CN104328193A - 一种用于地沟油检测的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于地沟油检测的试剂盒，该试剂盒包括由外引物Ⅰ、外引物Ⅱ、内引物Ⅰ和内引物Ⅱ配制而成的检测引物溶液；具有链置换活性的BstDNA聚合酶；10×反应缓冲液；dNTPs溶液；阳性DNA对照样品；阴性DNA对照样品。同时本发明还公开了该试剂盒的检测方法。本发明具有高特异性，且具有快速高效、操作简便，检测成本低的特点，适合现场快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种用于地沟油检测的试剂盒及其检测方法。
背景技术
地沟油是一种卫生极差，过氧化值、酸价、水分、羰基价、丙二醛、黄曲霉毒素等严重超标的非食用油。产生途径主要有以下几种：一是由下水道的一些油腻漂浮物，还有餐厨废弃油中的一些油腻物质，经过简单的加工提炼而来；还有一种是从动物内脏等组织提炼出来的油脂；其三就是经过反复油炸的油脂。地沟油中如黄曲霉素、苯并(a)芘、反式脂肪酸等各种有毒物质，长期食用对人体伤害很大，严重威胁这人类的健康。近年来，国内有关地沟油的报道以及地沟油引起的食品安全问题引起了人们的高度关注。
国外对地沟油检测方法报道较少，但由于制订一系列法规，使地沟油很难再进入食用油市场，研究主要关注废弃油脂综合利用及食用油掺伪和种类区分。
近年来，各种地沟油的检测方法层出不群，2011年 12月，卫生部向社会广泛公开征集“地沟油”检测方法，共收到762份关于检验方法或检验指标的建议。其中，有281个单位和个人提交了315项“地沟油”检测方法，组建了包括油脂加工、食品安全、卫生检验、化学分析等领域权威专家和相关机构在内的检验方法论证专家组，通过盲样测试等方式对征集到的方法进行了科学论证，发现这些方法特异性都不强。
朱旭平等通过对样品油所含的外源动物基因进行荧光定量 PCR 检测的方法对地沟油进行了检测。其原理为：地沟油主要是由各种潲水、用于油炸食品中的油、劣质动物肉、内脏、毛皮等加工及提炼后产出的油炼制而成， 这些原料在煎炸烹饪和回收过程中往往会含有一些动物性原料，因此含有其相应的核酸成分，如猪、牛和鱼类等哺乳动物的特征基因残留。目前市面上的合格食用油多为植物油，不存在动物性基因成分。因此，通过判断样品油中是否含有动物性基因成分，就可以推断该样品油是否为地沟油，或者样品油中是否混有地沟油。该检测方法在部分样品的检测中取得较好的效果，但地沟油的来源多样、加工工艺不同，有的地沟油经过高温、粉碎、搅拌等生产处理，细胞核基因组往往被破坏，因此，该方法采用细胞核基因组基因作为检测的对象，检测的特异性不强，无法达到地沟油有效鉴定的预期目的。
专利（201110456243.2）以样品油中不应存在的动物外源成分作为地沟油的鉴别依据，以动物外源成分的线粒体特征 DNA 为检测的具体靶标，建立了基于此原理的荧光定量PCR扩增技术检测线粒体DNA地沟油的方法。但该方法操作繁琐、需要专门的特殊仪器，不适合现场快速检测。
LAMP 技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件（60~65℃）进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在1h 内完成；③高特异性：针对靶标序列6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：扩增产物有多种鉴定方法，如肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化、 加入染料观察颜色变化等。
LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点、不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测动物线粒体特征DNA序列、引物组，构建地沟油的检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、高效的用于地沟油检测的试剂盒。
本发明所要解决的另一个技术问题是该用于地沟油检测的试剂盒的检测方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，包括
—检测引物溶液：由浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅰ、浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅱ、浓度为32~48 μmol/L的内引物Ⅰ和浓度为32~48μmol/L的内引物Ⅱ配制而成；
—具有链置换活性的Bst DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；
—10×反应缓冲液：由200 mmol/L且pH= 8.8的Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，40~100 mmol/L MgSO4，6~14 mol/L 甜菜碱混合而成；
—dNTPs 溶液：由浓度分别为10 mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
—阳性 DNA 对照样品：含有脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的大肠杆菌质粒 DNA，或者食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼的总DNA样品；
—阴性 DNA 对照样品：不含脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的 DNA。
所述脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1第1位到259位所示。
所述外引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2第1位到18位所示。
所述外引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3第1位到18位所示。
所述内引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4第1位到44位所示。
所述内引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5第1位到46位所示。
该试剂盒还包括显色剂1000×SYBR GREEN I 荧光染料。
如上所述的一种用于地沟油检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
⑴提取待测样品DNA：
在2mL离心管Ⅰ中加入400μL TE缓冲液，然后加入食用油1mL，漩涡震荡混匀3~8min，室温下13000r/min离心5min，去除上层油脂，留下层水相，在所述离心管Ⅰ中再次加入食用油1mL，颠倒混匀，离心，共重复5~20次，所得水相即为待测样品DNA；
