CN105331700A - 南美白对虾中副溶血性弧菌分子预测模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南美白对虾中副溶血性弧菌分子预测模型的构建方法；所述构建方法包括如下步骤：生鲜南美白对虾的采样和贮藏；生鲜南美白对虾的处理；生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌的活菌定量测定；根据副溶血性弧菌的活菌定量测定值构建一级模型和二级模型；对所述一级模型和二级模型进行验证。本发明还提供了一种如前述的南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌分子预测微生物模型的构建方法，该构建方法基于分子生物学技术，可用于生鲜南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌行为变化的预测。本发明填补了虾中副溶血性弧菌的预测微生物模型的空白，可为副溶血性弧菌行为变化的研究及副溶血性弧菌定量微生物风险评估提供有效的数据基础。

Description

南美白对虾中副溶血性弧菌分子预测模型的构建方法

技术领域

本发明涉及一种生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌分子预测模型的构建方法及应用，属于食品微生物学技术领域。

背景技术

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分别于河口和海洋环境中，食用被该菌污染的水产品，极易导致严重的急性肠胃炎，并伴随有恶心、头疼、低烧等症状，该菌引起的食物中毒在中国已高居微生物性食物中毒的首位。南美白对虾是中国乃至于亚洲地区最为重要的水产品，同时，因为其味道鲜美、营养丰富，也是这些区域的最受欢迎的食品之一。然而研究报道虾类在养殖过程中易受副溶血性弧菌的污染，在温暖季节该菌的自然污染率可高达100％，对水产品品质和公共卫生造成了极大的安全隐患。

预测食品微生物模型(Predictivefoodmicrobiology)被视为解决食源性致病菌潜在危害的重要措施之一，通过构建食品中食源性致病菌的预测微生物学模型，可快速地对食品中致病菌的生长情况进行判断,从而有效地控制食品中病原微生物的风险。描述不同温度下虾中副溶血性弧菌预测微生物学模型的已有报道：Boonyawantang等研究了不同温度下菌株BCC24339在虾中行为变化，Tang等研究了副溶血性弧菌O3:K6在即食虾中的生长动力学特征，王敬敬、马冯莉等研究了4～30℃条件下混合菌株在南美白对虾中的行为变化。然而这些研究均局限于人工接种样品中副溶血性弧菌行为变化的研究，没有研究真实地反应自然存在于虾中的副溶血性弧菌的生长动力学特征。

构建生虾中自然存在副溶血性弧菌的预测微生物模型的最大难点在于，基于选择性培养基的传统平板计数方法无法完全排除复杂背景菌群的干扰，从而造成副溶血性弧菌定量效果的失准。近年来，一些研究报道，实时荧光PCR方法可以用于预测微生物学模型的构建，并描述食品中致病微生物的行为变化。实时荧光PCR方法的引物和探针具有极高的特异性，可以在复杂的食品环境中做到精准的定量。然而该方法也有一个巨大的缺陷：基于DNA的实时荧光PCR方法无法区分样品中的活菌与死菌，基于DNA的检测方法无法区分样品中的死菌和活菌，从而过高估计了样品中致病菌的数量。叠氮溴化丙锭(Propidiummonoazide,PMA)是一种对核酸具有高度亲和力的光敏反应染料，能够进入细菌的死细胞中，选择性地交联死菌的DNA，将其与DNA扩增检测技术相结合，可有效地抑制死菌细胞DNA的扩增。近年来，利用PMA结合实时荧光PCR技术，已经广泛应用于多种食源性致病菌的活菌检测，但尚未有研究利用该技术构建预测微生物学模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种南美白对虾中副溶血性弧菌分子预测模型的构建方法，以解决现有技术中所存在的上述问题。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

生鲜南美白对虾的采样和贮藏；

生鲜南美白对虾的处理；

生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌的活菌定量测定；

根据副溶血性弧菌的活菌定量测定值构建一级模型和二级模型；

对所述一级模型和二级模型进行验证。

作为优选方案，所述生鲜南美白对虾的采收和贮藏的方法为：

在每年8月份对虾塘中的南美白对虾进行一次采样，共取540只南美白对虾样品，分为6组，分别置于4℃、7℃、15℃、20℃、25℃、30℃下贮藏，另取18个样品留作副溶血性弧菌最初污染量的定量分析备用。

