CN109738600A - 一种冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，属于冷链肉制品品质智能预测领域，包括：动态波动温度的设置；不同温度条件下微生物培养；微生物间歇性动态生长预测模型的构建；模型验证；冷链过程中不同肉制品货架期的预测模型构建。该方法提供的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法操作简单，结果可靠，能实时预测波动和恒定温度条件下冷链肉制品品质的方法，实现冷链过程中肉制品的品质实时监控，为企业和消费者提供一种快速、高效的微生物预测方法，通过建立微生物智能化预测模型，提高了模型预测精度和效率，为冷链肉制品过程中评价肉制品的食用安全性提供有效手段。

Description

一种冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法

技术领域

本发明属于冷链肉制品品质智能预测领域，具体涉及一种冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法。

背景技术

冷链肉制品因其保质期长、营养价值高、口感好等特点，在肉类消费中逐步成为主流。随着人们对冷链肉制品需求的增加，冷链肉制品的品质及新鲜度越来越受到广大消费者的关注，虽然在较低温度下贮藏和流通，但并不能完全抑制微生物的生长繁殖，尤其是嗜冷微生物，再加上波动的温度条件，造成冷链肉制品微生物数量增多，产品安全性和品质快速降低，剩余货架期较短，到达运输目的地之后对肉品质量的检查结果又往往延迟于销售，这对国民的健康产生威胁，这也是目前冷鲜肉质量监控的盲点。

冷链肉制品极易污染致病菌和腐败，温度是影响其腐败的关键因素，可以影响冷链肉制品优势致病微生物和优势致腐微生物的生长繁殖，为了实现0～4℃的温度要求，需要冷链系统自始至终(从生产到消费)用连续的控温技术来处理冷鲜肉。冷链肉制品的质量安全取决于其整个供应链“养殖场-屠宰场-物流服务商-销售商”。在肉品源头处(即养殖场、屠宰场)有专门的冷藏设施来保证肉品的低温冷藏，而在其运输过程(即冷链物流过程)和销售过程中，严格的运输冷链应该是一种“门对门”的完整系统，由于我国冷链物流行业标准落实不到位，生产流通和销售过程中冷链物流系统不健全，再加上运输环境复杂，涉及面广，突发状况多且难以控制，缺乏系统有效的监管，运输冷链中的交叉污染和温度失控经常发生，温度的频波动，会促使微生物生长繁殖，加快肉质腐败进程，严重威胁消费者健康。

预测微生物学是借助微生物学、计算机软件和数学模型等知识，直接预报微生物的安全性科学。传统的模型构建过程不仅复杂、繁琐，且由于模型开发过程中涉及多个步骤与环节，容易导致实验和分析误差产生积累和传递，从而导致波动温度的动力学条件下对微生物生长变化的预测结果不准确，不能真实有效的反应食品中微生物在流通过程中生长变化情况。而且大多数等温条件下构建的预测模型被验证在动态变化条件下是无效的。

国内外文献检索表明，在波动温度条件下微生物预测模型构建方面，公开号为CN102650632A、名称为“一种应用于波动温度下评价冷却猪肉货架期的方法”的发明专利采用的是三阶段线性模型来描述不同贮藏温度条件下的冷却猪肉中好氧菌的数量随时间的变化，只能对好氧菌的变化进行预测，且只能“一菌一模型”、“一品种一模型”，这种情况不利于学科发展，也不利于实际应用。公开号为CN104298868A、名称为“一种冷链物流的冷却肉货架期预测方法及系统”的发明专利仅是对冷却肉货架期的快速预测，无法实时监控波动温度条件下其他冷链肉制品品质的变化，模型缺乏普适性。在实际冷链过程中温度处于低温非生长与适宜温度生长的交替变化过程，微生物出现间歇性动态变化，这一直是制约冷链过程中食品安全智能化管理的难题，目前所构建的微生物生长模型无法解决微生物间歇动态生长的问题。

因此，本申请提出一种冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法来解决上述问题。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明提供了一种冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法。该方法是一种操作简单，结果可靠，能实时预测波动和恒定温度条件下冷链肉制品品质的方法，能够实现冷链过程中肉制品的品质实时监控，为企业和消费者提供一种快速、高效的微生物预测方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1.样品动态波动温度的确定；

通过实地调研样品生产厂家、冷链运输环境以及门店销售各个环节环境因素变化，确定冷链肉制品微生物动态波动温度范围；

步骤2.不同温度条件下微生物培养；

使用可编程的精确生化培养箱，精确度为±0.1～0.2℃，模拟步骤1中冷链过程中温度波动的范围，设置培养箱的培养温度及时间参数，并将若干份样品放入培养箱中；

每当温度依据设置的波动温度点发生波动变化时从培养箱中随机取出5份样品，进行细菌总数和优势腐败菌总数平板计数；

步骤3.微生物间歇性动态生长预测模型的构建；

根据细菌总数和优势腐败菌总数、利用Matlab绘制不同条件下微生物生长曲线，分析冷链肉制品微生物的生长特性，用于确定优势致腐、致病微生物的动力学参数和构建其动态预测模型；

步骤3.1.构建微生物生长与存活的一级模型即生长模型；

设定微生物的贮藏温度为T、最低生长温度为T_min，根据不同冷链肉制品中微生物的变化特征，依据贮藏温度T与最低生长温度T_min的大小，利用matlab软件直接构建冷链物流过程中波动温度条件下优势腐败菌的基本生长模型，计算最大比生长速率μ_max,lnCFU/gh-1、延迟期λ和最大菌数N_max，描述优势腐败菌数量随时间变化之间的关系如下所述；

N＝N_L+N_D (3)

式中，t为时间，微生物快速增殖速率为a，细菌总数为N,CFU/g，初始菌量为N₀,CFU/g，t为时间，迟滞期的细菌数量为N_L,CFU/g，对数期的细菌数量为N_D,CFU/g，达到稳定期时的最大菌落数量为N_max,CFU/g；

