CN105567801A - 牛肉制品中猪肉成分定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品检测领域，具体涉及牛肉制品中猪肉成分含量定量检测方法。牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，样品预处理；步骤二，DNA抽取；步骤三，DNA浓度和纯度的测定；步骤四，实时荧光PCR反应；步骤五，结果计算。本发明进行牛肉制品中猪肉成分含量定量检测，检测过程简便，结果准确，并且提取的猪肉浓度参考物质DNA可以长时间保持，与购买商业试剂盒相比，成本低廉，满足了猪肉掺假鉴定的需要。

Description

牛肉制品中猪肉成分定量检测方法

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体涉及牛肉制品中猪肉成分含量定量检测方法。

背景技术

由于猪肉与牛肉、羊肉价格差别较大，近年来在经济利益的驱动下，以猪肉添加牛肉香精、羊油、色素等添加剂冒充羊肉、牛肉及其制品的违法犯罪事件屡见不鲜。如浙江犯罪团伙用猪肉生产假牛肉干，一年多制造销售达75吨；广州思味食品的“亿思”牌牛肉干以猪肉和牛肉膏为原料，以假充真，两年销售2000万元；内蒙古不法分子猪肉冒充牛肉，添加牛肉香精，将生产的假风干牛肉销往包头周边地区及陕西、宁夏等省市。这些事件损坏了消费者的利益，甚至危害消费者身体健康。而且因穆斯林忌食猪肉，这些假牛羊肉也涉及到民族和宗教问题。这些都严重动摇了消费者对食品行业的信心。

由于经过色素、香精加工的猪肉纹理、色泽和气味与牛肉、羊肉相似，普通消费者难以辨别，深加工过的假牛肉干等制品更是难以分辨。目前肉类成分鉴定的方法主要是根据蛋白质成分和基因序列，如色谱、酶联免疫反应(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)法。目前一些企业已经开发出猪肉蛋白质的ELISA检测试剂盒和试剂条，但这些试剂盒和试剂条检测准确性不高。实时荧光PCR(real-timePCR)方法具有灵敏度、准确性高的优点，同时不需要购买昂贵的试剂盒。目前肉类成分食品检测标准主要基于实时荧光PCR方法，如SN/T3730.8-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第8部分猪成分检测实时荧光PCR法》。

但这些标准主要是对食品和饲料中猪、牛、鸡等动物源成分进行定性检测，不能进行定量检测，无法依据阳性结果判断是因为生产者故意掺假还是生产中污染造成。同时因为大部分检测标准的目标基因是18SrRNA等多拷贝基因，检测灵敏度非常高(可检出0.001％特定动物源性成分)，容易出现假阳性结果。这些缺点限制使这些检测标准无法作为判断是否惨假的依据，因此急需一种准确快速的猪肉成分定量检测方法作为肉类惨假判定的依据。

发明内容

本发明的目的在于，提供牛肉制品中猪肉成分定量检测方法。

本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：

牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，样品预处理；

步骤二，DNA抽取；

步骤三，DNA浓度和纯度的测定；

步骤四，实时荧光PCR反应；

步骤五，结果计算。

本发明进行牛肉制品中猪肉成分含量定量检测，检测过程简便，结果准确，并且提取的猪肉浓度参考物质DNA可以长时间保持，与购买商业试剂盒相比，成本低廉，满足了猪肉掺假鉴定的需要。

所述步骤一中，所述样品为干燥固体时，可直接以粉碎机研磨成细粉；所述样品为湿状时，经冷冻干燥处理后，再研磨成细粉备用。

作为一种方案，所述步骤二中，包括2-1：称取两个0.2g样品试样，至2ml离心管中，加入900μL预热的CTAB裂解缓冲液和40μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温30min；

2-2：12000g离心5min，取上清于另一干净的2ml离心管中，加入等体积的酚，三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；

2-3：12000g离心5min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液(24:1)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清至干净的2ml离心管中；

2-4：加入等体积异丙醇，颠倒混匀，12000g离心5min，弃去上清液；E.用4℃预冷的70％乙醇500μL，涡旋清洗沉淀，12000g离心5min，弃去上清液；

2-5：倒置晒干后加100μLRNA酶A缓冲液，37℃温育30min；

2-6：重复步骤2-4、2-5，倒置晒干后加50μLTE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用。

作为另一种方案，所述步骤二中，也可使用商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

所述步骤三中，使用紫外分光光度计检测提取的DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值应在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：