作为优选方案，样品从采样到贮藏的时间不超过1h。

作为优选方案，所述生鲜南美白对虾的处理的方法包括如下操作：

对不同贮藏温度的南美白对虾进行取样：4℃条件下贮藏360h，每24h取6只南美白对虾；7℃条件下贮藏180h，每12h取6只南美白对虾；15℃条件下贮藏75h，每5h取6只南美白对虾；20℃条件下贮藏60h，每5h取6只南美白对虾；25℃条件下贮藏42h，每3h取6只南美白对虾；30℃条件下贮藏24h，每2h取6只南美白对虾；

将上述南美白对虾样品置于含有蛋白胨水溶液的均质袋中均质2min后，收集南美白对虾液均浆，用于后续的副溶血性弧菌活菌定量分析。

作为优选方案，所述副溶血性弧菌的活菌定量测定的方法包括如下操作：

S1、PMA母液的制备：每980μLddH₂O中溶解入1mgPMA，得到的2mM的PMA母液，于-20℃下避光保存‘

S2、PMA前处理：取25μL的PMA溶液加入到975μL南美白对虾液均浆中，获得25μMPMA终浓度的PMA-样品混合液；将所述PMA-样品混合液置于黑暗条件下处理15min后，利用光解仪处理后，进行离心，收集菌体；

S3、DNA提取：参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书对所述菌体中的DNA进行提取，同时对所述说明书中的方法进行了修正，延长了菌体的收集时间至10min、溶菌酶的处理时间为1h、蛋白酶K的处理时间为2h；

S4、PMA实时荧光PCR活菌定量测定：

选择副溶血性弧菌的tlh基因作为PMA实时荧光PCR扩增的靶基因，以对应的TaqMan探针标记FAM作为报告基团，BHQ1作为淬灭基团，所述扩增所用的引物的序列为，正向引物：5’-ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA-3；反向引物：5’-GATGAGCGGTTGATGTCCAA-3’，TaqMan探针的序列为：5’-FAM-CGCTCGCGTTCACGAAACCGT-BHQ1-3’；

制备PMA实时荧光PCR反应体系20μL，其中，各组分分别为：10×PCRBuffer2μL、浓度为50mM的MgSO₄溶液1.2μL、浓度为10mM的dNTPsmix溶液0.5μL、浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、稀释至终浓度为10μM的三对引物各0.5μL、稀释至终浓度为10μM的三根探针各0.2μL、DNA模板1μL以及ddH₂O12.5μL；

进行40个循环的PMA实时荧光PCR反应，在每个所述循环中，控制95℃预变性2min，95℃变性时间为15s，退火温度为60℃，退火时间为1min；

将PMA实时荧光PCR反应输出的CT值与所述南美白对虾的副溶血性弧菌浓度与CT值关系的标准曲线进行对照，获得对应的南美白对虾中的副溶血性弧菌浓度。

标准曲线的构建：称取8份生鲜南美白对虾25g分别放入8只无菌均质袋中，在每只所述无菌均质袋中加入225mL的蛋白胨水均质2min，获得8份10倍稀释的南美白对虾液匀浆，在每份南美白对虾液匀浆中加入不同稀释梯度的副溶血性弧菌ATCC33847菌液，以获得携带菌量为10²到10⁸CFU/g的南美白对虾液匀浆，以获得南美白对虾体内的副溶血性弧菌的浓度对PMA实时荧光PCR输出结果的关系曲线。采用上述的PMA实时荧光PCR体系反应，利用菌落计数的结果和PMA实时荧光PCR输出的CT值构建反应的标准曲线，并计算曲线的斜率(slope)，利用公式E＝10^-1/slope-1计算多重实时荧光PCR反应的扩增效率。其结果表明，该PMA实时荧光PCR体系具有良好的扩增效率，是一种快速可靠的活菌检测方法，可用于南美白对虾样品中副溶血性弧菌的活菌定量分析。

作为优选方案，所述一级模型的构建方法为：运用Baranyi模型、拟合采收后的生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌贮藏于4℃、7℃、15℃、20℃、25℃、30℃下获得的实验数据；