⑵配制待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅰ内加入所述待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑶配制对照样品的LAMP检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅱ内加入阳性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
在 200 μL PCR反应管Ⅲ内加入阴性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑷分别对所述PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ进行LAMP扩增反应：60~65℃孵育20~60min，80℃孵育5min终止反应；
⑸LAMP 扩增结果的鉴定：通过肉眼观察或利用浊度仪分别观察所述PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或取 2~5 μL 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
⑹当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；
⑺当检测结果为阴性时，若所述待测样品DNA的浓度偏差小于同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度的1%时，则判定样品为地沟油；
⑻当检测结果为阴性时，若所述待测样品DNA的浓度与同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度相等时，则将所述待测样品DNA转移至离心管Ⅱ中；
⑼在所述离心管Ⅱ中加入100μL 20% SDS，混匀后经65℃水浴10min，期间颠倒数次；然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到上清液Ⅰ，该上清液Ⅰ移至离心管Ⅲ中；
⑽在所述离心管Ⅲ中加入等体积的Tris和苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后静置10min，室温下13000r/min离心5min，得到上清液Ⅱ，该上清液Ⅱ移至离心管Ⅳ中；所述苯酚-氯仿-异戊醇混合液是指将苯酚、氯仿、异戊醇按25 mL：24 mL：1 mL的体积比混合而成的溶液；
在所述离心管Ⅳ中，按所述上清液Ⅱ的体积的0.7倍加入异丙醇，颠倒混匀后于-20℃冰箱静置过夜沉淀DNA，然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到沉淀物；该沉淀物用体积浓度为70%的乙醇洗涤2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50μL TE缓冲液溶解，-20℃保存，即得纯化的待测样品DNA；
⑾配制纯化的待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅳ内加入所述纯化的待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑿分别将所述PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ、PCR反应管Ⅳ重复所述步骤⑷~⑸，当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；当检测结果为阴性时，即判定样品为市售标准油脂。
如上所述的一种用于地沟油检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
⑴提取待测样品DNA：
在2mL离心管Ⅰ中加入400μL TE缓冲液，然后加入食用油1mL，漩涡震荡混匀3~8min，室温下13000r/min离心5min，去除上层油脂，留下层水相，在所述离心管Ⅰ中再次加入食用油1mL，颠倒混匀，离心，共重复5~20次，所得水相即为待测样品DNA；
⑵配制待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅰ内加入所述待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑶配制对照样品的LAMP检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅱ内加入阳性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
在 200 μL PCR反应管Ⅲ内加入阴性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑷分别对所述PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ进行LAMP扩增反应：60~65℃孵育20~60min，80℃孵育5min终止反应；
⑸LAMP 扩增结果的鉴定：在LAMP扩增产物中加入1~2 μL 显色剂，混匀，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果；
⑹当出现绿色，则为阳性，即判定样品为地沟油；
⑺当出现橙色，则为阴性，若所述待测样品DNA的浓度偏差小于同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度的1%时，则判定样品为地沟油；
⑻当出现橙色，则为阴性，若所述待测样品DNA的浓度与同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度相等时，则将所述待测样品DNA转移至离心管Ⅱ中；
⑼在所述离心管Ⅱ中加入100μL 20% SDS，混匀后经65℃水浴10min，期间颠倒数次；然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到上清液Ⅰ，该上清液Ⅰ移至离心管Ⅲ中；
⑽在所述离心管Ⅲ中加入等体积的Tris和苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后静置10min，室温下13000r/min离心5min，得到上清液Ⅱ，该上清液Ⅱ移至离心管Ⅳ中；所述苯酚-氯仿-异戊醇混合液是指将苯酚、氯仿、异戊醇按25 mL：24 mL：1 mL的体积比混合而成的溶液；
在所述离心管Ⅳ中，按所述上清液Ⅱ的体积的0.7倍加入异丙醇，颠倒混匀后于-20℃冰箱静置过夜沉淀DNA，然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到沉淀物；该沉淀物用体积浓度为70%的乙醇洗涤2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50μL TE缓冲液溶解，-20℃保存，即得纯化的待测样品DNA；
