CN109280708A

CN109280708A - 一种用于检测驴源性成分的试剂盒和方法

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Publication number: CN109280708A
Application number: CN201710591816.XA
Authority: CN
Inventors: 黄春燕; 吴雨洋; 段庆梓; 马立才; 梁恒兴; 杨柳; 张玉; 尚柯; 王巍; 吴文林; 张彪
Original assignee: BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Chengdu food and medicine inspection research institute
Current assignee: BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Chengdu food and medicine inspection research institute
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2019-01-29

Abstract

本发明涉及包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示引物对和SEQ ID NO.3所示探针的用于驴源性成分检测的试剂盒，还涉及用于检测驴源性成分的方法。本发明试剂盒及方法可以准确检测肉及肉制品中的驴源性成分，检测快速、准确，成本低，特异性好，灵敏度高，有广泛的应用前景。

Description

一种用于检测驴源性成分的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测驴源性成分的试剂盒和方法。

背景技术

近年来，伴随着肉类市场的急剧扩大，肉类掺假的事件频频发生，掺假的方式越来越多，形式越来越复杂，已成为全球食品行业的一个突出问题。肉制品掺假不仅会引起个体的健康风险，包括疾病感染、代谢紊乱、过敏反应等，而且肉制品的掺假更易引起经济、宗教、道德的问题。例如清真食品中混有配料表中未标明的驴源性成分，会严重侵犯我国少数民族和阿拉伯等伊斯兰教国家的宗教信仰和民族习惯，并且侵犯了消费者的知情权。

目前，肉类掺假常见的检测技术有ELISA法、显微判定法、电子鼻法、质谱法等，但都存在灵敏度低、周期长、不能检测熟肉等缺点而未被广泛使用。PCR技术具有灵敏度高、操作简便、抗干扰能力强等优势，越来越多被用于动物源性成分检测。

现有标准《SNT 3730.4-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第 4部分：驴成分检测实时荧光PCR法》，为实时荧光PCR方法检测驴源性成分，但我们在检测过程中出现，利用该方法检测时，样品容易出现假阴性的情况，无法保证判定结果的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测驴源性成分的试剂盒和方法。

本发明提供SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对、SEQ ID NO.3 所示的探针。

本发明还提供了SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针在制备检测驴源性成分的试剂中的用途。

其中，所述试剂是检测肉制品中驴源性成分的试剂。

本发明还提供了一种用于检测驴源性成分的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针。

其中，它还包括实时荧光PCR预混液。

其中，它还包括Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP，MgCl₂、PCR 稳定剂和增强剂。

其中，所述试剂盒的组成为：

PCR反应总体积为20μL时，

其余为无菌双蒸水；

其中，模板DNA的浓度为1ng/μL～100ng/μL；引物的浓度为10μmol/L；探针的浓度为10μmol/L。

本发明还提供了上述试剂盒在用于检测肉制品中驴源性成分中的用途。

本发明还提供了一种检测驴源性成分的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)提取样本DNA：取待检样品，提取其中的DNA；

(2)基因扩增：用上述试剂盒对待检样品中的DNA进行扩增；

(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测；

其中，所述待检组织为肉及肉制品。

综上，本发明试剂盒及方法可以准确检测驴源性成分，特别适用于肉及肉制品中的驴源性成分检测，检测快速、准确，成本低，特异性好，灵敏度高，有广泛的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1驴源性成分的特异性验证图。

图2驴源性成分的适用性验证图。

图3驴源性成分DNA浓度与Ct值关系图。

图4驴源性成分灵敏度验证图。

图5驴源性检出限验证图。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验试剂与仪器，均可通过商业途径购买得到。

具体试剂如下：

(1)CTAB裂解液：2％(w/v)CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA， 100mmol/LTris，用10％盐酸调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min，备用。

(2)蛋白酶K：20mg/mL。

(3)苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)。

(4)异丙醇。

(5)70％乙醇。

(6)实时荧光PCR预混液(以2×预混液为例)：PCR缓冲液(终浓度1×)，氯化镁(终浓度2.5mmol/L)，dNTP(终浓度0.2mmol/L)，Taq DNA聚合酶(终浓度1U)。

(7)TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液)：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)， 1mmol/LEDTA(pH 8.0)。

具体仪器如下：

(1)电子天平(Sartorius CPA225D)，感量0.01g。

(2)组织捣碎器(Retsch MM400)。

(3)恒温水浴锅(精宏XMTD-8222)。

(4)离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R)，最大离心力≥12 000g。

(5)微量移液器(Eppendorf Research plus)，量程分别为0.1μL～2.5μL、 0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。