步骤3.2.构建环境因子与一级模型中微生物生长动力学参数之间的二级模型即环境因素模型；

在不同的温度条件下，用最大比生长速率μ_max和延迟期λ来衡量微生物生长的差异，即利用一级模型中获得的最大比生长速率μ_max、延迟期λ以及最大菌落浓度N_max参数，当T>T_min时，构建温度对微生物生长动力学参数的影响，采用Rosso温度参数模型来描述；

其中，μ是温度为T℃时的比生长速率，Topt是最适生长温度，此时微生物的生长速率μopt达到最佳状态(h-1)；

步骤3.3.构建冷链肉制品中微生物三级动态模型即高精度智能专家模型，即基于生长模型和环境因素模型之上的综合性软件模型；

既是建立在一级和二级模型基础上的应用软件，生长模型和环境因素模型以模块形式嵌入应用软件，应用软件的程序在计算机上运行，在既定的环境条件下随时反应微生物数量与环境条件之间的对应关系，对于每个生长曲线，生长过程通过常微分方程(1)-(3)结合步骤3.2.中的(4)式来描述；

采用一步动态数值分析方法直接构建高精度智能专家模型，即采用四阶Runge-Kutta数值分析法解微分方程组进行求解；μ可以通过时间-温度的数据用方程(4)来确定，μ_opt、T_min、T_opt和T_max通过最小平方优化法获得优化数值，一步动态数值分析法具体采用四阶Runge-Kutta算法和Python法进行最小平方优化，在数据优化期间，启动电脑程序，赋予每个参数一个初始猜测值，程序迭代使用初始猜测值去解微生物不同阶段的常微分方程，在每次假设T_min和T_max基础上，每次迭代和迭代继续，数值优化出动态变化时微生物的动力学参数，减少试验误差的积累，从而构建温度波动条件下不同优势致腐微生物的间歇性动态预测模型，实现冷链过程中波动温度条件下优势致腐微生物的快速可视化；

步骤4.模型验证；

步骤3.3构建高精度智能专家模型以后，采用两组动态生长曲线与一组恒温曲线对模型进行验证，通过均方误差MSE、均方根误差RMSE以及残差平方和RSS进行判断预测模型的优劣，然后与所建的模型预测值利用偏差因子Bf和准确因子Af的大小进行比较，偏差因子Bf用来来评价预测值的上下波动幅度，准确因子Af用来衡量预测值和实测值之间的差异，对所建立的预测模型进行适合性验证，验证后的模型即为构建的微生物预测模型；

步骤5.冷链过程中不同肉制品货架期的预测模型构建；

货架期预测模型的建立，是依据冷链物流过程中不同肉制品的种类，利用步骤4中构建的微生物预测模型分析特定腐败菌的生长动力学模型，确定最小腐败限量N_s,log(cfu/g)和最大菌值N_max,log(cfu/g)，依据初始菌值N₀增值到Ns的时间来预测冷链肉制品的货架期，货架期SL的模型如下；

优选地，所述步骤2中设置的波动温度点是依据实际冷链过程中温度的动态变化进行模拟设置，精确生化培养箱稳定在每个动态温度曲线的初始温度后，按照实验计划编程改变，定期从精确生化培养箱中取出样品，测定微生物的动态变化量，获得微生物的最低生长温度T_min、最高生长温度T_max、延迟期λ以及最大比生长速率μ_max。

优选地，所述步骤2中的微生物数量的测定方法是将贮藏在不同温度下的样品，随机取样，采用经典的平板计数和选择性培养基进行优势腐败菌计数，通过对优势致腐微生物在不同时间、不同温度条件下的生长繁殖情况试验，获得生长时的基础数据，针对不同的冷链冷鲜肉可以形成不同的微生物数据库。

优选地，所述步骤3.1的公式(1)中，当t＝0时，所有的微生物细胞为迟滞期菌落数量，因此，当t＝0时，N₀＝NL，N_D＝0，相当于其在迟滞期的细菌数量NL与对数期的细菌数量N_D之和；

当T<Tmin时，微生物将逐渐死亡，假定迟滞期和对数期微生物都在Tmin以下的温度死亡，但是以不同的速率死亡，K是微生物在＜Tmin时的死亡速度，迟滞期微生物数量变化采用公式(6)，对数期微生物数量变化采用方程为(7)，βKNL用于描述在T<Tmin时一部分对数期微生物被改变为迟滞期微生物，总细胞浓度仍然是迟滞期和对数期微生物数量的总和，如方程(3)所示；

其中,β是系数,K是微生物在T＜Tmin时的死亡速率。

优选地，使用四阶Runge-Kutta数值分析法求解微分方程组，并使用Python法进行最小平方优化来获得最适参数值a、μ_opt、T_min、T_max、β，使得残差和所选择的若干动态生长和存活曲线的总残差平方和RSS最小，其中方程(1)与(2)相同，能够用来表示细菌细胞的生长与死亡，方程中唯一不同的是N_D与N_L的相关系数不同，因此，方程(1)-(3)应用于动态分析研究中作为表达菌落数增长或者下降的方程，当T>T_min时，方程(1)-(3)用来描述冷链肉制品微生物生长速率，当T<T_min时，方程(4)-(5)用来表示温度对冷链肉制品微生物存活的影响。

优选地，所述四阶Runge-Kutta数值分析法是求解优势腐败菌的一级模型和二级模型常微分方程精度最高的一种数值分析方法，具体四阶Runge-Kutta数值分析法迭代公式为：

k₁＝f(x_n,y_n)

k₄＝f(x_n+h,y_n+hk₃) (8)

式(8)中的k1，k2，k3，k4是某一点处的斜率值；

所述的步骤3.3中三级模型的构建过程是依据matlab软件将步骤3.1和步骤3.2中的一级模型和二级模型的方程进行简化，具体简化公式为方程(9)和(10)，用于描述微生物生长和存活的一般方程，确定贮藏过程中微生物的生长与存活的动力学参数；

在方程(9)和(10)中，速率项是μ_max或K，取决于贮藏温度，如果T>T_min，则Rate等于μ_max，当T<T_min时，Rate等于K；同样，γ为是α或β，具体为在T≥T_min，γ＝α，在T≤T_min时，γ＝β，参数m由温度决定，当T≥T_min时等于m＝1，当T≤T_min时为m＝0，细菌总数仍表示在方程(3)。