⑾配制纯化的待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅳ内加入所述纯化的待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑿分别将所述PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ、PCR反应管Ⅳ重复所述步骤⑷~⑸，当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；当检测结果为阴性时，即判定样品为市售标准油脂。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、由于线粒体DNA具有分子量小、拷贝数多和结构稳定等特点，因此，本发明中的脊椎动物线粒体高度保守DNA序列可作为动物性外源成分鉴定和物种分类等技术的理想靶基因。
2、本发明中脊椎动物线粒体高度保守DNA序列仅存在于脊椎动物，而在细菌、古菌、真菌和绿色植物线粒体中则不存在，因此，作为LAMP技术检测地沟油识别、鉴定的依据，使本发明的检测试剂盒检测地沟油的准确率更高。
3、本发明以样品中不应存在的动物源性成分作为鉴别依据，以动物线粒体DNA为检测靶标，试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性，且具有快速高效、操作简便，在不到 1 小时即可完成检测。
4、本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低，适合现场快速检测。
5、本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从 dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。
6、利用环介导等温扩增技术（LAMP）技术检测地沟油，本发明试剂盒及检测方法具有很好的通用性和特异性。
⑴测试样品：分别含有食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼等动物的总DNA样品的大豆油；市场上常见的大豆油、花生油、玉米油、橄榄油和2种植物调调和油；2种模拟地沟油样品。
用实施例1~2中所述试剂盒及检测方法进行试验，测试结果显示所有含有动物的总DNA样品的大豆油（1、2、3、4、5、6）和阳性对照（P）反应管显现出典型扩增曲线，肉眼观察有沉淀产生，表明含有动物源性成分，是地沟油；市场上常见的大豆油（7）、花生油（8）、玉米油（9）、橄榄油（10）和3种植物调和油（11、12、13）和阴性对照（N）显现橙色一致，无典型扩增曲线，肉眼观察无沉淀产生，表明不含有动物源性成分（参见图1）。
⑵测试样品：分别含有食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼等动物的总DNA样品的大豆油；市场上常见的大豆油、花生油、玉米油、橄榄油和2种植物调和油；2种模拟地沟油样品。
用实施例3~4中所述试剂盒及检测方法进行试验，测试结果显示所有含有动物的总DNA样品的大豆油和2种模拟地沟油样品反应管显现绿色，市场上常见的大豆油、花生油、玉米油、橄榄油和2种植物调和油显现橙色（参见图2）。
5、经测试，本发明试剂盒及检测方法的灵敏度可达0.01 ng/μL。
测试样品为含有牛总DNA的大豆油样品所提DNA样品依次稀释而成。样品中牛总DNA的浓度分别为：160ng/μL、80 ng/μL、40 ng/μL、20 ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL和0.0001ng/μL。
样品中牛总DNA的浓度分别为160ng/μL（-2）、80 ng/μL（-3）、40 ng/μL（-4）、20 ng/μL（-5）、10ng/μL（-6）、1ng/μL（-7+）、0.1ng/μL（-8+）、0.01ng/μL（-9+）和阳性对照（P）的测试反应管中均呈现绿色，而0.001ng/μL（-10-）、0.0001ng/μL（-11-）和阴性对照（N）显现橙色（参见图3）。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明LAMP检测（无显色剂）方法的通用性和特异性实验结果图。
图2为本发明LAMP检测（有显色剂）方法的通用性和特异性实验结果图。
图3为本发明LAMP灵敏度检测结果图。图中管子上方：N为阴性对照；P为阳性对照；数字表示10×梯度稀释倍数。
具体实施方式
实施例1 一种用于地沟油检测的试剂盒，包括
—检测引物溶液：由浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅰ、浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅱ、浓度为32~48 μmol/L的内引物Ⅰ和浓度为32~48μmol/L的内引物Ⅱ配制而成；
—具有链置换活性的Bst DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；
—10×反应缓冲液：由200 mmol/L且pH= 8.8的Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，40~100 mmol/L MgSO4，6~14 mol/L 甜菜碱混合而成；
—dNTPs 溶液：由浓度分别为10 mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
—阳性 DNA 对照样品：含有脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的大肠杆菌质粒 DNA，或者食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼的总DNA样品；
—阴性 DNA 对照样品：不含脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的 DNA。
其中：
脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1第1位到259位所示。
外引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2第1位到18位所示。
外引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3第1位到18位所示。
内引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4第1位到44位所示。
内引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5第1位到46位所示。
实施例2 一种用于地沟油检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
⑴提取待测样品DNA：
在2mL离心管Ⅰ中加入400μL TE缓冲液，然后加入食用油1mL，漩涡震荡混匀3~8min，室温下13000r/min离心5min，去除上层油脂，留下层水相，在离心管Ⅰ中再次加入食用油1mL，颠倒混匀，离心，共重复5~20次，所得水相即为待测样品DNA；
