CN102586424A - 一种基于外源动物特征dna地沟油快速检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以样品油中外源动物特征DNA作为检测的靶标，构建地沟油快速、灵敏、特异的检测方法。以样品油中不应存在的动物外源成分作为地沟油的鉴别依据，以动物外源成分的线粒体特征DNA为检测的具体靶标。首先从样品油中获得线粒体DNA，并对提取的DNA进行检测或者对其信号扩增后检测。检测结果通过和阳性对照、阴性对照或者空白对照的检测值比较，从而有效的鉴别和检测地沟油。本发明将为食品安全部门快速准确地识别“地沟油”提供强有力的工具，对于保障食品安全具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测地沟油的方法，以样品油中不应存在的动物外源成分作为地沟油的鉴别依据，以动物外源成分的线粒体特征DNA为检测的具体靶标，构建地沟油快速、灵敏、特异的检测方法。
背景技术
目前，食品安全已成为社会关注的热点话题。其中，地沟油冒充食用油重新回流餐桌是其中一个突出的问题。
地沟油，也称潲水油、泔水油，是质量、卫生极差，过氧化值、酸值、水分、羰基价、丙二醛、AFB1等指标超标的非食用油。它一般分为3类：一是狭义的地沟油，即将下水道中的油腻漂浮物或者将宾馆、酒楼的剩饭、剩菜经过简单加工、提炼出的油；二是劣质猪肉、猪内脏、猪皮加工以及提炼后的油；三是用于油炸食品的油使用次数超过规定要求后，再被重复使用或往其中添加一些新油后重新使用的油。地沟油中重金属、毒素(如丙烯醛、黄曲霉毒素)、过氧化值等都严重超标，并含有洗涤剂等类化学杂质，对人体具有很大危害性，食用后会引起呕吐、头痛、腹泻等不良反应，长期摄入会使细胞功能衰竭，甚至可成为癌变诱因。因此，地沟油严禁在食品中使用。据估计，每年返回餐桌的地沟油约有200～300万吨之多，这对社会与食品安全都造成非常大的危害。
国外发达国家如美国、日本和欧盟等国家严格控制地沟油来源，只有专门公司才能进行回收，或者采取政府补贴回收方式，高价回收地沟油，使之不能流入市场或餐桌。除了严格控制回收渠道之外，他们还有完善处罚条例。由于国外制订了一系列法规，使地沟油很难再进入食用油市场，因此对于食用油中掺地沟油的检测研究很少。
目前国内对于地沟油的检测主要有以下方面：利用正常食用油与地沟油在理化分析指标上存在的差异，主要包括酸价、过氧化值、水分、碘值、皂化值等进行检测；利用地沟油在回收及加工过程中受到的重金属污染进行检测；利用地沟油中含有的动物油脂，通过检测胆固醇含量进行判定；利用电导率法进行鉴定，油脂属非导电物质，电导率极低，且钠盐难溶于油脂，在正常食用油中含量很少。地沟油中残渣微粒，含有一定量盐，还有酸败产生化合物也会使电导率提高；利用薄层色谱法对地沟油经高温加热或反复使用后产生的极性物质(如丙稀酰胺、多环芳烃、醛基等)进行检测，当油品有明显极性组分拖尾现象时，即可判别是否为劣质油；利用荧光法检测，考虑到地沟油外源性污染物质特性，针对餐具洗涤剂表面活性剂十二烷基苯磺酸钠混在地沟油里，而食用油不含这种人工合成化学物质，可利用十 二烷基苯磺酸钠在地沟油水相中特征荧光波峰为检测对象进行地沟油的检测。
由于地沟油的主要成分与食用油相同，仍然是“甘油三酯”，可以和食用油以任意比例互溶，单凭人的感官，地沟油的色、香、味与普通食用油几乎没有分别。由于来源多样、成分复杂，且勾兑比例不同，摆在专家面前的是千变万化的非标准样品，已很难通过感官分析和一些理化指标进行区分。即便是能探明底细的仪器也常常出现误判。
2011年，济南格林生物能源有限公司跨省生产销售地沟油案被公安部指挥破获后，2011年9月卫生部曾发布消息，全力组织科研攻关研究鉴别地沟油检验方法。卫生部征集到7家技术机构研制的5种地沟油检测方法，分别从多环芳烃、胆固醇、电导率和外源基因四大类核心指标对地沟油进行检测，经专家论证后，发现这些方法特异性都不强。