在所述Baranyi模型中，

$y=y_0+\frac{y_1}{ln\left(10\right)}+\frac{y_2}{ln\left(10\right)}$

$y_2=ln\[1+{10}^{(y_0-y_{max})}\×(e^{{\mathrm{\μ}}_{max}\×(t-\mathrm{\λ})}+e^{-{\mathrm{\μ}}_{max}\×t\×\mathrm{\λ}})\]$

y：在时间t时样品中细菌的浓度；y_max和y₀分别代表最大细菌浓度和初始细菌浓度；μ_max：细菌生长的最大比生长速率；λ：细菌生长的延滞期。

作为优选方案，所述二级模型的构建方法为：

选用平方根模型作为二级模型来描述温度对最大比生长速率的影响，选用非线性阿伦尼乌斯方程作为二级模型来描述温度对最大比生长速率的影响，运用软件进行模型的拟合；

所述平方根模型为：

$\sqrt{{\mathrm{\μ}}_{max}}=b\×(T-T_0)$

所述非线性阿伦尼乌斯模型为

$\mathrm{\λ}=A+\frac{B}{T}+\frac{C}{T^2}$

其中，b为平方根模型的回归系数；A、B、C为非线性阿伦尼乌斯方程的回归系数。

作为优选方案，所述模型的验证方法为：

按照所述模型的构建方法，于当年秋季进行第二次采样，贮藏温度设置为18℃、23℃、28℃，拟合18℃、23℃、28℃温度下副溶血性弧菌的行为变化参数，对本研究所构建的一级模型和二级模型进行验证。

基于运用以下统计学指标评价二级模型的拟合情况：①均方根误差；②准确因子；③偏差因子；

$RMSE=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(obs-pred)}^2}{n}}$

$A_f={10}^{\left(\frac{\mathrm{\Σ}\left|Log(pred/obs)\right|}{n}\right)}$

$B_f={10}^{\left(\frac{\mathrm{\Σ}Log(pred/obs)}{n}\right)}$

其中，obs为试验观测值，pred为模型预测值，n为观测点个数；均方根误差趋近于0表明模型与试验数据点拟合较好；Af表征模型的准确性，反应了预测值和观测值间的相近程度；而Bf表征了预测值和观测值之间的平均偏差。

第二方面，本发明还提供了一种如前述的模型构建方法在水产品中自然存在的副溶血性弧菌的分子预测中的应用。

本研究的目的在于利用PMA实时荧光PCR技术，描述采收后生鲜南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌在不同温度下的行为变化，并构建自然存在的副溶血性弧菌在采收后生鲜南美白对虾中的分子预测微生物学模型，以期填补副溶血性弧菌预测微生物学模型的研究空白，为副溶血性弧菌定量微生物风险评估提供有效的数据基础。

本发明的有益效果主要体现在：

本发明利用PMA实时荧光PCR活菌定量方法，首次构建了副溶血性弧菌的一级模型和二级模型。结果显示：在4、7℃条件下，自然存在于南美白对虾中的副溶血性弧菌缓慢失活，在15、20、25、30℃，自然存在于南美白对虾中的副溶血性弧菌缓慢增长，所构建模型对采收后南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌的行为变化具有良好的预测能力。本研究填补了虾中副溶血性弧菌的预测微生物模型的空白，可为副溶血性弧菌行为变化的研究及副溶血性弧菌定量微生物风险评估提供有效的数据基础。

附图说明

图1采收后虾中自然存在的副溶血性弧菌的一级模型；

图2为采收后虾中自然存在的副溶血性弧菌的二级模型。

具体实施方式

本发明涉及一种南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌分子预测微生物模型的构建方法，其包括如下步骤：

1、生鲜南美白对虾的采收和贮藏

生鲜南美白对虾样品采自上海市最大的南美白对虾养殖基地(上海市典型虾塘)。每年8月(夏季)进行第一次采样，采收后南美白对虾在低温条件下直接运至实验室，分装于无菌封口采样袋，分为6组，每组6个平行，置于不同温度的高精度培养箱中进行贮藏，贮藏温度设置为4、7、15、20、25、30℃。另取18个剩下样品，用于副溶血性弧菌最初污染量的定量分析。生鲜南美白对虾样品从农田的采集到置于不同温度进行贮藏，整个流程不超过一个小时，以确保生虾中副溶血性弧菌的初始菌量不变，以上数据用于采收后生鲜南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌的预测微生物学模型的构建。

2、生鲜南美白对虾的处理

对不同贮藏温度的南美白对虾进行取样分析：4℃条件下贮藏360h，每24h进行一次取样分析；7℃条件下贮藏180h，每12h进行一次取样分析；15℃条件下贮藏75h，每5h进行一次取样分析；20℃条件下贮藏60h，每5h进行一次取样分析；25℃条件下贮藏42h，每3h进行一次取样分析；30℃条件下贮藏24h，每2h进行一次取样分析。