⑵配制待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅰ内加入待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑶配制对照样品的LAMP检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅱ内加入阳性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
在 200 μL PCR反应管Ⅲ内加入阴性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑷分别对PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ进行LAMP扩增反应：60~65℃孵育20~60min，80℃孵育5min终止反应；
⑸LAMP 扩增结果的鉴定：通过肉眼观察或利用浊度仪分别观察PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或取 2~5 μL 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
⑹当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；
⑺当检测结果为阴性时，若待测样品DNA的浓度偏差小于同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度的1%时，则判定样品为地沟油；
⑻当检测结果为阴性时，若待测样品DNA的浓度与同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度相等时，则将所测样品DNA转移至离心管Ⅱ中；
⑼在离心管Ⅱ中加入100μL 20% SDS，混匀后经65℃水浴10min，期间颠倒数次；然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到上清液Ⅰ，该上清液Ⅰ移至离心管Ⅲ中；
⑽在离心管Ⅲ中加入等体积的Tris和苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后静置10min，室温下13000r/min离心5min，得到上清液Ⅱ，该上清液Ⅱ移至离心管Ⅳ中；苯酚-氯仿-异戊醇混合液是指将苯酚、氯仿、异戊醇按25 mL：24 mL：1 mL的体积比混合而成的溶液；
在离心管Ⅳ中，按上清液Ⅱ的体积的0.7倍加入异丙醇，颠倒混匀后于-20℃冰箱静置过夜沉淀DNA，然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到沉淀物；该沉淀物用体积浓度为70%的乙醇洗涤2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50μL TE缓冲液溶解，-20℃保存，即得纯化的待测样品DNA；
⑾配制纯化的待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅳ内加入纯化的待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑿分别将PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ、PCR反应管Ⅳ重复步骤⑷~⑸，当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；当检测结果为阴性时，即判定样品为市售标准油脂。
实施例3 一种用于地沟油检测的试剂盒，包括
—检测引物溶液：由浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅰ、浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅱ、浓度为32~48 μmol/L的内引物Ⅰ和浓度为32~48μmol/L的内引物Ⅱ配制而成；
—具有链置换活性的Bst DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；
—10×反应缓冲液： 200 mmol/L且pH= 8.8的Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，40~100 mmol/L MgSO4，6~14 mol/L 甜菜碱；
—dNTPs 溶液：由浓度分别为10 mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
—阳性 DNA 对照样品：含有脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的大肠杆菌质粒 DNA，或者食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼的总DNA样品；
—阴性 DNA 对照样品：不含脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的 DNA
—显色剂：1000×SYBR GREEN I 荧光染料。
其中：
脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1第1位到259位所示。
外引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2第1位到18位所示。
外引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3第1位到18位所示。
内引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4第1位到44位所示。
内引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5第1位到46位所示。
实施例4 一种用于地沟油检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
⑴提取待测样品DNA：
在2mL离心管Ⅰ中加入400μL TE缓冲液，然后加入食用油1mL，漩涡震荡混匀3~8min，室温下13000r/min离心5min，去除上层油脂，留下层水相，在所述离心管Ⅰ中再次加入食用油1mL，颠倒混匀，离心，共重复5~20次，所得水相即为待测样品DNA；
⑵配制待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅰ内加入所述待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑶配制对照样品的LAMP检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅱ内加入阳性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
在 200 μL PCR反应管Ⅲ内加入阴性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑷分别对PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ进行LAMP扩增反应：60~65℃孵育20~60min，80℃孵育5min终止反应；
