应用于生肉的鉴别，但当肉类经过切碎、混合、蒸煮和熏烤等加工工艺处理后，将改变肉类蛋白质的结构和稳定性，从而破坏物种特有的蛋白质或抗原决定簇，影响其检测的准确性和可靠性。而且，这些方法在实际应用中存在操作复杂、费时、成本高等问题，已不能满足现代肉类安全检测的需求，而PCR技术基于其反应时间短，具有较高灵敏性、特异性成为鉴别加工食品中物种的优先选择。但传统的PCR技术在定量和大批量检测中局限性较大。因此，急于发现一种新的技术可以精确地辨别物种并实现快速、大容量的实时定量检测，而新兴的实时荧光定量PCR技术可以很好的满足要求，正广泛的应用于食品中驴源性成分的检测。
本发明中根据驴线粒体DNA 细胞色素b 基因设计特异性引物和探针，旨在建立一种快速、简便、灵敏、准确、可靠的驴源性成分定性检测的实时荧光PCR 方法，以满足当前相关食品掺假掺杂检验的需求。
发明内容
本发明目的在于设计一组驴源性特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于驴制品和肉骨粉中驴源性成分检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。本发明采用基因克隆技术，将驴源性DNA的cytb基因种内保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有cytb基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据驴源性cytb的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。
本发明的第一个目的是提供一组用于驴源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：
（1）、上游引物：5'-GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'
下游引物：5'- GGGCTGTGATGATAAAGGGTAGA -3'
探针：5'- CCTCCTATCAGCAATCCCCTACATCG-3'
所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3；
（2）、与（1）所述序列互补的序列。
作为优选，所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。
本发明的第二个目的是提供驴源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为驴源性的定性或定量检测试剂盒；所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；
作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将驴源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有驴源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述驴源性保守基因片段为序列表中SEQ IDNo.2；
作为进一步优选，所述驴源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：
上游引物：5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'
下游引物：5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3'；
作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35个循环；72℃ 10min。
本发明的第三个目的是提供上述特异性引物和探针在制备定性或定量检测驴源性的试剂盒中的应用。
作为优选，所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。
作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
本发明的第四个目的是提供驴源性的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下：
（1）制备标准品：将驴源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有驴源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述驴源性保守基因片段为序列表中SEQ ID No.2；
（2）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；
（3）标准曲线绘制；
（4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行驴源性的快速定量检测。
作为优选，步骤（1）中所述驴源性保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：
上游引物为5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'；
下游引物为5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3'；
作为优选，PCR扩增所述驴源性保守基因片段的条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；
作为优选，步骤（2）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；
作为优选，步骤（2）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
本发明的第五个目的是提供驴源性的定性PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下：
（1）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增；
（2）通过待测样品的Ct值对驴源性进行定性检测：当Ct值小于38时，为阳性；否则，为阴性；
作为优选，步骤（1）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；
作为优选，步骤（1）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
本发明提供用于对驴源性进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量或定性检测驴制品和肉骨粉中驴源性含量的目的。本发明所提供的引物和探针可对驴制品和肉骨粉中的驴源性含量进行定性、定量分析，对判断驴制品和肉骨粉中驴源性含量具有重要意义，本发明将在食品微生物检测领域发挥重要作用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为引物和探针体系优化实验结果；其中：a代表引物为1.6μl，探针为1.6 μl；b代表引物为1.0μl，探针为1.6 μl；c代表引物为1.0μl，探针为0.8 μl；d代表引物为2.0μl，探针为0.8 μl；e代表引物为1.6μl，探针为0.8 μl；f代表引物为2.0μl，探针为1.0 μl；g代表引物为1.0μl，探针为0.8 μl；h代表引物为1.0μl，探针为1.0 μl；i代表引物为2.0μl，探针为1.6 μl；
图2为灵敏度实验结果；其中：a代表质粒浓度分别为1.00×108copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×107copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×106copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×105copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×104copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×103copies/ml、g代表质粒浓度为1.00×102copies/ml和阴性对照；