以上各温度每个时间点取6只虾进行平行实验，置于含有100mL蛋白胨水溶液的均质袋中均质2min(BagMixer400VW,Interscience,France)，收集虾液均浆，用于后续的PMA实时荧光PCR活菌定量分析。

3、副溶血性弧菌的活菌定量

运用PMA实时荧光PCR活菌定量方法定量分析采收后南美白对虾样品中自然存在的副溶血性弧菌的菌量，具体的步骤为：PMA前处理——DNA的提取——实时荧光PCR定量活菌。

3.1PMA前处理流程

叠氮溴化丙锭母液的制备：取1mgPMA(Biotium,Hayward,CA,USA)溶解于980μLddH2O中，得到的2mM的母液，于-20℃下避光保存。

叠氮溴化丙锭的处理方法：用移液枪准确量取25μL的PMA溶液加入975μL样品，获得25μMPMA终浓度的PMA-样品混合液。将样品置于黑暗条件下处理15min，使PMA穿透死细胞并与死菌的DNA相交联。将暗处理之后的样品置于仪器PMA-Lite^TMLEDPhotolysisDevice(Biotium,Hayward,CA,USA)中，利用LED光源曝光15min，以确保PMA与死菌的DNA完全相互交联在一起。将样品液置于13,400×g条件下高速离心，收集菌体，用于后续的DNA提取和PCR反应分析。

3.2DNA的提取

细菌DNA的提取方法按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行，本研究将该方法进行了一定的修正，延长了菌体的收集时间(10min)以及溶菌酶的处理时间(1h)和蛋白酶K的处理时间(2h)。

3.3PMA实时荧光PCR活菌定量方法

1)PMA实时荧光PCR活菌定量方法的引物和探针：选择副溶血性弧菌的tlh基因PMA实时荧光PCR扩增的靶基因，所对应的TaqMan探针标记FAM作为报告基团，BHQ1作为淬灭基团。引物和探针序列为：正向引物：5’-ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA-3(SEQIDNO.1)；反向引物：5’-GATGAGCGGTTGATGTCCAA-3’(SEQIDNO.2)；TaqMan探针：5’-FAM-CGCTCGCGTTCACGAAACCGT-BHQ1-3’(SEQIDNO.3)。反应所用的引物及TaqMan探针均由上海英潍捷基(Invitrogen)公司合成。

2)PMA实时荧光PCR反应体系(20μL)：各组分为10×PCRBuffer2μL、浓度为50mM的MgSO₄溶液1.2μL、浓度为10mM的dNTPsmix溶液0.5μL、浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、稀释至终浓度为10μM的三对引物各0.5μL、稀释至终浓度为10μM的三根探针各0.2μL、DNA模板1μL以及ddH₂O12.5μL。以上PCR反应试剂均购置美国英潍捷基Invitrogen公司。

3)PMA实时荧光PCR反应条件：95℃预变性2min；变性温度为95℃，变形时间为15s，退火温度为60℃，退火时间为1min，进行40个循环。

4)PMA实时荧光PCR反应所用仪器：7500Fastreal-timePCRsystem，购于美国AppliedBiosystems公司。

5)PMA实时荧光PCR反应的后续处理软件：7500Softwarev2.0.6，下载自美国AppliedBiosystems公司官方网站。

3.4标准曲线的构建

本研究使用人工接种的虾样构建标准曲线：称取8份生鲜南美白对虾(25g)放入8只无菌均质袋中，加入225mL的蛋白胨水均质2min(BagMixer400VW,Interscience,France)以获得8份10倍稀释的虾液匀浆。在每份虾液匀浆中加入不同稀释梯度的副溶血性弧菌ATCC33847菌液，以获得携带菌量为102到108CFU/g的虾液匀浆。取1mL匀浆利用2.3.1中描述的方法进行PMA前处理，利用2.3.2中的DNA提取方法提取细菌DNA，按照2.3.3中的实验流程进行实时荧光PCR反应，输出相应的循环阈值(CT值)，作为标准曲线Y轴。

直接平板技术法作为标准曲线的对照(X轴)：将携带不同菌量的纯培养物和虾液匀浆分别涂布于TCBS琼脂，37℃下三种选择性培养基的培养时间分别为18h和24h。利用菌落计数的结果和PMA实时荧光PCR输出的CT值构建反应的标准曲线，并计算曲线的斜率(slope)，利用公式E＝10^-1/slope-1计算多重实时荧光PCR反应的扩增效率。