⑸LAMP 扩增结果的鉴定：在LAMP扩增产物中加入1~2 μL 显色剂，混匀，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果；
⑹当出现绿色，则为阳性，即判定样品为地沟油；
⑺当出现橙色，则为阴性，若待测样品DNA的浓度偏差小于同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度的1%时，则判定样品为地沟油；
⑻当出现橙色，则为阴性，若待测样品DNA的浓度与同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度相等时，则将待测样品DNA转移至离心管Ⅱ中；
⑼在离心管Ⅱ中加入100μL 20% SDS，混匀后经65℃水浴10min，期间颠倒数次；然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到上清液Ⅰ，该上清液Ⅰ移至离心管Ⅲ中；
⑽在离心管Ⅲ中加入等体积的Tris和苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后静置10min，室温下13000r/min离心5min，得到上清液Ⅱ，该上清液Ⅱ移至离心管Ⅳ中；苯酚-氯仿-异戊醇混合液是指将苯酚、氯仿、异戊醇按25 mL：24 mL：1 mL的体积比混合而成的溶液；
在离心管Ⅳ中，按上清液Ⅱ的体积的0.7倍加入异丙醇，颠倒混匀后于-20℃冰箱静置过夜沉淀DNA，然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到沉淀物；该沉淀物用体积浓度为70%的乙醇洗涤2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50μL TE缓冲液溶解，-20℃保存，即得纯化的待测样品DNA；
⑾配制纯化的待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅳ内加入纯化的待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑿分别将PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ、PCR反应管Ⅳ重复所述步骤⑷~⑸，当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；当检测结果为阴性时，即判定样品为市售标准油脂。
应该理解，这里讨论的实施例和实施方案只是为了说明，对熟悉该领域的人可以提出各种改进和变化，这些改进和变化将包括在本申请的精神实质和范围以及所附的权利要求范围内。
SEQ ID NO.1
1 CAATAGGGTT TACGACCTCG ATGTTGGATC AGGACATCCC AATGGTGCAG CCGCTATTAA
61 AGGTTCGTTT GTTCAACGAT TAAAGTCCTA CGTGATCTGA GTTCAGACCG GAGTAATCCA 121 GGTCGGTTTC TATCTACTTC AAATTCCTCC CTGAACGAAA GGACAAGAGA AATAAGGCCT 181 ACTTCACAAA GCGCCTTCCC CCGTAAATGA TATCATCTCA ACTTAGTATT ATACCCACAC 241 CCACCCAAGA ACAGGGTTT
SEQ ID NO.2
1 TTACGACCTC GATGTTGG
SEQ ID NO.3
1 ATCATTTACG GGGGAAGG
SEQ ID NO.4
1 ACGTAGGACT TTAATCGTTG AACAAATCAG GACATCCCAA TGGT
SEQ ID NO.5
1 GATCTGAGTT CAGACCGGAG TAATCCTTAT TTCTCTTGTC CTTTCG
Claims (9)
1.一种用于地沟油检测的试剂盒，包括
—检测引物溶液：由浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅰ、浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅱ、浓度为32~48 μmol/L的内引物Ⅰ和浓度为32~48μmol/L的内引物Ⅱ配制而成；
—具有链置换活性的Bst DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；
—10×反应缓冲液：由200 mmol/L且pH= 8.8的Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，40~100 mmol/L MgSO4，6~14 mol/L 甜菜碱混合而成；
—dNTPs 溶液：由浓度分别为10 mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
—阳性 DNA 对照样品：含有脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的大肠杆菌质粒 DNA，或者食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼的总DNA样品；
—阴性 DNA 对照样品：不含脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的 DNA。
2.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于：所述脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1第1位到259位所示。
3.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于：所述外引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2第1位到18位所示。
4.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于：所述外引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3第1位到18位所示。
5.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于：所述内引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4第1位到44位所示。
6.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于：所述内引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5第1位到46位所示。
7.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括显色剂1000×SYBR GREEN I 荧光染料。
8.如权利要求1所述的一种用于地沟油检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
