CN111500752A - 副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法 - Google Patents

副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种副溶血性弧菌的PMA‑qPCR检测方法，所述检测方法采用PMA对菌液进行预处理，使PMA与菌体DNA交联，再提取菌体DNA作为模板进行qPCR扩增，根据采集的荧光信号Ct值判断样品是否含有副溶血性弧菌。本方法检测灵敏度高、特异性强、耗时短，并能有效排除死菌DNA的干扰，达到特异性检测活菌的效果，可用于对食品中副溶血性弧菌的快速检测。

Description

副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法
技术领域
本发明属于检验检疫领域，涉及副溶血性弧菌的检测方法，具体涉及副溶血性弧菌PMA-qPCR检测方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是导致胃肠道感染的主要致病菌，广泛存在于海水、沉积物和各类海鲜中。副溶血性弧菌感染可引起腹泻、呕吐、腹部痉挛，在少数情况下可引起发烧。我国食源性疾病监测网站相关工作人员调查了其监测地区(16个省)14年间的8000多起食物中毒案例，发现微生物性病原仍然是我国食源性疾病的主要病因(占30％～40％)。近10年来，由交叉污染导致肉类食品或水产品而引起的副溶血性弧菌食物中毒已取代沙门氏菌，跃居第1位。因此，迫切需求一种快速、简便、准确、实用的检测方法对副溶血性弧菌进行实时监控。
用传统培养法检测食品中的副溶血性弧菌一般需要经历增菌、选择性平板培养、生化鉴定等过程，检测周期长达5～7d，检测流程复杂，对检测人员要求较高。而对副溶血性弧菌的定量检测，在对样品中的病原菌做定量分析后还需要对可疑菌落做定性验证，使得检测周期更长。分子生物学方法如PCR、qPCR及LAMP具有检测灵敏度高、特异性强和耗时短等优点，但是上述方法均不能区分活菌和死菌，用于食品中副溶血性弧菌的检测容易导致假阳性的结果，因为细菌DNA在菌体死亡后还能留存几天到几周。有研究者使用了反转录PCR检测mRNA的方法来解决特异性检测活菌的难题，然而由于mRNA提取难度大且易降解，该方法并未广泛使用。
叠氮溴化丙锭(PMA)是一种具有鉴别功能的核酸染料，可用于PCR(qPCR)，有效排除死菌DNA的干扰，达到特异性检测活菌的效果。目前，众多学者已将PMA处理同qPCR结合应用于各种活菌检测，包括单增李斯特杆菌、大肠杆菌O157∶H7、弯曲菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等。然而，将上述方法用于副溶血性弧菌检测的研究尚不多见。针对副溶血性弧菌检测中出现的问题，结合PMA在活菌检测中的应用，本发明开发了副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强和耗时短的副溶血性弧菌活菌检测方法，采用PMA标记菌体后提取菌体DNA，再进行qPCR扩增，根据荧光数据的Ct值判断检测结果。
所述检测方法包括以下步骤：
1)利用PMA对菌液进行预处理，使PMA与死亡或细胞膜损伤菌体DNA交联；
2)提取菌体DNA；
3)采用特异性引物对步骤2)提取的DNA模板进行qPCR扩增，采用的引物和探针的序列如下：
Figure BDA0002462862810000021
4)采集荧光信号，得到qPCR产物的Ct值，Ct值≤35的样本为阳性，Ct值显示为无的样本为阴性；35＜Ct值≤40，判为可疑样品，对于可疑样品，先看扩增曲线，如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性；对于可疑阳性样品，重新提取核酸进行检测，如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为阳性，否则判为阴性。
进一步的，步骤1)具体为：样品接种至接种至225mL的3％NaCl碱性蛋白胨水中，37℃下以180rpm振荡孵育6h-18h。菌液5000×g转速下离心5min后用PBS缓冲液洗涤2-3次后菌重悬于PBS中。在避光条件下向重悬菌液中加入PMA工作液，使其终浓度为4μM，充分混匀后，避光处理5min，间隔振动，使样品和PMA充分反应，置于光照强度40w下照射3min。
进一步的，所述PMA工作液配制方法为：将1mg的PMA染料溶解于200μL的二甲基亚砜(20％DMSO)中混合均匀得到10mM浓度的储存液，放置于-20℃冰箱中避光保存。将PMA储存液稀释10倍后即为浓度1mM的PMA工作液，置于-4℃冰箱中避光保存。
进一步的，qPCR扩增反应体系如下：
试剂 使用量 终浓度
Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×) 10μL 1×
上游引物(10μM) 0.8μL 0.4μM
下游引物(10μM) 0.8μL 0.4μM
探针溶液 0.4μL 0.2μM
ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.2μL 0.5×