(6)pH计(Mettler Toledo FE20)。

(7)核酸蛋白分析仪(Implen P330)。

(8)实时荧光PCR仪(Bio-Rad CFX96)。

实施例1本发明检测驴源性成分的试剂盒和检测方法

一、本发明试剂盒成分

包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针；如表1所示：

表1本发明引物及探针

注：F为5’端引物，R为3’端引物，P为探针。

二、采用本发明试剂盒检测驴源性成分

1、DNA提取

将样品均质后称取0.1g～0.2g，置于2mL离心管中，加入600μL CTAB 裂解液和20μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃孵育1h～2h，期间每隔10min振荡混匀；加入500μL的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分振荡混匀，12 000g离心5min；小心吸取上清液至洁净的1.5mL离心管内，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，12 000g离心5min；弃去上清液，500μL 70％乙醇洗涤2次， 12 000g离心5min，弃上清液，晾干；加入50μL～100μL TE缓冲液或无菌双蒸水，溶解DNA，-20℃保存备用。

也可用等效商品化试剂盒提取DNA。

2、DNA浓度和纯度的测定

使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度，DNA浓度在1ng/μL～100 ng/μL之间，A260/A280值在1.7～2.0之间时，适宜于本方法。

3、实时荧光PCR扩增

驴源性成分PCR扩增采用20μL的反应体系：包括PCR反应预混液(2 ×)10μL，5’端、3’端引物(10μmol/L)各0.2μL，探针(10μmol/L) 0.1μL，DNA模板(1ng/μL～100ng/μL)1μL，用无菌双蒸水补足20μL。每个样品设置两个平行反应体系。

PCR扩增反应程序为：95℃5min；35个循环反应(95℃15s，58℃ 1min，收集荧光)。

也可用等效的商品化试剂盒进行扩增。

4、实验对照

实验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。用含有驴源性成分的样品作为阳性对照，用不含驴源性成分的样品作为阴性对照，用等体积的无菌双蒸水代替模板DNA作为空白对照。

5、结果判断与表述：

5.1质量控制

以下条件有一条不满足时，实验视为无效：

(a)空白对照：无FAM荧光信号检出；

(b)阴性对照：无FAM荧光信号检出；

(c)阳性对照：有FAM荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值 ≤30.0。

5.2结果判定

(a)如有FAM荧光信号检出，Ct值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，则判定为被检样品阳性；

(b)如Ct值≥35.0或无Ct值，则判定为被检样品阴性；

(c)如有FAM荧光信号检出，且30.0＜Ct值＜35.0，则重新进行实验。如再次扩增后Ct值仍＜35.0，且有典型的扩增曲线，则判定被检样品阳性；否则判定被检样品阴性。

5.3结果表述

结果为阳性者，表述为“检出驴源性成分”。

结果为阴性者，表述为“未检出驴源性成分”。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1本发明试剂盒及方法的特异性检测

分别以小鼠、海狸鼠、猫、鸡、鸭、鹅、鹌鹑、水牛、黄牛、牦牛、马、狐狸、貂、貉、兔、猪、山羊、绵羊、驴、鹿共计20种物种的基因组DNA为模板，用实施例1的试剂盒及方法，进行实时荧光PCR扩增。

扩增结束后，通过观察对不同模板DNA的扩增曲线及Ct值来判定其特异性。检测结果为3个平行样品的平均Ct值。若有FAM荧光信号检出，Ct 值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，则判定为被检样品阳性。若有FAM荧光信号检出，且30.0＜Ct值＜35.0，则重新进行实验。如再次扩增后Ct值仍＜ 35.0，且有典型的扩增曲线，则判定被检样品阳性；否则判定被检样品阴性。若Ct值≥35.0或无Ct值，判定被检样品为阴性。实验结果见图1。

结果显示，驴源性检测体系中，20种动物源性成分检测仅有驴源性样品有Ct值，有典型扩增曲线且平均Ct值为16.42，小于30，判定为含有驴源性成分，其它物种均未检出，特异性验证结果理想，实验结果均能达到检测要求。

可见，本发明方法和试剂盒的检测结果与样本的实际情况一致，说明本发明方法和试剂盒特异性好，可以准确检测驴源性成分。

试验例2本发明试剂盒及方法的适用性检测

对不同产地、不同基质的肉及肉制品(样品信息见表2和图2)进行DNA 提取，按照本发明试剂盒及方法对其进行检测，确定方法的适用性。

表2样品具体信息、测序结果及实时荧光判定结果

样品编号	样品名称	产地/生产商	测序比对结果	判定结果	实时荧光结果
						LV 01	生驴肉	四川成都	KX669267.1	驴	驴
LV 02	手撕驴肉干	河北保定	KX669267.1	驴	驴
						LV 03	香辣驴肉	河北保定	KX669267.1	驴	驴
LV 04	闹汤驴肉	河南焦作	KX669267.1	驴	驴
						LV 05	生鲜驴肉	河南焦作	KX669267.1	驴	驴
LV 06	卤驴肉	安徽合肥	KX669267.1	驴	驴
						LV 07	驴后腿肉	安徽合肥	KX669267.1	驴	驴
LV 08	驴座子肉	上海	KX669267.1	驴	驴
						LV 09	五香驴肉	山东德州	KX669267.1	驴	驴
LV 10	带皮生鲜驴肉	山东德州	KX669267.1	驴	驴