图3为特异性实验结果；其中，出现标准扩增曲线的为驴，未出现标准扩增曲线的为牛、羊、狗、鱼、鸡、鸭、鹅、兔、猪、蛙、鼠、阴性对照；
图4为驴源性标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方案对本发明做更详细阐述。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。
实施例1 cytb基因标准品的制备
要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。动物线粒体DNA具有分子量小、结构保守、热稳定性好、不易降解的结构特点和母系遗传、拷贝数多、进化速度快、不发生重组的遗传特点，其中线粒体细胞色素b（cytb）基因序列最为保守型。cytb基因检测驴源性，有较高的敏感性和特异性。本发明主要采用PCR技术扩增驴源性cytb基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-donkeycytb，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
一、模板DNA的制备
提取驴肝脏组织基因组DNA，用作cytb基因PCR扩增的模板；提取基因组DNA的试剂盒为细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），采购自百泰克生物技术有限公司；
（1）取1.5g新鲜驴肝脏组织用液氮研磨成粉末，加到5ml离心管中，加入4ml SE缓冲液，混匀，4500 r/mim离心15min；
（2）吸取上清，4℃ 12000 r/min离心20min，弃上清，收集沉淀；
（3）加入400μl Buffer Digestion ，震荡混匀。65℃水浴1-3h至细胞完全裂解 （注意：1、水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，可促进样品裂解。混合液变澄清透明为裂解完全。如溶液未变澄清，说明细胞裂解不彻底，应当延长水浴时间，否则将可能降低DNA的得率或导致提取的DNA不纯。2、如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20μl的Rnase A，室温放置2-5分钟）加入200μl Buffer PA，充分颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置5min；
（4）4℃ 10000rpm离心5分钟，将上清转移至新管中；
（5）加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀-20℃，放置20min；
（6）4℃ 10000rpm离心10分钟，弃上清；
（7）加入1ml预冷的75%的乙醇，漂洗1-3min，4℃ 10000rpm离心2分钟，弃上清；
（8）开盖室温倒置10-20min，至残留的乙醇完全挥发。得到的DNA用30-50μl纯净水溶解；
（9）提取的DNA可进行下一步实验或－20℃保存。
二、cytb基因片段的PCR扩增
1、引物的设计与合成
本发明通过对NCBI数据库中驴cytb全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。
本专利选取的扩增序列如下：
该外围引物序列如下：
上游引物：donkeycytb422F：5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'
下游引物：donkeycytb804R：5'-ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA-3'
扩增片段大小为：405bp。
2、PCR反应体系和反应条件
以DNA为模板，以上述外围引物donkeycytb422F/ donkeycytb804R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR反应体系：
10×PCR buffer 5μl
dNTP（2.5μM） 2μl
引物F（10μM） 2μl
引物R（10μM） 2μl
模板 2.4μl
Taq酶（5U） 1.6μl
ddH2O 35μl
总体积 50μl。
其中引物采用donkeycytb422F/ donkeycytb804R，Taq酶采用北京百泰克PowerTaq Plus DNA Polymerse，PCR扩增仪为北京百泰克iCycling系列96梯度PCR仪。
扩增程序/反应条件：
94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35个循环；72℃ 10min，取5μL扩增产物进行1%琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。
三、重组质粒pMD18-T-donkeycytb的构建和转化
1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T（大连宝生物公司）进行连接，采用如下连接体系进行配制：
pMD18-T vector 1μL
回收DNA 2μL
SolutionⅠ 5μL
ddH2O 2μL
总体积 10μL。
配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。
2、pMD18-T-donkeycytb质粒的转化以及PCR鉴定
（1）从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻；
（2）取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；
（3）42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min；
（4）向1.5ml EP管中加入预冷的400μl的LB液体培养基（不含氨苄青霉素）混匀后，37℃200转/分轻摇培养1h；
（5）将上述培养液摇匀后取100μl涂布于含100mg/ml Amp、24mg/ml IPTG、20 mg/ml X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；
（6）次日观察，从平板上挑取白色单克隆菌落于100μL LB液体培养基（含100mg/ml氨苄青霉素）的PCR管中，37℃振荡培养2-3小时。吸取2μL作为模板进行PCR鉴定，剩余的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇。
（7）用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。
引物RV-M/M13-47序列如下：
引物 RV-M: 5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’
引物 M13-47: 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
PCR反应体系如下：
10×PCR buffer 2.5μL
dNTP（2.5μM） 0.5μL
引物F（10μM） 0.5μL
引物R（10μM） 0.5μL
模板 2μL
Taq 酶（5U） 0.5μL
ddH2O 18.5μL
总体积 25μL。
扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。
（8）采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
四、标准品的获取和定量
1、将步骤三得到的含有重组质粒pMD18-T- donkeycytb的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃ 200rpm过夜摇培；
2、取1ml培养过夜的菌液转种于30ml LB液体培养基，200rpm 增菌培养2-3小时，然后采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；