优选地，所述步骤3.1中的一级模型的常微分方程(1)和(2)，(4)和(5)是描述微生物生长和存活的理论模型，常微分方程(3)、(9)和(10)被选作为主要模型，步骤3.2中微生物预测二级模型建立温度与微生物的函数关系时，需用方程(7)来解决。

优选地，所述步骤4中的模型验证是在动力学参数确定以后，通过未被用来进行动力学分析的两组动态生长曲线与一组恒温生长曲线对建立的预测模型进行验证和模型评价，偏差因子Bf和准确因子Af来判定模型的精确度，偏差度用来检查预测值的上下波动幅度大小，准确度用来判断预测值和实测值之间的差异，具体表达式如下：

式中：N_prd是微生物预测值，N_obs是微生物实测值，n为试验次数；

预测模型的评价方法采用残差平方和RSS(Residual sum of squares)，均方误差MSE(Mean squear error)、均方根误差RMSE(root mean square)、赤池信息量准则AIC(Akaike information criterion)以及虚拟判定系数pseudo-R2方法评价模型的预测能力，进一步的RSS、MSE、RMSE、AIC以及pseudo-R2的表达式如下：

式中：这里的n为试验数据的总数；yi是第i小时测定的实测值；是第i小时的预测值；

式中：μobserved代表实测值；μpredictived代表预测值；这里的n代表观测值个数；

优选地，所述步骤5冷链过程中不同肉制品货架期的预测模型构建，针对不同肉制品，利用步骤3中所构建的微生物预测模型选择特定腐败菌的生长动力学最佳模型，确定最小腐败限量Ns和最大菌值N_max，依据初始菌值N₀增值到N_s的时间来预测冷链肉制品的货架期，即利用冷链物流过程中不同的肉制品在贮藏过程中的微生物量的动态变化，首先确定特定腐败菌达到稳定期后的N_max和N_s值，由步骤3.2中的方程(4)计算μ_max与迟滞时间λ，然后根据特定微生物的生长动力学模型计算出特定腐败菌从N₀增殖到N_s的时间来预测货架期SL，同样，根据不同肉制品的最佳一级模型可得到任何时刻t的细菌数N(t)后，t代表时间点，产品的剩余货架期MSL也可进行计算。

本发明提供的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法应用于冷链过程中波动温度条件下不同肉制品微生物的动态变化，以此来快速评价冷链肉制品的品质，具体有益效果为：

(1)计算机程序模拟与数值优化法结合，针对不同肉制品的腐败特征通过一步动态数值分析法建立“统一化”微生物智能化预测模型，可精确预测波动温度和恒定温度条件下不同微生物生长和残存的动力学参数，提高了模型预测精度和效率，扩大了微生物预测模型的应用范围，为冷链肉制品过程中评价肉制品的食用安全性提供有效手段。

(2)针对国际上食品微生物预测模型难以评价的问题，本发明针对不同条件下微生物的生长特性，确定其动力学参数，通过均方误差(MSE)、残差平方和(RSS)、均方根误差(RMSE)、相关系数(R2)、偏差因子(Bf)以及准确因子(Af)等参数比较，选择适合于不同微生物动态预测模型的验证和优化方法，对模型的预测精度进行评价，进而解决实际冷链过程中微生物动态变化问题，可在不进行传统微生物检测的条件下对牛肉的安全性和货架期进行快速预测，从而快速、高效、实时地监测冷鲜牛肉在贮藏流通过程中的安全问题。

(3)所建立的预测微生物动力学模型能有效地预测0～40℃范围内的冷链肉制品的品质，应用常微分方程和统计软件编程，可打破冷链过程中冷链肉制品微生物间歇性生长无法估测的瓶颈，为实时监测和跟踪波动温度条件下冷链肉质制品的品质提供科学的方法和技术支持。

(4)本发明提供的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法操作简单，结果可靠，是一种能实时预测波动和恒定温度条件下冷链肉制品品质的方法，实现冷链过程中肉制品的品质实时监控，为企业和消费者提供一种快速、高效的微生物预测方法。

附图说明

图1是本发明实施例1的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法的流程图；

图2是本发明实施例2的波动温度条件下优势致腐菌的生长变化分析图；

图3是本发明实施例2的波动温度条件下优势致腐菌温度与μ_max ^1/2的残差分析示意图；

图4-图5是本发明实施例3的波动温度条件下优势致病菌的生长变化分析图；

图6是本发明实施例3的不同温度条件下迟滞期和对数期优势致病微生物生长平均速率比较；

图7是实施例2和实施例3在不同波动温度条件下优势致病微生物生长变化分析图；

图8是实施例2和实施例3在波动温度和恒温条件下的模型验证示意图；

图9是实施例2和实施例3构建动态预测模型验证的残差分布图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施提供的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，如图1所示，包括以下步骤：

S1.样品动态波动温度的确定；

通过实地调研样品生产厂家、冷链运输环境以及门店销售各个环节环境因素变化，确定冷链肉制品微生物动态波动温度范围；

S2.不同温度条件下微生物培养；

使用可编程的精确生化培养箱，精确度为±0.1～0.2℃，模拟S1中冷链过程中温度波动的范围，设置培养箱的培养温度及时间参数，并将若干份样品放入培养箱中；

每当温度依据设置的波动温度点发生波动变化时从培养箱中随机取出5份样品，进行细菌总数和优势腐败菌总数平板计数；

S3.微生物间歇性动态生长预测模型的构建；

根据细菌总数和优势腐败菌总数、利用Matlab绘制不同条件下微生物生长曲线，分析冷链肉制品微生物的生长特性，用于确定优势致腐、致病微生物的动力学参数和构建其动态预测模型；