C＝A*N*50

C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值

N—DNA稀释倍数

将DNA浓度稀释到50ng/μL。

所述步骤四中，还包括扩增，扩增时，应设立两个对照：阴性对照(牛基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)；每个反应，各浓度参考物质和样品试样需设置三个重复试验；分别对猪特异性内源基因和动物参照基因进行实时荧光PCR反应；反应体系如下：

2XTaqManUniversalPCRMasterMix………12.5μl

上游引物10μM…………………………………0.5μl

下游引物10μM…………………………………0.5μl

探针……………………………………………0.5μl

DNA模版…………………………………………2μl

ddH2O至总体积25μl

反应管离心后放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

预变性：95℃10min，1个循环；

PCR扩增：95℃15sec；60℃60sec，40个循环。

所述步骤五中，使用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果；空白对照的猪特异性内源基因和动物参照基因应无扩增曲线；阴性对照、参考物质和样品的动物参照基因应出现扩增曲线，且Ct值小于30；阴性对照的猪特异性内源基因应无扩增曲线；标准曲线制作，根据实时荧光PCR分析结果，获得不同浓度参考物质的猪特异性内源基因的Ct值和动物参照基因的Ct值，再求得三个重复试验的Ct值平均值，将参考物质的猪特异性内源基因的Ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值后所得值△Ct为纵坐标，以参考物质的猪肉成分含量的对数为横坐标，进行线性回归分析并制作标准曲线：

ΔCt＝AlgN+B…………………………………公式1

△Ct：猪特异性内源基因的Ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值。

N：猪肉成分含量

A：标准曲线斜率。

B：标准曲线Y轴之截距。

(注：如三个重复试验结果出现偏离现象时，应将该偏离数据舍弃，但每个浓度皆应有代表数据存在。)

样品中猪肉成分含量计算，根据实时荧光PCR分析结果，获得样品的的猪特异性内源基因的Ct值和动物参照基因的Ct值。再求得三个重复试验的Ct值平均值。根据标准曲线公式1，按以下公式得出样品中猪肉成分含量N(％)：

$N={10}^{\left(\frac{\mathrm{\Δ}Ct-B}{A}\right)}\×100\%$ …………………………………公式2

计算两个样品试样的猪肉成分含量平均值。

本发明中两个样品试样中猪肉成分浓度N₁和N₂的相对偏差应小于15％，即：

$\frac{\left|N_1-N_2\right|}{\stackrel{\&OverBar;}{N}}\&times;100<15\%$

所述步骤四中，扩增所述猪特异性内源基因(目的基因cytb)的引物和探针：

上游引物F1：5′-CGACAAAGCAACCCTCACAC-3′

上游引物R1：5′-TGCGAGGGCGGTAATGAT-3′

探针P1：5′-(FAM)-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-(TAMRA)-3′，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团；

PCR扩增产物大小70bp。

所述步骤四中，扩增所述动物参照基因(目的基因12SrRNA)的引物和探针：

上游引物F2：5′-CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3′

上游引物R2：5′-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3′

探针P2：5′-(FAM)-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGC-(TAMRA)-3′，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团；PCR扩增产物大小154～155bp。

在应用中，所述步骤四中，扩增所述猪特异性内源基因(目的基因cytb)的引物和探针、扩增所述动物参照基因(目的基因12SrRNA)的引物和探针的浓度为10μM。

附图说明

图1为本发明的流程示意图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示进一步阐述本发明。

参照图1，牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，包括以下步骤：

步骤一，样品预处理；

步骤二，DNA抽取；

步骤三，DNA浓度和纯度的测定；

步骤四，实时荧光PCR反应；

步骤五，结果计算。

本发明进行牛肉制品中猪肉成分含量定量检测，检测过程简便，结果准确，并且提取的猪肉浓度参考物质DNA可以长时间保持，与购买商业试剂盒相比，成本低廉，满足了猪肉掺假鉴定的需要。

步骤一中，样品为干燥固体时，可直接以粉碎机研磨成细粉；样品为湿状时，经冷冻干燥处理后，再研磨成细粉备用。

作为一种方案，步骤二中，包括2-1：称取两个0.2g样品试样，至2ml离心管中，加入900μL预热的CTAB裂解缓冲液和40μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温30min；

2-2：12000g离心5min，取上清于另一干净的2ml离心管中，加入等体积的酚，三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；

2-3：12000g离心5min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液(24:1)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清至干净的2ml离心管中；

2-4：加入等体积异丙醇，颠倒混匀，12000g离心5min，弃去上清液；E.用4℃预冷的70％乙醇500μL，涡旋清洗沉淀，12000g离心5min，弃去上清液；