3、利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可见分光光度计（ND5000）对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度。
4、质粒pMD18-T- donkeycytb浓度（拷贝数）计算
（1）质粒的分子量=3097bp×660（每对碱基的平均分子量）
（2）测得质粒浓度为116.48ng/μl，质粒纯度A260/A280=2.05，A260/A230=1.95。因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml。
质粒 copies/ml=阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数
其中阿伏伽德罗常数=6.02×1023copies/mol。
因此提取的质粒浓度copies/ml=116.48×10-9g/ml×6.02×1023copies/mol÷（3097bp×660g/bp·mol）=3.4×1010copies/m0l
10μl质粒+24μl的无菌水就得到浓度为1.00×1010copies/ml的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，作为系列标准品，并于-20℃保存备用。
实施例2 实时荧光定量PCR驴源性方法的建立
一、特异性引物和探针的设计与合成
以上述选取的驴的cytb基因的保守片段为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针。
作为本发明的核心，一组用于驴源性实时荧光PCR检测的引物和探针核苷酸序列如下：
上游引物：donkeycytb422F：5’- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3’
下游引物：donkeycytb552R: 5’- GGGCTGTGATGATAAAGGGTAGA -3’
探针：pigcytb444P: 5’-CCTCCTATCAGCAATCCCCTACATCG-3’
探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。
该引物和探针扩增目标核苷酸序列为：
二、待测样本的制备
1.驴制品样本的制备
（1）取5g驴制品用液氮研磨成粉末，加到15ml离心管中，加入10ml SE缓冲液，混匀，4500 r/mim离心15min；
（2）吸取上清，4℃ 12000 r/min离心20min，弃上清，收集沉淀；
（3）加入800μl Buffer Digestion，震荡混匀。65℃水浴1-3h至细胞完全裂解（注意：1、水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，可促进样品裂解。混合液变澄清透明为裂解完全。如溶液未变澄清，说明细胞裂解不彻底，应当延长水浴时间，否则将可能降低DNA的得率或导致提取的DNA不纯。2、如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20μl的Rnase A，室温放置2-5分钟）加入200μl Buffer PA，充分颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置5min；
（4）4℃ 10000rpm离心5分钟，将上清转移至新管中；
（5）加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀-20℃，放置20min；
（6）4℃ 10000rpm离心10分钟，弃上清；
（7）加入1ml预冷的75%的乙醇，漂洗1-3min，4℃ 10000rpm离心2分钟，弃上清；
（8）开盖室温倒置10-20min，至残留的乙醇完全挥发。得到的DNA用30-50μl纯净水溶解；
（9）提取的DNA可进行下一步实验或-20℃保存。
2.肉骨粉样本的制备
（1）称取0.5-2g肉骨粉样品于10ml离心管中，加入适量含10%SDS(采购自百泰克生物技术有限公司)和10μg/ml蛋白酶K（蛋白酶K采购自百泰克生物技术有限公司）的裂解液，37℃保温过夜；
（2）2000g离心5min。取离心上清液，加等体积酚/氯仿/异戊醇（三者的体积比为25/24/1）(采购自大连宝生生物技术有限公司)混匀，静置5min；
（3）8000g离心5min。取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇（异丙醇含量≥99%，采购自国药集团化学试剂有限公司），混匀，12000g 4℃离心10min；
（4）弃上清液，加500μL 70%冰乙醇（采购自国药集团化学试剂有限公司）；
（5）12000g 4℃离心5min。取沉淀，吹干。加50μL TE或ddH2O溶解白色沉淀，此即为DNA提取物。
三、实时荧光定量PCR条件优化
以浓度为1.00×106copies/ml的阳性质粒为模板，采用百泰克公司生产的2×real-time PCR Premixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，实验采用的实时荧光定量PCR仪为苏州百源基因技术有限公司的ASA-9600实时荧光定量PCR仪。反应体系采用20μl体系，其中引物和探针的量采用表1组合进行反应。
表1 PCR反应体系中引物和探针不同用量
反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。结果参照图1，数据显示20μl 体系时，引物（5μM）和探针（5μM）分别加入1.6μl，Ct值最小，荧光信号最强。
四、方法评估
1、灵敏度实验
将实施例1制备得到的一系列浓度的标准品进行实验，选取浓度为1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml、1.00×103copies/ml、1.00×102copies/ml等作为梯度模板。反应体系如下：
2×premix 10μl
Primer F（5μM） 1.6μl
Primer R（5μM） 1.6μl
Probe（5μM） 1.6μl
模板 2μl
ddH2O补至 20μl。
反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果参照图2，数据显示当质粒浓度达到1.00×103copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到1.00×102copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×103copies/ml。
由图1和图2还可以看出，标准品的扩增曲线光滑。
2、特异性实验
为了证实本发明对驴源性检测的特异性，我们选取了常见的11种动物做特异性实验，选取的动物包括：牛、羊、狗、鱼、鸡、鸭、鹅、兔、猪、蛙、鼠。
该特异性试验包括用上述样本的基因组DNA为模板进行的试验。反应体系如下：
2×premix 10μl
Primer F（5μM） 1.5μl
Primer R（5μM） 1.5μl
Probe（5μM） 1.5μl
模板 2μl
ddH2O补至 20μl。
反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图3，具体结果仅驴组织检测为阳性，其余动物均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如表2所示。
表2 特异性实验检测结果
3、标准曲线制备
以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标得到驴源性的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准，结果参考图4。由图4可知，Ct值和拷贝数呈较好的线性关系；以模板初始拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制出标准曲线方程，标准曲线原始方程为y=a+bx，本次标准曲线的方程为y=44.60-3.41x，所建立的标准曲线符合实时荧光PCR定量的要求。