S3.1.构建微生物生长与存活的一级模型即生长模型；

设定微生物的贮藏温度为T、最低生长温度为T_min，根据不同冷链肉制品中微生物的变化特征，依据贮藏温度T与最低生长温度T_min的大小，利用matlab软件直接构建冷链物流过程中波动温度条件下优势腐败菌的基本生长模型，计算最大比生长速率μ_max,lnCFU/gh-1、延迟期λ和最大菌数N_max，描述优势腐败菌数量随时间变化之间的关系如下；

N＝N_L+N_D (3)

式中，t为时间，微生物快速增殖速率为a，细菌总数为N,CFU/g，初始菌量为N₀,CFU/g，t为时间，迟滞期的细菌数量为N_L,CFU/g，对数期的细菌数量为N_D,CFU/g，达到稳定期时的最大菌落数量为N_max,CFU/g；

S3.2.构建环境因子与一级模型中微生物生长动力学参数之间的二级模型即环境因素模型；

在不同的温度条件下，用最大比生长速率μ_max和延迟期λ来衡量微生物生长的差异，即利用一级模型中获得的最大比生长速率μ_max、延迟期λ以及最大菌落浓度N_max参数，当T>T_min时，构建温度对微生物生长动力学参数的影响，采用Rosso温度参数模型来描述；

其中，μ是温度为T℃时的比生长速率，Topt是最适生长温度，此时微生物的生长速率μopt达到最佳状态(h-1)；

S3.3.构建冷链肉制品中微生物三级动态模型即高精度智能专家模型，即基于生长模型和环境因素模型之上的综合性软件模型；

既是建立在一级和二级模型基础上的应用软件，生长模型和环境因素模型以模块形式嵌入应用软件，应用软件的程序在计算机上运行，在既定的环境条件下随时反应微生物数量与环境条件之间的对应关系，对于每个生长曲线，生长过程通过常微分方程(1)-(3)结合S3.2.中的(4)式来描述；

采用一步动态数值分析方法直接构建高精度智能专家模型，即采用四阶Runge-Kutta数值分析法解微分方程组进行求解；μ可以通过时间-温度的数据用方程(4)来确定，μ_opt、T_min、T_opt和T_max通过最小平方优化法获得优化数值，一步动态数值分析法具体采用四阶Runge-Kutta算法和Python法进行最小平方优化，在数据优化期间，启动电脑程序，赋予每个参数一个初始猜测值，程序迭代使用初始猜测值去解微生物不同阶段的常微分方程，在每次假设T_min和T_max基础上，每次迭代和迭代继续，数值优化出动态变化时微生物的动力学参数，减少试验误差的积累，从而构建温度波动条件下不同优势致腐微生物的间歇性动态预测模型，实现冷链过程中波动温度条件下优势致腐微生物的快速可视化；

S4.模型验证；

S3.3构建高精度智能专家模型以后，采用两组动态生长曲线与一组恒温曲线对模型进行验证，通过均方误差MSE、均方根误差RMSE以及残差平方和RSS进行判断预测模型的优劣，然后与所建的模型预测值利用偏差因子Bf和准确因子Af的大小进行比较，偏差因子Bf用来来评价预测值的上下波动幅度，准确因子Af用来衡量预测值和实测值之间的差异，对所建立的预测模型进行适合性验证，验证后的模型即为构建的微生物预测模型；

S5.冷链过程中不同肉制品货架期的预测模型构建；

货架期预测模型的建立，是依据冷链物流过程中不同肉制品的种类，利用S4中构建的微生物预测模型分析特定腐败菌的生长动力学模型，确定最小腐败限量Ns,log(cfu/g)和最大菌值Nmax,log(cfu/g)，依据初始菌值N0增值到Ns的时间来预测冷链肉制品的货架期，货架期SL的模型如下；

进一步地，本实施例中S2中设置的波动温度点是依据实际冷链过程中温度的动态变化进行模拟设置，精确生化培养箱稳定在每个动态温度曲线的初始温度后，按照实验计划编程改变，定期从精确生化培养箱中取出样品，测定微生物的动态变化量，获得微生物的最低生长温度T_min、最高生长温度T_max、延迟期λ以及最大比生长速率μ_max。

进一步地，本实施例中S2中的微生物数量的测定方法是将贮藏在不同温度下的样品，随机取样，采用经典的平板计数和选择性培养基进行优势腐败菌计数，通过对优势致腐微生物在不同时间、不同温度条件下的生长繁殖情况试验，获得生长时的基础数据，针对不同的冷链冷鲜肉可以形成不同的微生物数据库。

进一步地，本实施例中S3.1的公式(1)中，当t＝0时，所有的微生物细胞为迟滞期菌落数量，因此，当t＝0时，N₀＝N_L，N_D＝0，相当于其在迟滞期的细菌数量N_L与对数期的细菌数量N_D之和；

当T<T_min时，微生物将逐渐死亡，假定迟滞期和对数期微生物都在T_min以下的温度死亡，但是以不同的速率死亡，K是微生物在＜T_min时的死亡速度，迟滞期微生物数量变化采用公式(6)，对数期微生物数量变化采用方程为(7)，βKNL用于描述在T<T_min时一部分对数期微生物被改变为迟滞期微生物，总细胞浓度仍然是迟滞期和对数期微生物数量的总和，如方程(3)所示；

其中,β是系数,K是微生物在T＜T_min时的死亡速率。

进一步地，本实施例中使用四阶Runge-Kutta数值分析法求解微分方程组，并使用Python法进行最小平方优化来获得最适参数值a、μ_opt、T_min、T_max、β，使得残差和所选择的若干动态生长和存活曲线的总残差平方和RSS最小，其中方程(1)与(2)相同，能够用来表示细菌细胞的生长与死亡，方程中唯一不同的是N_D与N_L的相关系数不同，因此，方程(1)-(3)应用于动态分析研究中作为表达菌落数增长或者下降的方程，当T>T_min时，方程(1)-(3)用来描述冷链肉制品微生物生长速率，当T<T_min时，方程(4)-(5)用来表示温度对冷链肉制品微生物存活的影响。