朱旭平等通过对样品油所含的外源动物基因进行荧光定量PCR检测的方法对地沟油进行了检测。其原理为：地沟油主要是由各种潲水、用于油炸食品中的油、劣质动物肉、内脏、毛皮等加工及提炼后产出的油炼制而成，这些原料在煎炸烹饪和回收过程中往往会含有一些动物性原料，因此含有其相应的核酸成分，如猪、牛和鱼类等哺乳动物的特征基因残留。目前市面上的合格食用油多为植物油，不存在动物性基因成分。因此，通过判断样品油中是否含有动物性基因成分，就可以推断该样品油是否为地沟油，或者样品油中是否混有地沟油。该检测方法在部分样品的检测中取得较好的效果，但地沟油的来源多样、加工工艺不同，有的地沟油经过高温、粉碎、搅拌等生产处理，细胞核基因组往往被破坏，因此，该方法采用细胞核基因组基因作为检测的对象，检测的特异性不强，无法达到地沟油有效鉴定的预期目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速特异检测地沟油的方法。
本发明所提供的方法，称为基于外源动物特征DNA地沟油快速检测的方法，包括以下内容：
1)动物特征DNA序列的确定
由于地沟油在回收和重新利用中往往经过高温、粉碎、搅拌等处理，细胞核基因组被破坏，采用细胞核基因组DNA指纹技术往往无法达到预期动物外源基因鉴定的目的。由于线粒体基因的多拷贝数、小分子量和结构稳定的特性，为实验研究和应用实践大开方便之门。目前，在国际上进行的动物性外源成分鉴定和物种分类技术中大都采用了线粒体DNA指纹技术或相关技术。在本研究中，以植物油中所不应该含有的动物性成分作为地沟油鉴别的外源动物物种，如食用油烹饪使用过程中常见的猪、牛和鱼类；或者含有某种动物油脂的调和油中， 以其所不含有的其他动物性成分作为地沟油鉴别的外源动物物种，如含有猪油的食用油中不会含有鱼类成分。参考相关文献，以外源动物物种线粒体的某些特征保守核酸成分作为地沟油外源动物的特征序列，作为地沟油识别、鉴定的依据。为了后续步骤对所选取DNA的有效扩增，一般选择100-300bp之间的扩增长度。
2)样品油中DNA成分的提取
地沟油经过回收、高温炼制等加工步骤后，所残留的核酸被严重破坏成碎片状，且含量极低。因此，DNA提取的过程对于后续的检测至关重要。地沟油的极性较正规的食用油大，这有利于更多DNA的溶解和提取。首先，利用DNA可溶于水溶液的特性，在样品油脂中加入一定体积的TE溶液进行洗涤，高速离心并舍弃上层油脂层后，提取DNA并用异丙醇沉淀DNA。沉淀的DNA经离心、70％乙醇洗涤并干燥后，加入TE溶液溶解DNA，保存以备下一步骤使用。
3)通过不同的方式对所获取的DNA进行扩增或者信号放大
利用荧光定量PCR对提取的外源动物DNA进行检测和鉴定。荧光定量PCR是一种实时的对目标DNA进行信号放大并灵敏检测的方法。利用荧光定量PCR扩增外源动物特征DNA后，根据Ct值来判断食用油中是否看有地沟油，或者根据标准品检测拟合的标准曲线来确定食用油中地沟油的含量。为了提高检测的有效性，减小误判的可能，还可以通过设计多组特异性引物同时进行PCR扩增和检测。
荧光定量PCR具有高灵敏性的特点，但操作的同时容易出现一些假阳性信号，对操作要求比较高。另外，荧光定量PCR仪在检测机构也没有普及。这些因素都影响了检测便利性。生物条形码扩增目标DNA是一种灵敏高效的以物理方式扩增目标信号的方法，相比于PCR等生物扩增DNA信号方法，它有简洁高效的优点。自2003年Mirkin等人首先运用以来，已形成一个新的检测方法领域。通过生物条形码的扩增方式，一个目标DNA将对应上百万的生物条形码DNA，实现目标DNA的信号放大。下一步骤，可以利用纳米金比色的方法对收集的生物条形码DNA进行检测。首先提供结合有DNA的纳米金溶液，其中第一纳米金颗粒探针包含有与条形码DNA的一个末端互补的捕获DNA；第二纳米金颗粒探针包含有与条形码DNA的另一相对末端互补的捕获DNA；将条形码DNA接触溶液并使条形码DNA与第一和第二颗粒探针杂交，由此第一和第二颗粒探针聚集成聚集物，其中溶液中由酒红到蓝色的颜色改变表示所述聚集物的形成，目测所述溶液中的颜色改变程度可以判断样品油中外源动物DNA的数量，进而判断样品油中地沟油的成分多少。
上述的两种检测样品油中外源特征线粒体DNA方法，都可以在较短的时间内完成，实现地沟油的快速检测。
本发明所提供的方法，突破现有国内地沟油检测方法利用正常食用油与地沟油在理化分析指标上存在差异的局限，转换检测的理念和检测对象，以样品油中外源动物线粒体特征DNA为检测对象，建立快速灵敏检测地沟油的新方法。该检测方法具有以下的优点：
一、由于线粒体基因的多拷贝数、小分子量和结构稳定的特性，对组织样品要求极宽松，对DNA样品要求极微量；