4、待测样品的定量检测
以待测样品DNA和标准品的DNA为模板，用驴的特异性引物，以相同的体系同时进行驴cytb的基因片段的荧光定量PCR扩增。
PCR反应体系如下：
2×premix 10μl
Primer F（5μM） 1.6μl
Primer R（5μM） 1.6μl
Probe（5μM） 1.6μl
模板 2μl
ddH2O补至 20μl。
反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。通过标准曲线和待测样品的Ct值进行驴制品和肉骨粉中驴源性的快速定量检测。
5、待测样品的定性检测
以待测样品DNA为模板，用驴的特异性引物，对待测样品DNA进行驴cytb的基因片段的荧光定量PCR扩增。
PCR反应体系如下：
2×premix 10μl
Primer F（5μM） 1.6μl
Primer R（5μM） 1.6μl
Probe（5μM） 1.6μl
模板 2μl
ddH2O补至 20μl。
反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。通过待测样品的Ct值对驴制品和肉骨粉中驴源性进行定性判断：当Ct值小于38时，为阳性；否则，为阴性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州百源基因技术有限公司
<120> 一组用于驴源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgacaaaca tccgaaaatc ccacccgcta attaaaatca tcaatcactc ttttatcgac 60
ctgccaaccc cctcaaacat ttcatcatga tgaaactttg gctccctcct aggaatctgc 120
ctaatcctcc aaatcctaac aggcctattc ctagccatac actacacatc agacactaca 180
actgccttct catccgtcac ccatatctgc cgagacgtta actacggatg aatcattcgc 240
tacctccatg ccaacggagc atccatattt ttcatctgcc tctttatcca cgtagggcgc 300
ggcctctact atggctccta cacattccta gaaacatgaa acattggaat tatcctactt 360
ttcacagtaa tagccacagc attcataggc tatgtcctac catgaggaca aatatccttc 420
tgaggagcaa cggtcattac aaacctccta tcagcaatcc cctacatcgg tactacgctc 480
gtcgaatgaa tctgaggtgg attctcagta gacaaagcca cccttacccg attttttgcc 540
ttccacttta ttctaccctt tatcatcaca gccctggtaa tcgtccatct actattcctc 600
cacgaaacag gatccaacaa cccctcagga atcccatctg acatagacaa aatcccattc 660
cacccgtact acacaattaa agacatccta ggacttctcc tcctagtcct actcctacta 720
accctagtat tattctcccc tgacctccta ggagacccag acaactacac cccagctaac 780
cccctcagca ctccccctca tattaagcca gaatggtatt tcctatttgc ttacgccatc 840
ctacgctcca ttcccaacaa actaggtggt gtattagccc ttatcctttc catcttaatc 900
ctagcactca tccctaccct acacatgtca aaacaacgaa gcataatgtt ccgacccctt 960
agtcaatgcg tgttctgact cttagtagca gacttactaa cactaacatg aattggtggc 1020
caaccagtag aacacccata cgtaatcatc ggccaactgg cctcaatcct ctacttctcc 1080
ctaattctca tcttcatacc actcgcaagc accatcgaaa acaaccttct aaagtgaaga 1140
<210> 2
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaggagcaac ggtcattaca aacctcctat cagcaatccc ctacatcggt actacgctcg 60
tcgaatgaat ctgaggtgga ttctcagtag acaaagccac ccttacccga ttttttgcct 120
tccactttat tctacccttt atcatcacag ccctggtaat cgtccatcta ctattcctcc 180
acgaaacagg atccaacaac ccctcaggaa tcccatctga catagacaaa atcccattcc 240
acccgtacta cacaattaaa gacatcctag gacttctcct cctagtccta ctcctactaa 300
ccctagtatt attctcccct gacctcctag gagacccaga caactacacc ccagctaacc 360
ccctcagcac tccccctcat attaagccag aatggtattt cctat 405
<210> 3
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaggagcaac ggtcattaca aacctcctat cagcaatccc ctacatcggt actacgctcg 60
tcgaatgaat ctgaggtgga ttctcagtag acaaagccac ccttacccga ttttttgcct 120
tccactttat tctacccttt atcatcacag ccc 153

Claims (9)

1.一组用于驴源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：
（1）、上游引物：5'-GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'
下游引物：5'- GGGCTGTGATGATAAAGGGTAGA -3'
探针：5'- CCTCCTATCAGCAATCCCCTACATCG-3'
所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3；
（2）、与（1）所述序列互补的序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。
3.驴源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为驴源性的定性或定量检测试剂盒；其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；
作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将驴源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有驴源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述驴源性保守基因片段为序列表中SEQ IDNo.2；
作为进一步优选，所述驴源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：
上游引物：5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'