进一步地，本实施例中四阶Runge-Kutta数值分析法是求解优势腐败菌的一级模型和二级模型常微分方程精度最高的一种数值分析方法，具体四阶Runge-Kutta数值分析法迭代公式为：

k₁＝f(x_n,y_n)

k₄＝f(x_n+h,y_n+hk₃) (8)

式(8)中的k1，k2，k3，k4是某一点处的斜率值；

的S3.3中三级模型的构建过程是依据matlab软件将S3.1和S3.2中的一级模型和二级模型的方程进行简化，具体简化公式为方程(9)和(10)，用于描述微生物生长和存活的一般方程，确定贮藏过程中微生物的生长与存活的动力学参数；

在方程(9)和(10)中，速率项是μ_max或K，取决于贮藏温度，如果T>T_min，则Rate等于μ_max，当T<T_min时，Rate等于K；同样，γ为是α或β，具体为在T≥T_min，γ＝α，在T≤T_min时，γ＝β，参数m由温度决定，当T≥T_min时等于m＝1，当T≤T_min时为m＝0，细菌总数仍表示在方程(3)。

进一步地，本实施例中S3.1中的一级模型的常微分方程(1)和(2)，(4)和(5)是描述微生物生长和存活的理论模型，常微分方程(3)、(9)和(10)被选作为主要模型，S3.2中微生物预测二级模型建立温度与微生物的函数关系时，需用方程(7)来解决。

进一步地，本实施例中S4中的模型验证是在动力学参数确定以后，通过未被用来进行动力学分析的两组动态生长曲线与一组恒温生长曲线对建立的预测模型进行验证和模型评价，偏差因子Bf和准确因子Af来判定模型的精确度，偏差度用来检查预测值的上下波动幅度大小，准确度用来判断预测值和实测值之间的差异，具体表达式如下：

式中：N_prd是微生物预测值，N_obs是微生物实测值，n为试验次数；

预测模型的评价方法采用残差平方和RSS，均方误差MSE、均方根误差RMSE、赤池信息量准则AIC以及虚拟判定系数pseudo-R2方法评价模型的预测能力，进一步的RSS、MSE、RMSE、AIC以及pseudo-R2的表达式如下：

式中：这里的n为试验数据的总数；yi是第i小时测定的实测值；是第i小时的预测值；

式中：μobserved代表实测值；μpredictived代表预测值；这里的n代表观测值个数；

进一步地，本实施例中S5冷链过程中不同肉制品货架期的预测模型构建，针对不同肉制品，利用S3中所构建的微生物预测模型选择特定腐败菌的生长动力学最佳模型，确定最小腐败限量N_s和最大菌值N_max，依据初始菌值N₀增值到Ns的时间来预测冷链肉制品的货架期，即利用冷链物流过程中不同的肉制品在贮藏过程中的微生物量的动态变化，首先确定特定腐败菌达到稳定期后的N_max和N_s值，由S3.2中的方程(4)计算μ_max与迟滞时间λ，然后根据特定微生物的生长动力学模型计算出特定腐败菌从N₀增殖到N_s的时间来预测货架期SL，同样，根据不同肉制品的最佳一级模型可得到任何时刻t的细菌数N(t)后，t代表时间点，产品的剩余货架期MSL也可进行计算。

实施例2

冷鲜牛肉冷链过程中优势致腐微生物是假单胞菌，下面以冷鲜牛肉假单胞菌在波动温度条件下的动态生长过程为研究对象，采用上述的构件方法，构建假单胞菌间歇性动态生长预测模型。

实验材料：原料肉购于南阳科尔沁牛业有限公司，冷藏条件下带回实验室分割待用。微生物测定：无菌条件下取25g样品，剪碎后放入225mL无菌生理盐水中，180r/min，震摇30min。然后取100μL上清液，依次进行10倍稀释，选取三个合适的稀释度，分别用PCA培养基、PS选择性培养基、VRBGA选择性培养基、MRS选择性培养基以及STAA选择性培养基进行微生物的培养和计数，每个稀释度做两个重复。

依据步骤S1波动温度的设置，以实际冷链过程中冷藏车中的温度传感器记录的温度变化数据为依据，设置波动温度，具体见表(1)所示。

表1五组不同动态波动温度

依据步骤S2使用可编程的精确生化培养箱，其精确度为±0.1～0.2℃。模拟步骤S1中冷链物流过程中温度波动的范围，设置培养箱温度变化，每当温度依据设置的温度点发生波动变化时从培养箱中随机取出5份样品，进行细菌总数和优势腐败菌计数，绘制假单胞菌在温度波动条件下的生长变化如图2所示，波动温度条件下优势致腐菌温度与μ_max ^1/2的残差分析如图3所示。

依据步骤S3.1中描述的冷鲜牛肉中假单胞菌在波动温度条件下的动态变化，构建间歇性动态预测模型，利用以下方程进行拟合假单胞菌的生长曲线，确定其动力学参数μ_max、延迟期(λ)等。

N＝N_L+N_D (3)

其中t为时间，h为细胞快速增殖的速率；μ_max为最大比生长速率，(lnCFU/g h-1)；N细菌总数，CFU/g；N₀是初始初始菌量，CFU/g；N_L迟滞期的细菌数量，CFU/g；N_D对数期的细菌数量，CFU/g；N_max达到稳定期时的最大菌落数量，CFU/g。

依据步骤S3.2构建假单胞菌生长动力学参数与温度之间的函数模型，平方根模型拟合的假单胞菌的温度与μ_max1/2的残差分析图，具体见图(3)所示。

K＝k(T-T_min) (18)

其中在方程(17)中a是回归系数，T为培养温度，℃，T_min为最低生长温度，℃。

对于波动温度条件下假单胞菌的生长曲线以及确定的动力学参数，利用四阶Runge-kutta数值分析法对其微分方程进行求解。计算得到5个动力学参数(a，k，T_min，Y_max)。通过数值分析计算得到的5个动力学参数的值分别为：a＝3.68e-03，k＝5.23e-02，Tmin＝0，Ymax＝2.08e+01，＝3.17e-01(＝3.26e-01)。估算得到的a，k，T_min，Y_max值统计显著(p>0.05)。

