CN111159635B - 一种液态益生菌剂保质期预测模型的建立及应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在提供一种用于预测活菌类液态益生菌剂有效期的模型，及其建立方法和应用，所建立的模型可以依据活菌类液态益生菌产品出厂时益生菌浓度，产品在运输、贮藏以及货架期上的实时温度变化情况，预测出产品中益生菌的活菌数目，然后依据活菌类益生菌产品在其保质期内活菌数目不得少于6.0log CFU/mL的标准，实时预测出活菌类液态益生菌产品的保质期。本发明提供的方法适用于任何液态活菌类益生菌产品，为液态益生菌剂产品有效期评估提供快速简便的技术方法。

Description

一种液态益生菌剂保质期预测模型的建立及应用方法
技术领域
本发明属于液态益生菌剂及及冷链物流监控技术领域，具体涉及种液态益生菌剂保质期预测模型及其应用，即一种预测在波动温度下运输贮藏的液态益生菌有效期的方法。
技术背景
人体的肠道中存在大量的乳酸菌，它是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，乳酸菌可以改变肠道内环境，抑制有害菌繁殖，调整胃肠道菌群平衡，改善肠道功能，在很大程度上缓解或治疗肠道疾病，并能提高人体免疫力，并且乳酸菌还具有抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、降血压的功效。
目前市场上益生菌产品分为液体剂型和固体剂型，液体剂型由于含有丰富的代谢产物，所以能够快速调理胃肠道微环境，作用效果快。液体口服液还有服用方便等优点，所以占有一定的市场份额。
液体菌剂最大的问题是如何保存较高的活菌量，活菌口服液中活菌的数量对其功能性的发挥非常重要，只有达到一定活菌量的益生菌才能够在人体能发挥其益生作用。在益生菌类保健食品申报与审评(国食药监注[2005]202号文件)中规定活菌类益生菌保健食品在其保质期内活菌数目不得少于106cfu/mL(g)，所以提高益生菌的稳定性对于益生菌产品保质期和功效来说非常重要。
有关液体菌剂的菌体数量和保质期，都是按照传统的微生物学检测方法来检测，需要对不同储藏和运输条件下的液体菌剂进行抽样检查，不但费时费力，并且结果需要在48小时之后或更长才能得知，严重滞后。而预测模型可以根据液体制剂中微生物在不同条件下的死亡率规律，对其数量变化趋势进行模拟运算，从而达到实时预测液体菌剂菌量变化和保质期的目的。
目前预测微生物学主要用在食品领域预测病原微生物的生长和死亡，定量地评估该食品安全程度，给食品货架期提供数据支持。很多微生物预测模型都是针对食品中病原菌生长的，而在液体菌剂领域，预测微生物学模型几乎没有应用。
发明内容
本发明的目的在提供一种用于预测活菌类液态益生菌剂有效期的模型，及其建立方法和应用，所建立的模型可以依据活菌类液态益生菌产品出厂时益生菌浓度，产品在运输、贮藏以及货架期上的实时温度变化情况，预测出产品中益生菌的活菌数目，然后依据活菌类益生菌产品在其保质期内活菌数目不得少于6.0log CFU/mL的标准，实时预测出活菌类液态益生菌产品的保质期。本发明提供的方法适用于任何液态活菌类益生菌产品，为液态益生菌剂产品有效期评估提供快速简便的技术方法。
本发明首先提供了一种液态益生菌剂有效期预测模型的建立方法，包括如下步骤：
1)将液态益生菌剂产品置于不同温度下恒温贮藏，采用标准的取样法和微生物检测法，分别定时取样测定液态益生菌剂产品中活菌的数量；
2)将在步骤1)中测得的液态益生菌剂产品在不同恒温贮藏条件下的活菌浓度数据采用公式A进行Fermi一级模型的拟合，求得液态益生菌剂产品在该条件下的液体益生菌剂灭活速率kD和益生菌菌剂数量稳定期tL；
其中，t为时间d，Nt为在t时间的活菌数，N0为初始的活菌数，S(t)为Nt与N0的比值；kD为液体益生菌剂灭活速率，tL为益生菌菌剂数量稳定期，e为自然常数；
3)将一级模型中获得的液体益生菌剂灭活速率kD用平方根二级模型(公式B)拟合获取kD与温度T的变化关系，通过计算实测与拟合值的最小残差平方和(RRS)，求得常数b和Tmin，选用公式C来描述液态益生菌剂数量稳定期tL和温度T的变化关系，求得常数a和c；
其中，T为温度，Tmin为液态益生菌剂活菌数会衰减的理论最低温度，kD为液体益生菌剂灭活速率，tL为液态益生菌剂数量稳定期，a、b、c为常数；