2-5：倒置晒干后加100μLRNA酶A缓冲液，37℃温育30min；

2-6：重复步骤2-4、2-5，倒置晒干后加50μLTE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用。

作为另一种方案，步骤二中，也可使用商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

步骤三中，使用紫外分光光度计检测提取的DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值应在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：

C＝A*N*50

C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值

N—DNA稀释倍数

将DNA浓度稀释到50ng/μL。

步骤四中，还包括扩增，扩增时，应设立两个对照：阴性对照(牛基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)；每个反应，各浓度参考物质和样品试样需设置三个重复试验；分别对猪特异性内源基因和动物参照基因进行实时荧光PCR反应；反应体系如下：

2XTaqManUniversalPCRMasterMix………12.5μl

上游引物10μM…………………………………0.5μl

下游引物10μM…………………………………0.5μl

探针……………………………………………0.5μl

DNA模版…………………………………………2μl

ddH2O至总体积25μl

反应管离心后放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

预变性：95℃10min，1个循环；

PCR扩增：95℃15sec；60℃60sec，40个循环。

步骤五中，使用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果；空白对照的猪特异性内源基因和动物参照基因应无扩增曲线；阴性对照、参考物质和样品的动物参照基因应出现扩增曲线，且Ct值小于30；阴性对照的猪特异性内源基因应无扩增曲线；标准曲线制作，根据实时荧光PCR分析结果，获得不同浓度参考物质的猪特异性内源基因的Ct值和动物参照基因的Ct值，再求得三个重复试验的Ct值平均值，将参考物质的猪特异性内源基因的Ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值后所得值△Ct为纵坐标，以参考物质的猪肉成分含量的对数为横坐标，进行线性回归分析并制作标准曲线：

ΔCt＝AlgN+B…………………………………公式1

△Ct：猪特异性内源基因的Ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值。

N：猪肉成分含量

A：标准曲线斜率。

B：标准曲线Y轴之截距。

(注：如三个重复试验结果出现偏离现象时，应将该偏离数据舍弃，但每个浓度皆应有代表数据存在。)

样品中猪肉成分含量计算，根据实时荧光PCR分析结果，获得样品的的猪特异性内源基因的Ct值和动物参照基因的Ct值。再求得三个重复试验的Ct值平均值。根据标准曲线公式1，按以下公式得出样品中猪肉成分含量N(％)：

$N={10}^{\left(\frac{\mathrm{\&Delta;}Ct-B}{A}\right)}\&times;100\%$ …………………………………公式2

计算两个样品试样的猪肉成分含量平均值。

本发明中两个样品试样中猪肉成分浓度N₁和N₂的相对偏差应小于15％，即：

$\frac{\left|N_1-N_2\right|}{\stackrel{\&OverBar;}{N}}\&times;100<15\%$

步骤四中，扩增猪特异性内源基因(目的基因cytb)的引物和探针：

上游引物F1：5′-CGACAAAGCAACCCTCACAC-3′

上游引物R1：5′-TGCGAGGGCGGTAATGAT-3′

探针P1：5′-(FAM)-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-(TAMRA)-3′，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团；

PCR扩增产物大小70bp；

步骤四中，扩增动物参照基因(目的基因12SrRNA)的引物和探针：

上游引物F2：5′-CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3′

上游引物R2：5′-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3′

探针P2：5′-(FAM)-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGC-(TAMRA)-3′，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团；PCR扩增产物大小154～155bp；

在应用中，以上上游引物、下游引物及探针的浓度为10μM。

实例1：

样品1：模拟牛肉制品(猪肉成分含量为8.87％：将202.6mg猪肉和2.0822g牛肉放入粉碎机中，混合粉碎成肉糜)，分别取两份0.5g试样(a1和b1)检测，验证本方法的准确性。

样品2：模拟牛肉制品(猪肉成分含量为24.8％：将1.123g猪肉、3.403g牛肉和3.005g大豆粉放入粉碎机中，混合粉碎成肉糜)，分别取两份0.5g试样(a2和b2)检测，验证本方法的准确性。