依据步骤S4中模型验证，选择两组动态生长曲线与一组恒温生长曲线对建立的预测模型进行验证和模型评价。计算偏差因子B_f和准确因子A_f的值来判定模型的精确度。并选择RSS、MSE、RMSE、AIC以及pseudo-R²等指标评价构建的动态预测模型的预测能力。选择两条波动温度和恒定温度(15℃)生长曲线可计算得到该模型预测的均方根误差(RMSE)分别为0.27log CFU/g和0.31logCFU/g。残差的均值与标准差分别为0.03logCFU/g与0.22logCFU/g。绝大多数(91.5％)残差值在正常误差范围内。

依据步骤S5描述的冷鲜牛肉货架期的预测，本实施例是通过计算初始菌值N₀增值到最小腐败量的时间来预测的，本实施例中假单胞菌的最小腐败限量为7.12lg(cfu/g)，最大菌值采用不同温度下最大菌值的平均值7.34lg(cfu/g)，由此计算出剩余的货架期方程为：

SL＝λ-[(7.3469-N₀)/μ_max×2.718]*ln{-ln[(7.12-N₀)/(7.3469-N₀)]-1}

只要测定出某一温度下样品的初始菌值，并通过二级模型计算出最大比生长速率和延迟期，将其带入上述表达式即可计算出该温度下产品的剩余货架期。

实施列3

经检测烧鸡贮藏过程中的常污染甲型副伤寒沙门氏菌菌(SPA)，本实施例以烧鸡贮藏过程中SPA在冷链过程中波动温度条件下的变化为对象详细说明本发明的具体实施流程。依据图1所示的微生物间歇性动态生长模型构建的流程图，体实施例为：

实验材料：烧鸡原料，当日卤制新鲜烧鸡胴体上的鸡腿肉与鸡胸肉，本实验所使用的新鲜烧鸡是由河南省郑州市某烧鸡生产企业A提供。选取当日最新生产卤制的新鲜烧鸡样品，随机取样，利用隔热冰盒2h内运送至实验室冷藏备用。

甲型副伤寒沙门氏菌标准菌株(SPA)，ATCC 9150，上海士峰生物有限公司提供。XLD沙门氏菌选择性培养基(CM0469，英国Oxoid公司)，NB营养肉汤(北京陆桥技术股份有限公司)。

样品的制备：在无菌条件下迅速将烧鸡胴体上的鸡肉剥离，将鸡肉切成大小均匀体积为1cm3左右的肉块，并将肉块平铺于纱布表面，在蒸锅中蒸汽灭菌10min以消除其他微生物的干扰影响，再将灭菌后的鸡肉样品迅速转移至无菌烧杯中，无菌条件下在超净工作台中用电子天平称取25±0.1g样品/份，分装入无菌封口均质袋中，每袋接种2.5ml稀释菌液(1.5～2.5×103CFU/ml)，用试管按压均质袋，使菌液与鸡肉充分混合均匀，然后排出袋中空气将均质袋封口。

依据步骤S1进行波动温度的设置，通过实地调研烧鸡生产厂家与家庭式烧鸡生产作坊两种生产方式，以及烧鸡从出厂后的运输环境及门店贮藏温度，以及运输过程和在销售过程中贮藏的时间，以实际调研得到的烧鸡在流通、销售等环节环境因素变化范围为依据设置动态波动温度。利用检测的三组动态生长曲线确定动力学参数。不同动态波动温度具体组合方式如实施例1中表1所示。

依据步骤S2菌落计数：在动态波动温度条件下，每当温度发生波动变化时从培养箱中随机取出5份装有样品，计数时间主要是温度变化的时间点，如果培养的温度较高则增加SPA的计数频率，每份烧鸡样品不同的稀释度做5个平行。具体操作步骤：无菌条件下打开均质袋，加入225ml 0.85％无菌生理盐水混匀，使用均质机均质拍打120s。均质后取0.1ml上清液连续倍比稀释接种到XLD(木糖赖氨酸培养基)平板培养基，将接种过的平板培养基放置在37℃恒温培养箱中连续培养16～20h，记录典型SPA的菌落数，同时将菌落数转化为Log CFU/g。

依据步骤S2对烧鸡中SPA的生长变化进行分析，分析不同波动温度条件下SPA的生长变化情况，在波动温度环境条件下，迟滞期烧鸡中的SPA生长速率与温度之间呈正相关的关系，它们的平均生长速率呈现多项式的函数关系。处于对数期的烧鸡中SPA平均生长速率与温度之间呈正相关的关系，在6℃、8℃、10℃在对数期基本一直差异不大，而12℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃这6个温度条件下，它们的平均生长速率随着温度的升高也呈现指数函数的关系，表2降温温度差与菌落下降速率之间的差异性分析表。拟合方程为y＝0.0023e^0.1557x，拟合效果较好，具体见图4至图6所示。

表2降温温度差与菌落下降速率之间的差异性分析

注：图表中结果为平均值±标准差，同一行字母不同者之间差异显著，相同时差异不显著，p<0.05。

依据步骤S3所述的SPA间歇性动态预测模型的构建过程如下：将初始菌量N0，依据方程(9)和(10)，描述微生物生长和存活的一般方程，确定冷链过程中SPA的生长与存活的动力学参数。

在动态分析过程中，前三组波动温度的曲线拟合是为了计算得到5个动力学参数(a，k，T_min，Y_max，)。通过数值分析计算得到的5个动力学参数的值分别为：a＝8.89e-02，k＝4.24e-03，T_min＝8.00e+00，Y_max＝1.91e+01，＝3.26e-01。估算得到的a，k，T_min，Y_max值统计显著(p>0.05)。然而，估算出的k与在统计学上与0没有什么不同，其p值分别为0.2，0.5，当参数值的p>0.05时，无效假设k＝0成立。在接下来的分析中将k分别设置为固定值4.24e-03与3.26e-01。