4)预测在动态变化温度下的液态益生菌剂的活菌数，使用公式(A)的微分形式公式(D)，其表示在极小时间范围内单位时间内S(t)的变化；尽管温度在动态变化，但在某个足够小的时间范围内可以认为温度是恒定的，其对应该时间范围内的kD-int和tL-int也恒定，从而ΔS(t)/Δt＝dS(t)/dt在这个时间范围内是恒定值；采用欧拉方法(Euler'smethod)，整合每个足够小时间范围的ΔS(t)，预测出动态温度下在任一时间点的S(t)及活菌数Nt,
将一二级模型相结合，根据液态益生菌剂初始活菌浓度，运输贮藏过程中温度的动态变化，可以获得液态益生菌剂在任一时间点的活菌数Nt,从而预测出液态益生菌剂的保质期。
本发明还提供上述方法所建立的预测模型；
本发明还提供了所述预测模型在液态益生菌剂有效期评估中的应用，其一种方法包括如下步骤：
1)检测液态益生菌剂产品出厂时的活菌量；
2)通过温度自动记录设备记录液态益生菌剂产品在运输贮存过程中的温度变化，实时录入上述预测模型，预测出液态益生菌剂产品在不同时间的活菌数；
3)依据液态益生菌剂产品活菌数不得低于6.0log CFU/mL的标准，实时判定出液态益生菌剂产品的有效期；
4)同时，也可根据贮存条件的未来温度变化，来预测在这种条件下液态益生菌剂产品的保质期还有多少天。
本发明所建立的预测模型可以在预测出在波动温度下液态益生菌剂活菌的灭活情况，进而将预测模型和冷链监控系统相结合，实时预测出液态益生菌剂产品的有效期。本发明的方法无需使用传统的微生物检测手段，只需要知道运输贮藏过程中的温度变化情况和所用时间，初始的益生菌活菌数便可以直接预测出产品的货架期；而传统的检测方法需要对液态益生菌产品抽样微生物检测，结果需要在48h后才能知道，滞后性严重。本发明根据液态益生菌剂在不同温度下的灭活速率，建立一个益生菌在动态贮藏温度下的灭活曲线模型，通过模拟预测益生菌的存活情况，同时也可获取有效的益生菌保藏条件，大大提高产品的保质期。
附图说明
图1为在不同的温度下贮藏时液态益生菌活菌数的实测值(log CFU/mL)与一级模型拟合值对比图,其中○为实测值，实线为预测值；(A)为4℃贮藏时的活菌数实测值与拟合值；(B)为15℃贮藏时的活菌数实测值与拟合值；(C1)为25℃贮藏时的活菌数实测值与拟合值；(C2)为25℃贮藏时的活菌数实测值与拟合值；(C3)25℃为贮藏时的活菌数实测值与拟合值；(D)为37℃贮藏时的活菌数实测值与拟合值；
图2(A)为不同温度下贮藏时液态益生菌剂活菌灭活速率kD与温度T的二级模型拟合结果图，其中○为实测值，实线为拟合值(数据通过平方根转换后获得最佳拟合结果)；
图2(B)为不同温度下贮藏时液态益生菌剂活菌数量稳定期tL与温度线性关系(数据通过平方根转换后获得最佳拟合结果)图，◇为不同实测值；
图3为某一批次的液态益生菌产品在常温下存放时所经历的温度变化图；
图4为某一批次的液态益生菌在常温下贮藏时活菌数的实测值与预测值对比图，其中○为实测值，实线为预测值，虚线为预测值±1.0log CFU/mL的可接受预测范围。
具体实施方式
目前预测微生物学主要用在食品安全领域预测病原微生物的生长和死亡，定量地评估该食品安全程度，给食品货架期提供数据支持。而在液态益生菌剂领域，预测微生物学模型几乎没有应用。本发明根据液体菌剂在不同条件下的灭活速度，建立一个微生物灭活曲线模型，根据微生物灭活模型能显示哪一种因子具有重要的影响，通过模拟预测微生物存活情况，求得有效的益生菌保藏条件，大大减少产品开发的时间和成本。
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1波动温度下的液态益生菌剂产品有效期预测模型的建立一、预测模型的建立
1、测定液态益生菌剂样品在不同恒温贮藏条件下时活菌数用于建模。
1.1生长培养实验
称取红糖、白砂糖、葡萄糖、酵母粉、聚葡萄糖、低聚果糖、甜蜜素、黄原胶，混合均匀加入到三角瓶中，搅拌溶解，再加入糖蜜，最后蒸馏水定容，其中各原料的质量体积比(g/ml)分别为：红糖0.5％，白砂糖5％，葡萄糖0.5％，糖蜜2％,酵母粉0.2％，低聚果糖0.1％，聚葡萄糖1％,黄原胶0.35％，甜蜜素0.06％，将原料115℃，高压灭菌30分钟。接种副干酪乳杆菌IMC-4(Lactobacillus paracasei IMC-4)CCTCC NO:M
2012174、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)CGMCC:1.1854、植物乳杆菌(L.plantarum)CGMCC:1.103和干酪乳杆菌(L.casei)
CGMCC:1.2435四种乳酸菌，接种量均为0.2％。接种完后摇匀，37℃静止发酵24小时。然后把发酵液分别放于4℃、15℃、