样品3：牛肉干，100g，购于某超市，用粉碎机研磨成细粉；分别取两份0.5g(a3和b3)试样检测，验证检测一般牛肉制品。

(一).制作含不同猪肉成分含量的参考物质，步骤如下：

1、购买新鲜合适的猪肉和牛肉，剔除猪皮、牛筋、脂肪等肌肉以外成分；

2、分别用粉碎机将猪肉和牛肉绞碎成肉糜，将肉糜冷冻干燥后，再用粉碎机研磨成细粉；

3、用猪肉粉和牛肉粉配置含不同猪肉成分含量的参考物质(Std1、Std2、Std3、Std4和Std5)，具体猪肉成分含量如下表：

表1

参考物质	Std1	Std2	Std3	Std4	Std5
						猪肉成分含量N	100％	50.59％	17.09％	4.60％	1.10％

4、将参考物质混合均匀。

(二).DNA抽取

A.称取3个样品的6个试样和5个参考物质0.5g，加至15ml离心管中，加入5mL预热的CTAB裂解缓冲液和100μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温40min；

B.12000g离心5min，取900μL上清于另一干净的2ml离心管中，加入等体积的酚，三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；

C.12000g离心5min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液(24:1)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清至干净的2ml离心管中；

D.加入等体积异丙醇，颠倒混匀，12000g离心5min，弃去上清液；

E.用4℃预冷的70％乙醇500μL，涡旋清洗沉淀，12000g离心5min，弃去上清液；

F.，倒置晒干后加100μLRNA酶A缓冲液，37℃温育30min；

G.重复步骤D、E，倒置晒干后加50μLTE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用。

(三).DNA浓度和纯度的测定

使用紫外分光光度计检测提取的DNA溶液的吸光值A260和A280，计算A260/A280比值，按以下公式计算DNA浓度：

C＝A*N*50

C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值

N—DNA稀释倍数

提取的样品和参考物质DNA溶液的浓度和纯度如下表：

表2

DNA浓度稀释到50ng/μL。

(四).实时荧光PCR反应

A、分别对猪特异性内源基因和动物参照基因进行实时荧光PCR反应。猪特异性内源基因(目的基因cytb)的引物和探针序列如下：

上游引物F1：5′-CGACAAAGCAACCCTCACAC-3′

上游引物R1：5′-TGCGAGGGCGGTAATGAT-3′

探针P1：5′-(FAM)-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-(TAMRA)-3′，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团；

B、动物参照基因(目的基因12SrRNA)的引物和探针如下：

上游引物F2：5′-CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3′

上游引物R2：5′-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3′

探针P2：5′-(FAM)-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGC-(TAMRA)-3′，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团；

C、每个参考物质和样品试样分别设置三个重复试验。

D、配置体系时，设立两个对照：阴性对照(牛基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，以水代替)。

E、反应体系如下：2XTaqManUniversalPCRMasterMix………12.5μl

上游引物10μM…………………………………0.5μl

下游引物10μM…………………………………0.5μl

探针……………………………………………0.5μl

DNA模版…………………………………………2μl

ddH2O至总体积25μl

F、反应管离心后放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

预变性：95℃10min，1个循环；

PCR扩增：95℃15sec；60℃60sec，40个循环。

(五)、结果计算

A、PCR反应结束后，使用荧光定量PCR仪随机软件，按软件默认设置分析扩增结果，制作猪特异性内源基因扩增曲线，制作动物参照基因扩增曲线；

B、荧光PCR分析结果数据如下表：

表3

△Ct：猪特异性内源基因的Ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值

C、空白对照和阴性对照结果正常

D、标准曲线制作以5个参考物质△Ct值为纵坐标，猪肉成分含量(N)的对数为横坐标，进行线性回归分析并制作标准曲线，公式如下：

ΔCt＝-3.0807lgN-0.2994…………………………………公式4

R2＝0.9992

E、样品中猪肉成分含量计算根据公式4得到公式5，将样品的猪特异性内源基因的Ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值得到△Ct。按以下公式5得出每个样品中猪肉成分含量N(见表4)：

$N={10}^{\left(\frac{\mathrm{\&Delta;}Ct+0.2994}{-3.0807}\right)}\&times;100\%$ …………………………………公式5

样品1和样品2中猪肉成分含量检测结果与实际含量相对误差分别为-1.5％和3.2％，说明本发明检测方法准确性很高。即使牛肉制品中含有一些植物成分(如大豆)，也能得到很高的准确性，能满足日常牛肉制品中猪肉成分惨假定量检测要求。对牛肉干检测，发现其中含有很高含量的猪肉成分(20.5％)，可以确认厂家在牛肉干中故意掺入了猪肉成分，排除了污染的可能性。使用本方法检测牛肉制品可以为执法部门执法和维护消费者利益提供了有力证据。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

Claims (10)