表3烧鸡中SPA生长与存活的动力学参数值，对三组动态生长曲线进行重新分析以确定最适a、T_min与Y_max。曲线拟合共使用了83个数据点，自由度d_f为3。表3分别列出了a、T_min与Y_max的估算值，在表2中a、T_min与Y_max的p值均小于0.05，这表明它们值的无效假设都是不成立。模型估算的Y_max＝19.6ln CFU/g(或8.52log CFU/g)，标准差为0.50ln CFU/g(0.22logCFU/g)。估算的T_min＝8.36℃，与SPA嗜温特性良好匹配。总体上来看，该模型的MSE为0.20(log CFU/g)2，RMSE为0.44log CFU/g，这表明该模型可以用来预测波动温度条件下烧鸡中SPA的生长变化。

表3烧鸡中SPA生长与存活的动力学参数值

^*MSE：均方差；RMSE：均方根误差。

依据步骤S4进行模型验证，本实施例中，采用步骤S3中所述的模型构建过程建立烧鸡中SPA的预测模型，当模型的动力学参数被确定后，使用两组动态生长曲线与一组恒温曲线对模型进行验证。

图7所示两组波动温度实验的验证结果，两组动态波动温度的范围均在6～35℃范围内。依据上述描述的方法利用微生物预测系统进行自动计算，如图7所示两条波动温度和恒定温度(15℃)生长曲线可计算得到该模型预测的均方根误差(RMSE)分别为0.30logCFU/g和0.33log CFU/g。总体上，用于验证预测模型的两组波动温度与15℃恒温实验服从正态分布，如图8和图9所示。残差的均值与标准差分别为0.04log CFU/g与0.29log CFU/g。绝大多数(91.5％)残差值在±0.5log CFU/g范围内，在实验误差范围内。

本实施例结合现代计算技术与数值分析技术直接构建微生物动态预测模型，以预测微生物学理论和数学分析找出科学构建动态预测微生物模型的突破点，在不进行传统微生物检测的条件下快速预测冷鲜牛肉的品质，从而实现快速、高效地评价冷鲜肉安全性，为企业采取适时调控机制提供依据，大大减少了企业产品变质率，节约了成本，提高了经济效益。

以上所述实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换，均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1.样品动态波动温度的确定；

通过实地调研样品生产厂家、冷链运输环境以及门店销售各个环节环境因素变化，确定冷链肉制品微生物动态波动温度范围；

步骤2.不同温度条件下微生物培养；

使用可编程的精确生化培养箱，模拟步骤1中冷链过程中温度波动的范围，设置培养箱的培养温度及时间参数，并将若干份样品放入培养箱中；

每当温度依据设置的波动温度点发生波动变化时从培养箱中随机取出5份样品，进行细菌总数和优势腐败菌总数平板计数；

步骤3.微生物间歇性动态生长预测模型的构建；

根据细菌总数和优势腐败菌总数、利用Matlab绘制不同条件下微生物生长曲线，分析冷链肉制品微生物的生长特性，用于确定优势致腐、致病微生物的动力学参数和构建其动态预测模型；

步骤3.1.构建微生物生长与存活的一级模型即生长模型；

设定微生物的贮藏温度为T、最低生长温度为T_min，根据不同冷链肉制品中微生物的变化特征，依据贮藏温度T与最低生长温度T_min的大小，利用matlab软件直接构建冷链物流过程中波动温度条件下优势腐败菌的基本生长模型，计算最大比生长速率μ_max,lnCFU/g h-1、延迟期λ和最大菌数N_max，描述优势腐败菌数量随时间变化之间的关系如下所述；

N＝N_L+N_D (3)

式中，t为时间，微生物快速增殖速率为α，细菌总数为N,CFU/g，迟滞期的细菌数量为N_L,CFU/g，对数期的细菌数量为N_D,CFU/g，达到稳定期时的最大菌落数量为N_max,CFU/g；

步骤3.2.构建环境因子与一级模型中微生物生长动力学参数之间的二级模型即环境因素模型；

在不同的温度条件下，用最大比生长速率μ_max和延迟期λ来衡量微生物生长的差异，即利用一级模型中获得的最大比生长速率μ_max、延迟期λ以及最大菌落浓度N_max参数，当T>T_min时，构建温度对微生物生长动力学参数的影响，采用Rosso温度参数模型来描述；

其中，μ是温度为T℃时的比生长速率，T_opt是最适生长温度，此时微生物的生长速率μ_opt达到最佳状态；

步骤3.3.构建冷链肉制品中微生物三级动态模型即高精度智能专家模型，即基于生长模型和环境因素模型之上的综合性软件模型；

既是建立在一级和二级模型基础上的应用软件，生长模型和环境因素模型以模块形式嵌入应用软件，应用软件的程序在计算机上运行，在既定的环境条件下随时反应微生物数量与环境条件之间的对应关系，对于每个生长曲线，生长过程通过常微分方程(1)-(3)结合步骤3.2.中的(4)式来描述；

采用一步动态数值分析方法直接构建高精度智能专家模型，即采用四阶Runge-Kutta数值分析法解微分方程组进行求解；μ通过时间-温度的数据用方程(4)来确定，μ_opt、T_min、T_opt和T_max通过最小平方优化法获得优化数值，一步动态数值分析法具体采用四阶Runge-Kutta算法和Python法进行最小平方优化，在数据优化期间，启动电脑程序，赋予每个参数一个初始猜测值，程序迭代使用初始猜测值去解微生物不同阶段的常微分方程，在每次假设T_min和T_max基础上，每次迭代和迭代继续，数值优化出动态变化时微生物的动力学参数，减少试验误差的积累，从而构建温度波动条件下不同优势致腐微生物的间歇性动态预测模型，实现冷链过程中波动温度条件下优势致腐微生物的快速可视化；

步骤4.模型验证；

步骤3.3构建高精度智能专家模型以后，采用两组动态生长曲线与一组恒温曲线对模型进行验证，通过均方误差MSE、均方根误差RMSE以及残差平方和RSS进行判断预测模型的优劣，然后与所建的模型预测值利用偏差因子B_f和准确因子A_f的大小进行比较，偏差因子B_f用来来评价预测值的上下波动幅度，准确因子A_f用来衡量预测值和实测值之间的差异，对所建立的预测模型进行适合性验证，验证后的模型即为构建的微生物预测模型；

