CN103451304B - 实时荧光pcr检测貉子源性成分的引物探针及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物、探针及具体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性，采用实时荧光PCR特异扩增法可以定性分析畜肉食品中是否含有貉子源性成分,发挥了实时荧光PCR检测技术的优点,进一步完善了食品检测体系,加大对消费者利益的保护力度。
Description
技术领域:
本发明属食品检验技术领域，确切地说是一种实时荧光PCR检测用引物，探针以及利用该引物探针，及对貉子源性成分进行鉴别检测的方法。
背景技术
目前,国内外应用于检测食品和饲料中所含动物成分的技术主要有二种: ELISA方法及PCR特异扩增法,在实际检测中应用最多的是PCR特异扩增法,PCR特异扩增法又有普通定性PCR，实时荧光PCR。实时荧光PCR技术是基于普通PCR技术基础上发展而来的,在扩增反应体系中添加一个特异性的荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，即检测靶核昔酸序列扩增状态，以进行结果判定"它的主要优点是: (1)在闭管状态下进行扩增产物检测,无需PCR产物的后处理,避免了扩增产物污染而致的假阳性,保证了结果的可靠性；(2)探针杂交特异性更强，灵敏度更高,在普通PCR扩增的基础上又多了一条可以与模板互补配对的荧光探针,提高了特异性,荧光信号由仪器自动收集,进一步提高了灵敏度；(3)无需酶切位点存在，无需进行酶切，电泳,节省了时间，PCR后无需后续处理，操作更简单快速；
在动物产品原料和加工产品中，经常出现动物成分的掺假造假和无意污染现象，掺假主要是不法商要降低成本或增加品质,以谋取巨额的经济利益,在食品和饲料的加工过程中,以低价格的原料替代高价格的原料或掺入到高价格的原料中,这是一种欺诈行为"掺假造假的欺诈行为,被我国多部法律法规禁止" 。貉子作为一种毛皮动物，在杀完去皮张之后，往往将耗子肉贱卖给不法商贩，不法商贩往往某些价格较高的畜肉制品中却添加有貉子肉，以次充好。由于没有相应的引物、探针，迄今为止还没有对畜肉食品中貉子源性成分的定性检测方法,以至于不能及时发现畜肉食品中貉子源性成分的存在，这种掺假造假，以次充好的行为除了影响影响人体健康、严重损害了消费者的利益。
目前我国还没有相应方法对食品和饲料中的猫源性成分进行检测"也就是说,食品和饲料中的貉子源性成分检测仍处于空白状态"建立食品和饲料中貉子源性成分检测方法,对于打击假冒伪劣食品，保障消费者权益和身体健康,保护我国畜牧业安全和经济利益,避免国际贸易纠纷等方面具有十分重要的意义,是迫在眉睫要解决的食品安全问题和检验检疫问题。综上所述,鉴于目前尚没有快速简便地检测和鉴定貉子源性成分的检测技术,因此,本领域迫切需要开发新的快速简便地检测和鉴定貉子源性成分的技术。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术所存在的上述技术问题,提供一种实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物探针及方法。
实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物探针，分别为：
上游引物Pl：CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC
下游引物P2：GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA
带有荧光染料的探针序列为: CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC
所述的荧光染料，5′端为FAM标记，3′eclipse标记。
实时荧光PCR检测貉子源性成分的方法，其步骤如下：
a.提取待检样品基因组DNA;
b.以所提取的DNA作为模板,加入上述引物对和荧光染料标记的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样品反应的Ct值;
所述的实时荧光PCR反应体系为：
2×Real-time PCR预混液 10μL
上游引物（10 μmol/L） 1μL
下游引物(10 μmol/L） 1μL
探针(10 μmol/L） 1μL
样品DNA(1～100 ng/μL) 2μL
ddH2O 5μL
所述的实时荧光PCR反应条件为95℃10min,1个循环；95℃，15s，60℃30s,40个循环,
所述的实时荧光PCR方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照，判定标准为:
空白对照:以ddH2O为模板,按照上述的实时荧光PCR反应体系和反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阴性对照:以非貉子源性物种基因组DNA为模板,按照所述的实时荧光PCR反应体系和反应条件，进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阳性对照:以貉子基因组DNA为模板,按照上述的实时荧光PCR反应体系和反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值小于或等于34;
待测样品貉子源性基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品未检出貉子源性基因;待测样品貉子源性基因检测Ct值小于或等于36，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品检出貉子源性基因;待测样品貉子源性基因检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于400且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品未检出貉子源性基因;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品检出貉子源性基因。
本发明提供了一种实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物、探针及具体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性，采用实时荧光PCR特异扩增法可以定性分析畜肉食品中是否含有貉子源性成分,发挥了实时荧光PCR检测技术的优点,进一步完善了食品检测体系,加大对消费者利益的保护力度。
附图说明
图1是本发明实施例1检测貉子源性成分阳性样品的荧光PCR扩增图；其中，1为貉子肉制品；2，3为貉子肉制品；
图2是本发明实施例2检测貉子源性成分阳性样品的荧光PCR扩增图；其中，1为貉子肉制品；2为貉子肉制品。
具体实施方式:
实施例1
1.所用引物和探针:
选择貉子线粒体d-loop 基因作为对象,设计并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针；
实时荧光PCR引物和探针序列包括:
上游引物P1: CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC;
下游引物P2:GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA;
探针: CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC,该探针的5.端用报告荧光染料FAM标记,3.端用淬灭荧光染料eclipse标记。
2.样品DNA的提取与纯化按以下步骤进行:
a.将含貉子源性成分的肉样品用组织匀浆器将样品打成匀浆,
取100mg匀浆加入1.0 mL CTAB裂解液及50 μL 蛋白酶K溶液，涡旋震荡30 s后，颠倒混合5 次，65 ℃水浴过夜（12h-16h）。室温12 000 r/min离心10 min，取上层溶液800 μL， 加入等体积的Tris饱和酚/三氯甲烷/异戊醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温12 000 r/min离心10 min ；取上层清液(水相)于一新离心管中，加入等体积的三氯甲烷，颠倒混匀，室温12 000 r/min离心10 min，取上清液600 μL。将上清液移至一新离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，4 ℃静置30 min ，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，小心弃去上清液，向沉淀加入500 μL 70% 冷乙醇，洗涤沉淀，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，小心倒出上清液，室温干燥后，将DNA溶于200 μL去离子水中，-20 ℃保存。
也可使用等效的商品化试剂盒提取模板DNA。
3.建立实时荧光PCR扩增反应体系
实时荧光PCR反应体系见表1
表 1 实时荧光PCR反应体系
在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备的模板DNA溶液，盖紧管，瞬离5 s～10 s。
将加好样后的反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置：95℃/10min ，1个循环；95℃/15s ，60℃/30s ，40个循环，在每次循环的60℃/30s时收集荧光。
检测结果后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。
4.所述确定质量控制指标
空白对照:以ddH20为模板,按照3所述条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40；
阴性对照:以非貉子源性物种基因组DNA为模板,按照3所述条件,
进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40；
阳性对照:以貉子基因组DNA为模板,按照3所述条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值小于或等于34。
6.结果判定:
待测样品貉子源性基因检测Ct值大于或等于40,阴性对照、阳性对照和空、白对照结果正常者,判定该样品未检出貉子源性成分;
待测样品貉子源性基因检测Ct值小于或等于36,阴性对照!阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品检出貉子源性成分。
待测样品貉子源性基因检测Ct值在36-40之间,重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常、判定该样品未检出貉子源性基因;再次扩增后结果Ct值仍小于40,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品检出貉子源性基因"每个试样须做2个平行实验。
7.检测结果:
本发明实施例1将待检貉子肉和貉子肉加工品样品提取DNA后,进行实时荧光PCR检测，经检测，含有貉子源性成分的貉子肉和貉子肉加工品显示如图1所示的阳性扩增曲线，表明该引物探针能对貉子源性成分进行良好扩增。
实施例2
取貉肉、貉肉制品、牛肉、猪肉、羊肉、猫肉、狗肉、鹿肉、骆驼肉、马肉、驴肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、水貂、狐狸等17种动物DNA进行实时荧光PCR检测，不含有貉子源性成分的样品中则无扩增信号，只有貉子肉有扩增信号，实例2表明本发明的引物和探针具有良好的特异性。结果见图2。
Claims (6)
1.实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物探针，分别为：
上游引物Pl：CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC；
下游引物P2：GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA；
带有荧光染料的探针序列为: CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC。
2.根据权利要求1所述的实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物探针，其特征在于：所述的荧光染料，5′端为FAM标记，3′端eclipse标记。
3.实时荧光PCR检测貉子源性成分的方法，其步骤如下：
a.提取待检样品基因组DNA；
b.以所提取的DNA作为模板,加入权利要求1所述的引物探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样品反应的Ct值。
4.根据权利要求3所述的实时荧光PCR检测貉子源性成分的方法，其特征在于：所述的实时荧光PCR反应体系为：
2×Real-time PCR预混液 10μL，
10 μmol/L上游引物1μL，
10 μmol/L下游引物 1μL，
10 μmol/L 探针 1μL，
1～100 ng/μL样品DNA 2μL，
ddH2O 5μL。
5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测貉子源性成分的方法，其特征在于：所述的实时荧光PCR反应条件为95℃10min,1个循环；95℃，15s，60℃30s,40个循环。
6.根据权利要求5所述的实时荧光PCR检测貉子源性成分的方法，其特征在于：所述的实时荧光PCR方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照，判定标准为:
空白对照:以ddH2O为模板,按照权利要求4所述的实时荧光PCR反应体系和权利要求5所述的实时荧光PCR反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阴性对照:以非貉子源性物种基因组DNA为模板,按照权利要求4所述的实时荧光PCR反应体系和权利要求5所述的实时荧光PCR反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值大于或等于40;
阳性对照:以貉子基因组DNA为模板,按照权利要求4所述的实时荧光PCR反应体系和权利要求5所述的实时荧光PCR反应条件,进行实时荧光PCR反应,检测Ct值小于或等于34;
待测样品貉子源性基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品未检出貉子源性基因;待测样品貉子源性基因检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品检出貉子源性基因;待测样品貉子源性基因检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品未检出貉子源性基因;再次扩增后结果Ct值仍小于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品检出貉子源性基因。
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