1.牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，样品预处理；

步骤二，DNA抽取；

步骤三，DNA浓度和纯度的测定；

步骤四，实时荧光PCR反应；

步骤五，结果计算。

2.根据权利要求1所述的牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，所述步骤一中，所述样品为干燥固体时，直接以粉碎机研磨成细粉；所述样品为湿状时，经冷冻干燥处理后，再研磨成细粉备用。

3.根据权利要求1所述的牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，所述步骤二中，包括2-1：称取两个0.2g样品试样，至2ml离心管中，加入900μL预热的CTAB裂解缓冲液和40μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温30min；

2-2：12000g离心5min，取上清于另一干净的2ml离心管中，加入等体积的酚，三氯甲烷和异戊醇的混合液，震荡混匀；

2-3：12000g离心5min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清至干净的2ml离心管中；

2-4：加入等体积异丙醇，颠倒混匀，12000g离心5min，弃去上清液；E.用4℃预冷的70％乙醇500μL，涡旋清洗沉淀，12000g离心5min，弃去上清液；

2-5：倒置晒干后加100μLRNA酶A缓冲液，37℃温育30min；

2-6：重复步骤2-4、2-5，倒置晒干后加50μLTE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用。

4.根据权利要求1所述的牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，所述步骤二中，使用商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

5.根据权利要求1所述的牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，所述步骤三中，使用紫外分光光度计检测提取的DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值应在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：

C＝A*N*50

C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值

N—DNA稀释倍数

将DNA浓度稀释到50ng/μL。

6.根据权利要求1所述的牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，所述步骤四中，还包括扩增，扩增时，应设立两个对照：阴性对照、空白对照；每个反应，各浓度参考物质和样品试样需设置三个重复试验；分别对猪特异性内源基因和动物参照基因进行实时荧光PCR反应；反应体系如下：

2XTaqManUniversalPCRMasterMix………12.5μl

上游引物10μM…………………………………0.5μl

下游引物10μM…………………………………0.5μl

探针……………………………………………0.5μl

DNA模版…………………………………………2μl

ddH2O至总体积25μl

反应管离心后放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

预变性：95℃10min，1个循环；

PCR扩增：95℃15sec；60℃60sec，40个循环。

7.根据权利要求1所述的牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，所述步骤五中，使用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果；空白对照的猪特异性内源基因和动物参照基因应无扩增曲线；阴性对照、参考物质和样品的动物参照基因应出现扩增曲线，且Ct值小于30；阴性对照的猪特异性内源基因应无扩增曲线；标准曲线制作，根据实时荧光PCR分析结果，获得不同浓度参考物质的猪特异性内源基因的Ct值和动物参照基因的Ct值，再求得三个重复试验的Ct值平均值，将参考物质的猪特异性内源基因的Ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值后所得值△Ct为纵坐标，以参考物质的猪肉成分含量的对数为横坐标，进行线性回归分析并制作标准曲线：

ΔCt＝AlgN+B…………………………………公式1

△Ct：猪特异性内源基因的Ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值。

N：猪肉成分含量

A：标准曲线斜率。

B：标准曲线Y轴之截距。

样品中猪肉成分含量计算，根据实时荧光PCR分析结果，获得样品的的猪特异性内源基因的Ct值和动物参照基因的Ct值。再求得三个重复试验的Ct值平均值。根据标准曲线公式1，按以下公式得出样品中猪肉成分含量N(％)：

$N={10}^{\left(\frac{\mathrm{\&Delta;}Ct-B}{A}\right)}\&times;100\%$ …………………………………公式2

计算两个样品试样的猪肉成分含量平均值

两个样品试样中猪肉成分浓度N₁和N₂的相对偏差应小于15％，即：

$\frac{|N_1-N_2|}{\stackrel{\&OverBar;}{N}}\&times;100<15\%$

8.根据权利要求6所述的牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，所述步骤四中，扩增所述猪特异性内源基因的引物和探针：

上游引物F1：5′-CGACAAAGCAACCCTCACAC-3′

上游引物R1：5′-TGCGAGGGCGGTAATGAT-3′

探针P1：5′-(FAM)-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-(TAMRA)-3′，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团；

PCR扩增产物大小70bp。

9.根据权利要求6所述的牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，所述步骤四中，扩增所述动物参照基因的引物和探针：

上游引物F2：5′-CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3′

上游引物R2：5′-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3′

探针P2：5′-(FAM)-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGC-(TAMRA)-3′，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团；

PCR扩增产物大小154～155bp。

10.根据权利要求9所述的牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，所述步骤四中，扩增所述猪特异性内源基因的引物和探针、扩增所述动物参照基因的引物和探针的浓度为10μM。