步骤5.冷链过程中不同肉制品货架期的预测模型构建；

货架期预测模型的建立，是依据冷链物流过程中不同肉制品的种类，利用步骤4中构建的微生物预测模型分析特定腐败菌的生长动力学模型，确定最小腐败限量N_s,log(cfu/g)和最大菌值N_max,log(cfu/g)，依据初始菌值N₀增值到N_s的时间来预测冷链肉制品的货架期，货架期SL的模型如下；

SL＝λ-[(N_max-N₀)/μ_max×2。718]×{ln[-ln[(N_s-N₀)/(N_max-N₀)]-1]} (5)。

2.根据权利要求1所述的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2中设置的波动温度点是依据实际冷链过程中温度的动态变化进行模拟设置，精确生化培养箱稳定在每个动态温度曲线的初始温度后，按照实验计划编程改变，定期从精确生化培养箱中取出样品，测定微生物的动态变化量，获得微生物的最低生长温度T_min、最高生长温度T_max、延迟期λ以及最大比生长速率μ_max。

3.根据权利要求1所述的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2中的微生物数量的测定方法是将贮藏在不同温度下的样品，随机取样，采用经典的平板计数和选择性培养基进行优势腐败菌计数，通过对优势致腐微生物在不同时间、不同温度条件下的生长繁殖情况试验，获得生长时的基础数据，针对不同的冷链冷鲜肉形成不同的微生物数据库。

4.根据权利要求1所述的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，其特征在于，所述步骤3.1的公式(1)中，当t＝0时，所有的微生物细胞为迟滞期菌落数量，因此，当t＝0时，N₀＝N_L，N_D＝0，相当于其在迟滞期的细菌数量N_L与对数期的细菌数量N_D之和；

当T<T_min时，微生物将逐渐死亡，假定迟滞期和对数期微生物都在T_min以下的温度死亡，但是以不同的速率死亡，K是微生物在＜T_min时的死亡速度，迟滞期微生物数量变化采用公式(6)，对数期微生物数量变化采用方程为(7)，βKN_L用于描述在T<T_min时一部分对数期微生物被改变为迟滞期微生物，总细胞浓度仍然是迟滞期和对数期微生物数量的总和，如方程(3)所示；

其中,β是系数,K是微生物在T＜T_min时的死亡速率。

5.根据权利要求1所述的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，其特征在于，使用四阶Runge-Kutta数值分析法求解微分方程组，并使用Python法进行最小平方优化来获得最适参数值a、μ_opt、T_min、T_max、β，使得残差和所选择的若干动态生长和存活曲线的总残差平方和RSS最小，其中方程(1)与(2)相同，能够用来表示细菌细胞的生长与死亡，方程中唯一不同的是N_D与N_L的相关系数不同，因此，方程(1)-(3)应用于动态分析研究中作为表达菌落数增长或者下降的方程，当T>T_min时，方程(1)-(3)用来描述冷链肉制品微生物生长速率，当T<T_min时，方程(4)-(5)用来表示温度对冷链肉制品微生物存活的影响。

6.根据权利要求5所述的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，其特征在于，所述的四阶Runge-Kutta数值分析法迭代公式为：

k₁＝f(x_n,y_n)

k₄＝f(x_n+h,y_n+hk₃) (8)

式(8)中的k1，k2，k3，k4是某一点处的斜率值；

所述的步骤3.3中三级模型的构建过程是依据matlab软件将步骤3.1和步骤3.2中的一级模型和二级模型的方程进行简化，具体简化公式为方程(9)和(10)，用于描述微生物生长和存活的一般方程，确定贮藏过程中微生物的生长与存活的动力学参数；

在方程(9)和(10)中，速率项是μ_max或K，取决于贮藏温度，如果T>T_min，则Rate等于μ_max，当T<T_min时，Rate等于K；同样，γ为是α或β，具体为在T≥T_min，γ＝α，在T≤T_min时，γ＝β，参数m由温度决定，当T≥T_min时等于m＝1，当T≤T_min时为m＝0，细菌总数仍表示在方程(3)。

7.根据权利要求1所述的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，其特征在于，所述步骤4中的模型验证是在动力学参数确定以后，通过未被用来进行动力学分析的两组动态生长曲线与一组恒温生长曲线对建立的预测模型进行验证和模型评价，偏差因子B_f和准确因子A_f来判定模型的精确度，偏差度用来检查预测值的上下波动幅度大小，准确度用来判断预测值和实测值之间的差异，具体表达式如下：

式中：N_prd是微生物预测值，N_obs是微生物实测值，n为试验次数；

预测模型的评价方法采用残差平方和RSS，均方误差MSE、均方根误差RMSE、赤池信息量准则AIC以及虚拟判定系数pseudo-R2方法评价模型的预测能力，进一步的RSS、MSE、RMSE、AIC以及pseudo-R2的表达式如下：

式中：y_i是第i小时测定的实测值；是第i小时的预测值；

式中：μ_observed代表实测值；μ_predictived代表预测值；

8.根据权利要求1所述的冷链肉制品微生物间歇性动态预测模型的构建方法，其特征在于，所述步骤5冷链过程中不同肉制品货架期的预测模型构建，针对不同肉制品，利用步骤3中所构建的微生物预测模型选择特定腐败菌的生长动力学最佳模型，确定最小腐败限量N_s和最大菌值N_max，依据初始菌值N₀增值到N_s的时间来预测冷链肉制品的货架期，即利用冷链物流过程中不同的肉制品在贮藏过程中的微生物量的动态变化，首先确定特定腐败菌达到稳定期后的N_max和Ns值，由步骤3.2中的方程(4)计算μ_max与迟滞时间λ，然后根据特定微生物的生长动力学模型计算出特定腐败菌从N₀增殖到N_s的时间来预测货架期SL，同样，根据不同肉制品的最佳一级模型可得到任何时刻t的细菌数N(t)后，t代表时间点，产品的剩余货架期MSL也可进行计算。