结果显示，驴源性检测的10个样品在3个浓度水平上Ct值均小于30，且扩增曲线理想，判定为含有驴源性成分，判定结果与实际样本测序结果相符合，适用性试验结果符合预期，满足检测要求。

可见，本发明方法和试剂盒的检测结果与样本的实际情况一致，说明本发明方法和试剂盒适用性好，可以准确检测不同基质肉类的驴源性成分。

试验例3本发明试剂盒及方法的灵敏度检测

对驴源性DNA进行倍比稀释(模板DNA浓度设定：10^-4ng/μL、10^-3ng/μL、 10^-2ng/μL、10^-1ng/μL、10⁰ng/μL、10¹ng/μL)，用实施例1的试剂盒及方法，进行扩增反应。确定模板DNA浓度范围与Ct值线性关系，同时根据扩增效率计算公式，计算检测方法的扩增效率，以确定模板DNA的灵敏度。

扩增效率计算公式为：

当灵敏度达到或低于1ng/μL，线性范围内R²>0.99，扩增效率在80％～120％之间时，可满足检测要求(结果见表3和图4)。

表3不同浓度模板的Ct值

模板浓度	10<sup>-4</sup>ng/μL	10<sup>-3</sup>ng/μL	10<sup>-2</sup>ng/μL	10<sup>-1</sup>ng/μL	10<sup>0</sup>ng/μL	10<sup>1</sup>ng/μL
							Ct值	32.10	28.83	25.22	21.77	18.37	14.96

结果显示，当模板DNA浓度在10¹ng/μL至10^-4ng/μL间时，模板DNA 浓度和获得的Ct值之间线性关系好(相关系数99.9％)，扩增效率为96.5％。当阈值设为30个循环时，DNA检测的灵敏度为10^-3ng/μL。

可见，本发明方法在线性范围均有良好的线性关系，R²>0.99；在线性范围内，扩增效率均在80％～120％之间，扩增效率满足检测要求；灵敏度可达到10^-3ng/μL，满足检测要求。

试验例4本发明试剂盒及方法的检出限检测

分别将驴肉样品以0.1％、0.01％、0.001％三个水平掺入鸡肉样品中，充分混匀后，提取混合样品的基因组DNA，作为检测模板，用实施例1的试剂盒及方法，进行检出限实验(结果见表4和图5)。

表4混合肉样检出限验证及检测结果

试验结果显示，驴源性实时荧光PCR检测体系能准确检测0.01％驴肉，而在掺入0.001％驴肉试验时，相应Ct值接近甚至超过30个循环，对其判定会出现偏差，为了统一检测方法的检出限，规定本方法的检出限为0.01％。

综上，本发明试剂盒及方法可以准确检测驴源性成分，检测快速、准确，成本低，特异性好，灵敏度高，有广泛的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都市食品药品检验研究院北京维德维康生物技术有限公司

<120> 一种用于检测驴源性成分的试剂盒和方法

<130> GY392-17P1276

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 驴源性检测的5'端引物

<400> 1

gctagcctca ttatcagtat 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 驴源性检测的3'端引物

<400> 2

gtgatgagga tacgtgct 18

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 驴源性检测的探针序列

<400> 3

tcatatcatc aatcctcaac acccaca 27

Claims

1.SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对。

2.SEQ ID NO.3所示的探针。

3.SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针在制备检测驴源性成分的试剂中的用途。

4.根据权利要求3所示的用途，其特征在于：所述试剂是检测肉及肉制品中驴源性成分的试剂。

5.一种用于检测驴源性成分的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：它还包括实时荧光PCR预混液。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：它还包括Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂和反应缓冲液。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的组成为：

PCR反应总体积为20μL时，

9.权利要求5～权利要求8所述的任意一项试剂盒在用于检测肉及肉制品中驴源性成分中的用途。

10.一种检测驴源性成分的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)提取样本DNA：取待检组织，提取其中的DNA；

(2)基因扩增：用权利要求5～权利要求8任意一项所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；

(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测；

其中，所述待检组织为肉及肉制品。