下游引物：5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3'；
作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35个循环；72℃ 10min。
4.权利要求1或2所述的特异性引物和探针在制备定性或定量检测驴源性的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
7.驴源性的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，其特征在于：步骤如下：
（1）制备标准品：将驴源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有驴源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述驴源性保守基因片段为序列表中SEQ ID No.2；
（2）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；
（3）标准曲线绘制；
（4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行驴源性的快速定量检测。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述驴源性保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：
上游引物为5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'；
下游引物为5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3'；
作为优选，PCR扩增所述驴源性保守基因片段的条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；
作为优选，步骤（2）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；
作为优选，步骤（2）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
9.驴源性的定性PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，其特征在于：步骤如下：
（1）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增；
（2）通过待测样品的Ct值对驴源性进行定性检测：当Ct值小于38时，为阳性；否则，为阴性；
作为优选，步骤（1）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；
作为优选，步骤（1）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676854A (zh) * 2017-12-01 2018-10-19 苏州百源基因技术有限公司 一种用于兔源性检测的实时荧光定量pcr试剂盒
CN108676853A (zh) * 2017-12-01 2018-10-19 苏州百源基因技术有限公司 一种用于鼠源性检测的实时荧光定量pcr试剂盒
CN108977552A (zh) * 2018-08-14 2018-12-11 北华大学 食用肉类鉴别阳性对照品及其制备方法和应用
CN109280708A (zh) * 2017-07-19 2019-01-29 成都市食品药品检验研究院 一种用于检测驴源性成分的试剂盒和方法
CN109593864A (zh) * 2019-01-16 2019-04-09 北京同仁堂科技发展股份有限公司 一种鉴定驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102311999A (zh) * 2011-08-31 2012-01-11 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 驴或驴源性成分实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针
CN104531884A (zh) * 2015-01-14 2015-04-22 山东省农业科学院生物技术研究中心 鉴别阿胶中多种动物源性的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光定量pcr检测方法
CN105803084A (zh) * 2016-06-12 2016-07-27 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种阿胶中驴、马源巢式荧光pcr检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102311999A (zh) * 2011-08-31 2012-01-11 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 驴或驴源性成分实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针
CN104531884A (zh) * 2015-01-14 2015-04-22 山东省农业科学院生物技术研究中心 鉴别阿胶中多种动物源性的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光定量pcr检测方法
CN105803084A (zh) * 2016-06-12 2016-07-27 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种阿胶中驴、马源巢式荧光pcr检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG J等: "Donkey genome and insight into the imprinting of fast karyotype evolution", 《SCI REP.》 *
J. CHISHOLM等: "The detection of horse and donkey using real-time PCR", 《MEAT SCIENCE》 *
XU X等: "Equus asinus complete mitochondrial genome", 《GENBANK DATABASE》 *
XU X等: "The complete mitochondrial DNA (mtDNA) of the donkey and mtDNA comparisons among four closely related mammalian species-pairs", 《J MOL EVOL.》 *
谭贵良等: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014, 中山大学出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109280708A (zh) * 2017-07-19 2019-01-29 成都市食品药品检验研究院 一种用于检测驴源性成分的试剂盒和方法
CN108676854A (zh) * 2017-12-01 2018-10-19 苏州百源基因技术有限公司 一种用于兔源性检测的实时荧光定量pcr试剂盒
CN108676853A (zh) * 2017-12-01 2018-10-19 苏州百源基因技术有限公司 一种用于鼠源性检测的实时荧光定量pcr试剂盒
CN108977552A (zh) * 2018-08-14 2018-12-11 北华大学 食用肉类鉴别阳性对照品及其制备方法和应用
CN109593864A (zh) * 2019-01-16 2019-04-09 北京同仁堂科技发展股份有限公司 一种鉴定驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法

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