2.4一级模型与二级模型的构建

2.4.1一级模型的构建

运用Baranyi模型(Eq.1)拟合采收后的生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌贮藏于4、7、15、20、25、30℃下获得的实验数据。

在所述Baranyi模型中，

$y=y_0+\frac{y_1}{ln\left(10\right)}+\frac{y_2}{ln\left(10\right)}$

$y_2=ln\[1+{10}^{(y_0-y_{max})}\×(e^{{\mathrm{\μ}}_{max}\×(t-\mathrm{\λ})}+e^{-{\mathrm{\μ}}_{max}\×t\×\mathrm{\λ}})\]$

其中，Y：在时间t时样品中细菌的浓度(LogCFU/g)；ymax和y0分别代表最大细菌浓度和初始细菌浓度；μmax：细菌生长的最大比生长速率(LogCFU/g/h)；λ：细菌生长的延滞期(h)。4、7、15、20、25、30℃下得到的一级模型分别如图1A、1B、1C、1D、1E和1F所示。

2.4.2二级模型的构建

本章研究中选用平方根模型(Eq.2)作为二级模型来描述温度(T)对最大比生长速率(μmax)的影响，选用非线性阿伦尼乌斯方程(Eq.3)作为二级模型来描述温度(T)对最大比生长速率(λ)的影响运用Orginpro8.6软件(OriginLabCorp.,Northampton,USA)进行模型的拟合。

所述平方根模型为

$\sqrt{{\mathrm{\μ}}_{max}}=b\×(T-T_0)$

所述非线性阿伦尼乌斯模型为

$\mathrm{\λ}=A+\frac{B}{T}+\frac{C}{T^2}$

其中，b为平方根模型的回归系数；A、B、C为非线性阿伦尼乌斯方程的回归系数。

2.5模型的验证

按照上述模型构建方法，于同年10月(秋季)进行第二次采样，采样与贮藏方法与2.1中描述保持一致，贮藏温度设置为18、23、28℃，运用2.2、2.3、2.4中的方法构建18、23、28℃温度下副溶血性弧菌的一级模型和二级模型。这部分数据用于2.4中构建的采收后生鲜南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌预测微生物学模型的验证。

基于运用以下统计学指标评价本研究二级模型的拟合情况：均方根误差(RMSE，Eq.8)；

$RMSE=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(obs-pred)}^2}{n}}$

准确因子(Af，Eq.9)；

$A_f={10}^{\left(\frac{\mathrm{\Σ}\left|Log(pred/obs)\right|}{n}\right)}$

偏差因子(Bf，Eq.10)

$B_f={10}^{\left(\frac{\mathrm{\Σ}Log(pred/obs)}{n}\right)}.$

其中，obs为试验观测值，pred为模型预测值，n为观测点个数。均方根误差(RMSE)趋近于0表明模型与试验数据点拟合较好。Af表征模型的准确性，反应了预测值和观测值间的相近程度；而Bf表征了预测值和观测值之间的平均偏差。通过参考先前研究，本研究将Af和Bf趋近于1视为模型具有良好的拟合情况。

实验结果：

1、PMA实时荧光PCR活菌定量的标准曲线

人工接种虾样构建标准曲线为：CT值＝43.34-3.30×活菌数(LogCFU/g)。在101-108CFU/g范围内，平板计数法与PMA实时荧光PCR输出的CT值呈现良好的线性关系：决定系数R2为0.998。标准曲线的斜率为-3.30，由此计算出该PCR反应针的扩增效率为101％。该反应的扩增效率保持在95％-110％之间，表明该PMA实时荧光PCR体系具有良好的扩增效率，是一种快速可靠的活菌检测方法，可用于生虾样品中副溶血性弧菌的活菌定量分析。

2、南美白对虾中副溶血性弧菌一级模型的构建

通过Origin8.0软件对PMA实时荧光PCR的实验数据进行拟合，得到不同温度下生鲜南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌的生长动力学模型(图1和表1)。由表1可知，6个温度下的一级模型的判定系数R2均在0.90以上，表明Baranyi模型能很好地描述生鲜南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌的行为变化。自然存在的副溶血性弧菌在4、

7℃条件下缓慢失活，失活速率分别为-0.019LogCFU/g/h和-0.025LogCFU/g/h，而在15、20、25、30℃条件下，自然存在的副溶血性弧菌处于生长状态，生长速率分别为