25℃、37℃恒温箱里面，经过适当的时间间隔，取出一定量的样品进行活菌数目的检测。每个时间点取2个重复样品检测。
1.2液态益生菌样品活菌数目检测
按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》的操作进行。
2、采用Fermi一级模型(公式A)预测液态益生菌剂在某一恒定温度下随时间的灭活情况，模型如下：
其中，t为时间(天)，Nt为在t时间的活菌数，N0为初始的活菌数,S(t)为Nt与N0的比值，kD为液体益生菌剂灭活速率，tL为益生菌菌剂数量稳定期，e为自然常数。
实验结果显示液态益生菌剂发酵完成后在恒温条件下贮藏时活菌数会保持一段时间的恒定，且恒定时间与贮藏温度相关。超过一定的贮藏时间后，液态益生菌剂的活菌数便会下降，直至活菌数降为零。如图1所示，○为在不同恒温条件下液态益生菌剂活菌数的实测值。
将在步骤1测得的液体益生菌剂在不同温度下贮藏时的活菌数进行Fermi一级模型的拟合，通过计算实测值与拟合值的残差平方和RSS(Residual sum of square)，使用微软Excel加载项规划求解功能以RSS最小为目标，拟合出液态益生菌剂活菌的灭活曲线。。求得液体益生菌剂的灭活速率kD和活菌数量稳定期tL。结果见表1。
表1：液态益生菌剂的灭活速率kD和活菌数量稳定期tL
3、选用平方根二级模型(公式B)描述灭活速率kD随温度的变化关系，选用菌剂生理状态参数a和c来描述活菌数量稳
定期tL随温度T的变化关系(公式C)。
其中，T为温度，kD为液体益生菌剂灭活速率，tL为液态益生菌剂数量稳定期，Tmin为液态益生菌剂活菌数会衰减的理论最低温度，a、b、c为常数。
为求得动态温度下液态益生菌剂活菌数，需使用公式(A)的微分形式即公式(D)描述在某一Δt时间内的ΔS(t)变化量。
其中，t为时间，kD-int和tL-int分别代表Δt时间内的kD和tL，并用Δt时间内的平均值代替。尽管温度在动态变化，但在某个足够小的时间范围内可以认为温度是恒定的，其对应该时间范围内的kD-int和tL-int也是恒定的。采用欧拉方法(Euler's method)，使用时间步长为0.01天，整合每个足够小时间范围的ΔS(t)，即可预测出动态温度下在任一时间点的S(t)及活菌数Nt。
一种具体步骤如下：
将一级模型中获得的灭活速率kD平方根与二级模型(公式B)拟合，通过计算实测值与拟合值的残差平方和RSS(Residual sum of square)，使用微软Excel加载项规划求解功能以RSS最小为目标，拟合出kD与T的线性关系，求得常数b为0.0227，Tmin为-5.34℃，结果如图2(A)所示。通过公式C求得一级模型中获得活菌数稳定期tL与温度T的关系，结果如图2(B)所示，a为-0.2898，c为13.821。
在任一时间点对应的任一温度下，用Δt时间内kD和tL平均值代表该时间点下kD-int和tL-int，利用公式D获得在Δt时间内的ΔS(t)，S(t)为S(t-1)和ΔS(t)之和，S(t0)＝1，根据公式(A)得出在时间t下对应S(t)的Nt。
对于波动温度下的模型预测结果评估，本发明采用目前国际上主流学术界通用的针对波动温度环境下的评估标准，可接受预测范围(acceptable simulation zone)评估法，即：将预测值±1.0log CFU/mL的范围设定为可接受预测范围，而实测值若有75％以上在这个可接受预测范围内，则模型预测结果合格。
4、将以上模型相结合，根据液态益生菌剂初始活菌浓度，运输贮藏过程中温度的变化和耗时，预测出液态益生菌剂的保质期。
(1)实测液态益生菌剂的初始浓度；
(2)将液态益生菌剂在运输、贮存各环节的温度和耗时，录入上述模型，预测出液态益生菌剂产品在不同时间点的活菌浓度；
(3)依据液态益生菌剂产品活菌数不得低于6.0log CFU/mL的标准，实时预测出液态益生菌剂产品的有效期。
实施例2使用预测模型对液态益生菌剂产品在动态温度下货架期预测
为了验证本发明模型的预测结果是否准确，对某一批次的液态益生菌产品在自然常温条件下(时间：2019年7月到9月的一段时间，地点：山东青岛)存放时的活菌数进行检测，分别在第0、6、8、
11、19、25、32、39、43、46、48、53天检测取样，每个时间点取2份平行样。实际检测结果显示：在第32天时的活菌数7.1log
CFU/mL,在约第39天时的活菌数为5.2log CFU/mL，约第53天时活菌数降为0。同时，温度记录设备实时记录产品在仓库中经历的温度变化，每20分钟记录一次。