二、相对于重金属、十二烷基苯磺酸钠等地沟油外源检测成分无法实现信号扩增的缺点，以外源特征DNA作为检测的靶标，可以用各种检测DNA的方法对外源特征DNA进行有效的信号放大，提高检测的灵敏度。
因此，通过扩增并检测地沟油中的外源动物线粒体特征DNA成分，将会是一种灵敏、有效的鉴别地沟油的方法。
附图说明
附图1为：一种基于外源动物特征线粒体DNA快速检测地沟油方法的原理图
附图2为：PCR检测地沟油结果的电泳图
附图3为：荧光定量PCR检测地沟油原理图
附图4为：荧光定量PCR检测地沟油的结果图
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1以外源动物特征DNA为检测靶标，荧光定量PCR法检测地沟油
1、动物特有线粒体基因片段的筛选
经过BLAST与GenBank数据库现有数据进行对比，筛选出能代表鱼和哺乳动物的特征线粒体DNA片段，其序列与常用植物食用油来源花生、芝麻、大豆、油菜的线粒体DNA有较大差别。
2、实时荧光定量PCR引物的设计
1)利用1获取的保守区域设计引物探针
2)在多序列对比文件中验证引物探针的保守性
3)通过BLAST验证引物探针的特异性
4)最终获取理想的引物探针序列为：
第一对引物：
1U-F(25bases)：5′AAG ACG AGA AGA CCC TTG GAC TTT A-3′；
2U-R(24bases)：5′GAT TGC GCT GTT ATC CCT AGG GTA-3′
其为多种哺乳动物的通用引物，扩增产物随样品的不同而长度不等，约为234-265bp。
第二对引物：
3F-F(22bases)：5’-GAT AAC AGC GCA ATC CTC TCC C-3’
4F-R(22bases)：5’-CAA ACG AAC CCT TAA TAG CGG C-3’
其为鱼类通用引物，扩增产物大小为107bp。
为验证我们方法的特异性，我们合成申请号为201010225657.X的专利中引物作为参照，此引物为扩增地沟油中外源动物细胞核基因组中的特定基因片段：
第三对引物：
F(20bases)：5′-TCTTGCAAATCCTAACAGGC-3′
R(20bases)：5′-CGTTTTGCATGTAGATAGCGA-3′
3、地沟油检测
我们分别以可能含有牛、鱼的特征DNA的泔水油，经过地沟油自制处理，作为待测样品，未使用过的花生油为阴性对照。
3.1泔水油自制处理：将100mL泔水置于烧杯中，加热至50℃降低其粘性，沉淀取上层油样。将油样放置70℃水浴，加无机盐溶液洗涤、去水层，然后经过脱水处理，收集最终地沟油油样。
3.2地沟油所含DNA的抽提：在10mL EP管中加入8mL食用油及1mL TE缓冲液，颠倒混匀5min，室温下离心10000r/min 10min，去除上层油脂层，取水相用于提取DNA。在制样获取的水相中，加入100μL 20％SDS溶液，混匀，65℃保温10min，并不时摇动；加入300μL5mol/L KAc，混匀，置冰上20min～30min；4℃10000r/min离心20min，转移上清到另一离心管中，加入1倍体积的异丙醇混匀，-20℃沉淀过夜；12000r/min离10min回收DNA沉淀；用1mL 70％乙醇洗一次后，吹干，加入40μL无菌水溶解DNA，4℃保存备用。
3.3检测：用琼脂糖电泳与实时荧光定量PCR进行检测
3.3.1普通PCR反应体系：
20μL反应体系
PCR反应程序为：
引物采用2中设计的引物进行PCR反应，用1％的琼脂糖电泳验证PCR产物。
3.3.2RT-PCR反应体系：
20μL反应体系
PCR反应程序及检测参数：
设定72℃采集荧光信号。
引物采用2中设计的引物进行实时荧光定量PCR检测。
3.3.3结果判定：
琼脂糖电泳结果判定：电泳中样品相对位置有对应条带，表示待测样品中含有动物外源特征DNA，没有相应的DNA条带表示待测样品中没有动物外源特征DNA，也就是不含地沟油或地沟油含量低于检测限。
荧光定量PCR结果判定：以Ct值的大小与荧光值的变化作为实验结果的判定依据，阴性与阳性Ct值与荧光值应有明显区别。
3.4检测结果：以两种待测样品为模板进行PCR扩增，电泳验证扩增效果，实验结果如下。
| 组别 | 待测样品1 | 待测样品2 | 阴性对照 |
| 第一对引物 | 阳性 | - | 阴性 |