0.044LogCFU/g/h、0.105LogCFU/g/h、0.179LogCFU/g/h和0.336LogCFU/g/h，延滞期分别为15.451h、7.259h、4.427h和3.741h。

表1采收后南美白对虾中副溶血性弧菌的动力学参数

贮藏温度	最大比生长速率(μmax,Log CFU/g/h)	延滞期(λ,h)	R2
				4℃	-0.019±0.003	-	0.930
7℃	-0.025±0.003	-	0.919
				15℃	0.044±0.007	15.451±5.334	0.943
20℃	0.105±0.023	7.259±2.694	0.954
				25℃	0.179±0.020	4.427±0.887	0.985
30℃	0.336±0.069	3.741±1.184	0.956

注：“-”代表未检出延滞期(λ)。

3、南美白对虾中副溶血性弧菌二级模型的构建

根据一级模型得出采收后南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌在15-30℃下的最大比生长速率(μmax)和延滞期(λ)，分别构建温度温度(T)对最大比生长速率(μmax)和延滞期(λ)影响的二级模型。所构建的二级模型及公式如图2A和图2B所示，在15-30℃温度范围内，平方根模型可以很好地描述温度对最大比生长速率的影响(图2A，R2＝0.984)，非线性阿伦尼乌斯方程可以很好地描述温度对延滞期的影响(图2B，R2＝0.984)。

4、模型的验证

利用采收后南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌在18、23、28℃条件下的独立实验，运用RMSE、Af和Bf评价本研究所构建的二级预测微生物模型(平方根模型与非线性阿伦尼乌斯模型)的预测效果，实验结果如表2所示。据文献报道，当RMSE值趋近于0、准确因子Af值与偏差因子Bf值处于处于0.9-1.1之间时，说明模型具有良好的预测效果。由表2可得：平方根模型与非线性阿伦尼乌斯模型的RMSE值均趋近于0，而且两个模型的Af值与Bf值均处于0.9-1.1之间，说明两个二级模型对采收后南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌的行为变化具有良好的预测能力。

表2二级模型的模型验证

注：μ_max为最大比生长速率；λ为延滞期；T为温度。

本发明利用PMA实时荧光PCR活菌定量方法，首次构建了副溶血性弧菌的一级模型和二级模型。结果显示：在4、7℃条件下，自然存在于南美白对虾中的副溶血性弧菌缓慢失活，在15、20、25、30℃，自然存在于南美白对虾中的副溶血性弧菌缓慢增长，所构建模型对采收后南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌的行为变化具有良好的预测能力。本研究填补了虾中副溶血性弧菌的预测微生物模型的空白，可为副溶血性弧菌行为变化的研究及副溶血性弧菌定量微生物风险评估提供有效的数据基础。

综上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围，凡依本发明权利要求范围所述的形状、构造、特征及精神所为的均等变化与修饰，均应包括于本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一种南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

生鲜南美白对虾的采样和贮藏；

生鲜南美白对虾的处理；

生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌的活菌定量测定；

根据副溶血性弧菌的活菌定量测定值构建一级模型和二级模型；

对所述一级模型和二级模型进行验证。

2.如权利要求1所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，所述生鲜南美白对虾的采收和贮藏的方法为：

在每年8月份对虾塘中南美白对虾进行一次采样，共取540只南美白对虾样品，分为6组，分别置于4℃、7℃、15℃、20℃、25℃、30℃下贮藏，另取18个样品留作副溶血性弧菌最初污染量的定量分析备用。

3.如权利要求2所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，南美白对虾样品从采样到贮藏的时间不超过1h。

4.如权利要求1所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测微生物模型的构建方法，其特征在于，所述生鲜南美白对虾的处理方法包括如下操作：

对不同贮藏温度的南美白对虾进行取样：4℃条件下贮藏360h，每24h取6只南美白对虾；7℃条件下贮藏180h，每12h取6只南美白对虾；15℃条件下贮藏75h，每5h取6只南美白对虾；20℃条件下贮藏60h，每5h取6只南美白对虾；25℃条件下贮藏42h，每3h取6只南美白对虾；30℃条件下贮藏24h，每2h取6只南美白对虾；

分别将南美白对虾样品置于含有蛋白胨水溶液的均质袋中均质2min后，收集南美白对虾液均浆，用于后续的副溶血性弧菌活菌定量分析。

5.如权利要求1所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，所述副溶血性弧菌的活菌定量测定的方法包括如下操作：