图3为本实验批次的液态益生菌剂产品在常温存放时所经历的温度变化，该温度曲线是用路格L91-1型号温度黑匣子记录仪自动记录的。温度测定时间为青岛地区7月31日到9月18日实验室内西侧靠窗处温度，记录数据期间早晚温差大约相差10℃，白天最高温度达到37.6℃，夜间最低温度达到21.9℃。
如图4所示，该预测模型预测此环境温度下存放的液态益生菌在37.16天活菌量为6.0log CFU/mL，因此该模型预测出的液态益生菌有效期为37天。
而且图4所示的实测与预测结果对比可知，在其中实测的24个点中有5个点不在±1.0log CFU/mL的可接受预测范围内，预测准确率达到19/24＝79.2％，高于75％，预测结果良好。
上述结果表明，本发明所述模型的预测结果与实际的检测结果吻合，准确性高。特别在活菌数降到4.0log CFU/mL之前，非常精确，所有实测点都落在可接受范围内，可以完美预测该液态益生菌剂产品在何时活菌数会降到6.0log CFU/mL，也即产品的保质期。
本发明所建立的预测模型能够准确的预测出波动温度下液态益生菌剂产品货架期，实时监控及预测结果能够随时掌握，实现人工智能监控，通过溯源系统直接追踪产品有效期，给消费者提供可靠有效的益生菌产品。

Claims (4)

1.一种液态益生菌剂有效期预测模型的建立方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)将液态益生菌剂产品置于不同温度下恒温贮藏，分别定时取样测定液态益生菌剂产品中活菌的数量；
2)将在步骤1)中测得的液态益生菌剂产品在不同恒温贮藏条件下的活菌浓度数据采用公式(A)进行Fermi一级模型的拟合，求得液态益生菌剂产品在该条件下的液体益生菌剂灭活速率kD和益生菌菌剂数量稳定期tL；
其中，t为时间，Nt为在t时间的活菌数，N0为初始的活菌数，S(t)为Nt与N0的比值；kD为液体益生菌剂灭活速率，tL为益生菌菌剂数量稳定期，e为自然常数；
3)将一级模型中获得的液体益生菌剂灭活速率kD用平方根二级模型公式(B)拟合获取kD与温度T的变化关系，通过计算实测与拟合值的最小残差平方和(RRS)，求得常数b和Tmin，选用公式(C)来描述液态益生菌剂数量稳定期tL和温度T的变化关系，求得常数a和c；
其中，T为温度，Tmin为液态益生菌剂活菌数会衰减的理论最低温度，kD为液体益生菌剂灭活速率，tL为液态益生菌剂数量稳定期，a、b、c为常数；
4)预测在动态变化温度下的液态益生菌剂的活菌数，使用公式(A)的微分形式公式(D)，其表示在极小时间范围内单位时间内S(t)的变化；尽管温度在动态变化，但在某个足够小的时间范围内可以认为温度是恒定的，其对应该时间范围内的kD-int和tL-int也恒定，从而ΔS(t)/Δt＝dS(t)/dt在这个时间范围内是恒定值；采用欧拉方法(Euler's method)，整合每个足够小时间范围的ΔS(t)，预测出动态温度下在任一时间点的S(t)及活菌数Nt,
将一二级模型相结合，根据液态益生菌剂初始活菌浓度，运输贮藏过程中温度的动态变化，可以获得液态益生菌剂在任一时间点的活菌数Nt,从而预测出液态益生菌剂的保质期。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中测定液态益生菌剂产品中活菌的数量，是采用标准的取样法或微生物检测法。
3.一种预测液态益生菌剂有效期的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的方法构建的液态益生菌剂有效期预测模型来进行预测的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)检测液态益生菌剂产品出厂时的活菌量；
2)通过温度自动记录设备记录液态益生菌剂产品在运输贮存过程中的温度变化，实时录入上述预测模型，预测出液态益生菌剂产品在不同时间的活菌数；
3)依据液态益生菌剂产品活菌数不得低于6.0log CFU/mL的标准，实时判定出液态益生菌剂产品的有效期；
4)同时，也可根据贮存条件的未来温度变化，来预测在这种条件下液态益生菌剂产品的保质期。
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豆腐中库特氏菌生长动力学模型和货架期预测;李除夕等;《农业工程学报》;20090630;全文 *

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