⑴提取待测样品DNA：
在2mL离心管Ⅰ中加入400μL TE缓冲液，然后加入食用油1mL，漩涡震荡混匀3~8min，室温下13000r/min离心5min，去除上层油脂，留下层水相，在所述离心管Ⅰ中再次加入食用油1mL，颠倒混匀，离心，共重复5~20次，所得水相即为待测样品DNA；
⑵配制待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅰ内加入所述待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑶配制对照样品的LAMP检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅱ内加入阳性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
在 200 μL PCR反应管Ⅲ内加入阴性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑷分别对所述PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ进行LAMP扩增反应：60~65℃孵育20~60min，80℃孵育5min终止反应；
⑸LAMP 扩增结果的鉴定：通过肉眼观察或利用浊度仪分别观察所述PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或取 2~5 μL 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
⑹当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；
⑺当检测结果为阴性时，若所述待测样品DNA的浓度偏差小于同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度的1%时，则判定样品为地沟油；
⑻当检测结果为阴性时，若所述待测样品DNA的浓度与同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度相等时，则将所述待测样品DNA转移至离心管Ⅱ中；
⑼在所述离心管Ⅱ中加入100μL 20% SDS，混匀后经65℃水浴10min，期间颠倒数次；然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到上清液Ⅰ，该上清液Ⅰ移至离心管Ⅲ中；
⑽在所述离心管Ⅲ中加入等体积的Tris和苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后静置10min，室温下13000r/min离心5min，得到上清液Ⅱ，该上清液Ⅱ移至离心管Ⅳ中；所述苯酚-氯仿-异戊醇混合液是指将苯酚、氯仿、异戊醇按25 mL：24 mL：1 mL的体积比混合而成的溶液；
在所述离心管Ⅳ中，按所述上清液Ⅱ的体积的0.7倍加入异丙醇，颠倒混匀后于-20℃冰箱静置过夜沉淀DNA，然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到沉淀物；该沉淀物用体积浓度为70%的乙醇洗涤2次，最后，沉淀物自然晾干，并加50μL TE缓冲液溶解，-20℃保存，即得纯化的待测样品DNA；
⑾配制纯化的待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅳ内加入所述纯化的待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑿分别将所述PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ、PCR反应管Ⅳ重复所述步骤⑷~⑸，当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；当检测结果为阴性时，即判定样品为市售标准油脂。
9.如权利要求7所述的一种用于地沟油检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
⑴提取待测样品DNA：
在2mL离心管Ⅰ中加入400μL TE缓冲液，然后加入食用油1mL，漩涡震荡混匀3~8min，室温下13000r/min离心5min，去除上层油脂，留下层水相，在所述离心管Ⅰ中再次加入食用油1mL，颠倒混匀，离心，共重复5~20次，所得水相即为待测样品DNA；
⑵配制待测样品的 LAMP 检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅰ内加入所述待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑶配制对照样品的LAMP检测反应体系：
在 200 μL PCR反应管Ⅱ内加入阳性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
在 200 μL PCR反应管Ⅲ内加入阴性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；
⑷分别对所述PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ进行LAMP扩增反应：60~65℃孵育20~60min，80℃孵育5min终止反应；
⑸LAMP 扩增结果的鉴定：在LAMP扩增产物中加入1~2 μL 显色剂，混匀，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果；
⑹当出现绿色，则为阳性，即判定样品为地沟油；
⑺当出现橙色，则为阴性，若所述待测样品DNA的浓度偏差小于同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度的1%时，则判定样品为地沟油；
⑻当出现橙色，则为阴性，若所述待测样品DNA的浓度与同等条件下市售标准油脂样品处理后的浓度相等时，则将所述待测样品DNA转移至离心管Ⅱ中；
⑼在所述离心管Ⅱ中加入100μL 20% SDS，混匀后经65℃水浴10min，期间颠倒数次；然后在温度为4℃、速率为13000r/min的条件下离心10 min，得到上清液Ⅰ，该上清液Ⅰ移至离心管Ⅲ中；
⑽在所述离心管Ⅲ中加入等体积的Tris和苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后静置10min，室温下13000r/min离心5min，得到上清液Ⅱ，该上清液Ⅱ移至离心管Ⅳ中；所述苯酚-氯仿-异戊醇混合液是指将苯酚、氯仿、异戊醇按25 mL：24 mL：1 mL的体积比混合而成的溶液；
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⑿分别将所述PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ、PCR反应管Ⅳ重复所述步骤⑷~⑸，当检测结果为阳性时，即判定样品为地沟油；当检测结果为阴性时，即判定样品为市售标准油脂。
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