S1、PMA母液的制备：每980μLddH₂O中溶解入1mgPMA，得到的2mM的PMA母液，于-20℃下避光保存；

S2、PMA前处理：每975μL南美白对虾液均浆加入25μL的PMA母液，获得25μMPMA终浓度的PMA-样品混合液；将所述PMA-样品混合液置于黑暗条件下处理15min后，利用光解仪处理后，进行离心，收集菌体；

S3、DNA提取：参照天根细菌基因组DNA提取方法对所述菌体中的DNA进行提取，菌体的收集时间为10min、溶菌酶的处理时间为1h、蛋白酶K的处理时间为2h；

S4、PMA实时荧光PCR活菌定量测定：

选择副溶血性弧菌的tlh基因作为PMA实时荧光PCR扩增的靶基因，以对应的TaqMan探针标记FAM作为报告基团，BHQ1作为淬灭基团，所述扩增所用的引物的序列为，正向引物：5’-ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA-3；反向引物：5’-GATGAGCGGTTGATGTCCAA-3’，TaqMan探针的序列为：5’-FAM-CGCTCGCGTTCACGAAACCGT-BHQ1-3’；

制备PMA实时荧光PCR反应体系，其中，每20μL反应体系中各组分分别为：10×PCRBuffer2μL、浓度为50mM的MgSO₄溶液1.2μL、浓度为10mM的dNTPsmix溶液0.5μL、浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、稀释至终浓度为10μM的三对引物各0.5μL、稀释至终浓度为10μM的三根探针各0.2μL、DNA模板1μL以及ddH₂O12.5μL；

进行40个循环的PMA实时荧光PCR反应，在每个所述循环中，控制95℃预变性2min，95℃变性时间为15s，退火温度为60℃，退火时间为1min；

将PMA实时荧光PCR反应输出的CT值与所述南美白对虾的副溶血性弧菌浓度与CT值关系的标准曲线进行对照，获得对应的南美白对虾中的副溶血性弧菌浓度。

6.如权利要求1所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，

所述一级模型的构建方法为：运用Baranyi模型、拟合采收后的生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌贮藏于4℃、7℃、15℃、20℃、25℃、30℃下获得的实验数据；

在所述Baranyi模型中，

$y=y_0+\frac{y_1}{ln\left(10\right)}+\frac{y_2}{ln\left(10\right)}$

y：在时间t时样品中细菌的浓度；y_max和y₀分别代表最大细菌浓度和初始细菌浓度；μ_max：细菌生长的最大比生长速率；λ：细菌生长的延滞期。

7.如权利要求1所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，

所述二级模型的构建方法为：

选用平方根模型作为二级模型来描述温度对最大比生长速率的影响，选用非线性阿伦尼乌斯方程作为二级模型来描述温度对最大比生长速率的影响，运用软件进行模型的拟合；

所述平方根模型为：

$\sqrt{{\mathrm{\μ}}_{max}}=b\×(T-T_0)$

所述非线性阿伦尼乌斯模型为

$\mathrm{\λ}=A+\frac{B}{T}+\frac{C}{T^2}$

其中，b为平方根模型的回归系数；A、B、C为非线性阿伦尼乌斯方程的回归系数。

8.如权利要求1所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，

所述验证方法为：

按照所述模型的构建方法，于当年秋季进行第二次采样，贮藏温度设置为18℃、23℃、28℃，拟合18℃、23℃、28℃温度下副溶血性弧菌的行为变化参数，对所述一级模型和二级模型进行验证；

基于运用以下统计学指标评价二级模型的拟合情况：①均方根误差；②准确因子；③偏差因子；

$RMSE=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(obs-pred)}^2}{n}}$

$A_f={10}^{\left(\frac{\mathrm{\Σ}\left|Log(pred/obs)\right|}{n}\right)}$

$B_f={10}^{\left(\frac{\mathrm{\Σ}Log(pred/obs)}{n}\right)}$

其中，obs为试验观测值，pred为模型预测值，n为观测点个数；均方根误差趋近于0表明模型与试验数据点拟合较好；Af表征模型的准确性，反应了预测值和观测值间的相近程度；而Bf表征了预测值和观测值之间的平均偏差。

9.一种如权利要求1～8中任意一项所述的南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法在水产品中自然存在的副溶血性弧菌的分子预测中的用途。