| 第二对引物 | - | 阳性 | 阴性 |
| 第三对引物 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
如附图2所示，以未使用的花生油为模板，2中涉及的三对引物进行PCR扩增(1-3泳道)没有扩增产物，即检测结果为阴性。以待测样品1为模板，2中第一对与第三对引物进行PCR扩增(4-5泳道)，泳道4在250bp附近有一条明显的DNA条带，说明有特异性产物产生，检测结果为阳性；泳道5检测结果则为阴性。以待测样品2为模板，2中第二对与第三对引物进行PCR扩增(6-7泳道)，泳道6的条带略高于其他条带，而由于实施例2中的第二对引物扩增产物为107bp，符合电泳结果，检测结果为阳性。
以附图2中样品进行荧光定量PCR，实验结果如下。
| 扩增曲线 | Ct值 |
| 1 | 34.08 |
| 2 | 32.95 |
| 3 | 35.00 |
| 4 | 23.23 |
| 5 | 33.67 |
| 6 | 21.56 |
| 7 | 34.35 |
如附图4所示，PCR扩增曲线1-3为阴性对照(泳道1-3)，其Ct值在32-35之间，荧光值变化很不明显，检测结果为阴性。附图2中泳道4、6的样品荧光定量PCR扩增曲线(4、6)，Ct值约为20-25左右，与阴性对照的Ct值相差约10，差别明显，且扩增曲线4、6有明显的荧光变化，判定检测结果为阳性；而同一样品用专利中引物(泳道5、7)进行荧光定量PCR(扩增曲线5、7)时，Ct值与阴性对照接近，荧光值变化微小，因此判定检测结果为阴性。此结果表明，以地沟油中外源动物线粒体DNA为检测的特定靶标，结果更加可靠。
上述实验结果表明，针对不同的油样，Ct值有一定的差别，但是与阴性对照相比有明显的区别，证明本实验方法可以用于地沟油的检测。
Claims (9)
1.一种以外源动物线粒体特征DNA为靶标，检测鉴别地沟油的方法。
步骤包括：
(a)筛选线粒体的特征保守核酸成分作为地沟油外源动物的特征序列，作为地沟油识别、鉴定的依据。
(b)从样品油中获得DNA。
(c)对获得的DNA进行扩增或者以样品油中DNA作为识别分子引发识别信号的扩增。
(d)检测步骤(b)获得的DNA，或检测步骤(c)扩增后的DNA，或者检测以步骤(b)为识别基础的扩增信号。
(e)与对照结果相比较，以获得检测和鉴定的结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以样品油中不应存在的动物外源成分作为地沟油的鉴别依据，以动物外源成分的线粒体特征DNA为检测的具体靶标。“外源动物”的意义包括：植物油中不应含有的动物性成分，或者含有确定动物物种油脂的食用油中所不应含有的其他动物物种成分。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中作为地沟油检测靶标的特征DNA位于动物的线粒体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中“特征DNA”的意义在于选用的DNA在生物学分类等级界、门、纲、目、科、属、种的其中一个层次上具有保守性，能体现这层次的特征。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中所选用的能体现外源动物物种的特征DNA其长度为10-2000碱基。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中DNA的获得包括分离、提取、杂交、钓取手段。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：对步骤(b)中获得的DNA进行扩增，包括：PCR、荧光定量PCR、滚环复制、切刻酶-聚合酶连用手段。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以步骤(b)中获得的DNA为识别的信号，进行识别信号的扩增，包括：生物条形码放大、杂交链式反应手段。
9.如权利要求1-9任一权利要求所述检测地沟油的方法用于定性或者定量检测、鉴别食用油是否含有地沟油的用途。
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