DNA模板 2μL
无核酸酶水 5.8μL
总体积 20μL
进一步的，所述qPCR扩增反应条件为：95℃预变性30sec，每个循环为：95℃，5sec；60℃，34sec；40个循环。
本发明的有益效果在于：方法采用PMA处理和qPCR手段相结合检测副溶血性弧菌，特异性强、灵敏度高、可检测活菌，实验结果显示常见致病菌对照组、灭活菌对照组和水均未出现阳性结果。平行样的Ct值基本相同，表明本方法重复性好。本方法较传统检测方法操作简单，大大缩短了检测时间，是一种高效、快速、准确的副溶血性弧菌检测手段。
附图说明
图1、图2为PMA处理后副溶血性弧菌活菌qPCR扩增结果。
图1对照组为大肠杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌；图2对照组为副溶血性弧菌灭活菌和水。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例中采用的仪器、试剂等，如无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂，可通过商业途径获得。
实施例1
分别选取对照菌大肠杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌和三株不同的副溶血性弧菌，接种至225mL的3％NaCl碱性蛋白胨水中，在37℃下以180rpm振荡孵育6h-18h。
将1mg的PMA染料溶解于200μL的二甲基亚砜(20％DMSO)中混合均匀得到10mM浓度的储存液，放置于-20℃冰箱中避光保存。将PMA储存液10倍比稀释后浓度为1mM为工作液使用，置于-4℃冰箱中避光保存。
菌液在5000×g转速下离心5min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2-3次后菌重悬于PBS中，备用。重悬菌液中加入PMA工作液，终浓度为4μM(黑暗环境下)，充分混匀后，避光处理5min，间隔振动，使样品和PMA充分反应，置于BLU-V System光照仪器下光照强度为40w，照射3min。
利用DNA试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)进行DNA的提取。
qPCR反应引物和探针序列如下：
引物/探针 序列信息(5’-3’)
toxR-F AACGATCGTAGAGCCGTCTT
toxR-R CTCACCAATCTGACGGAACTG
toxR-P FAM-ACGCAATCGTTGAACCAGAAGCGCCA-TAMRA
20μLqPCR反应体系，如下：
试剂 使用量 终浓度
Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×) 10μL 1×
PCR Forward Primer(10μM) 0.8μL 0.4μM
PCR Reverse Primer(10μM) 0.8μL 0.4μM
Probe 0.4μL 0.2μM
ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.2μL 0.5×
DNA模板 2μL
无核酸酶水 5.8μL
总体积 20μL
利用ABI7500 real-time PCR仪器进行检测，反应条件为：95℃预变性30sec，每个循环为：95℃，5sec；60℃，34sec(收集信号)。总共40个循环，反应结束后利用ABI7500自带软件获取数据。
结果显示，仅三株副溶血性弧菌有扩增，Ct值为19左右，结果均为阳性；对照菌无Ct值，结果均为阴性(如图1)。说明本方法具有明显特异性和准确性。
实施例2
分别选取副溶血性弧菌活菌作为样品，灭活菌和水作为对照组，具体方法步骤同实施例1。实验结果显示，副溶血性弧菌活菌组有qPCR扩增，结果为阳性，灭活菌组和对照组均无Ct值，为阴性(如图2)。说明本方法能对副溶血性弧菌活菌进行有效检测。

Claims (4)

1.一种副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法，其特征在于，所述检测方法采用PMA对菌液预处理后提取菌体DNA，再进行qPCR扩增，根据荧光数据的Ct值判断检测结果。
2.根据权利要求1所述的副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
1）利用PMA对菌液进行预处理，使PMA与死亡或细胞膜损伤菌体DNA交联；
2）提取菌体DNA；
3）采用特异性引物对步骤2）提取的DNA模板进行qPCR扩增，采用的引物和探针的序列如下：
上游引物toxR-F：5’-AACGATCGTAGAGCCGTCTT-3’
下游引物toxR-R：5’-CTCACCAATCTGACGGAACTG-3’
探针toxR-P：FAM-5’-ACGCAATCGTTGAACCAGAAGCGCCA-3’–TAMRA；
4）采集荧光信号，得到qPCR产物的Ct值，Ct值≤35的样本为阳性，Ct值显示为无的样本为阴性；35＜Ct值≤40，判为可疑样品，对于可疑样品，先看扩增曲线，如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性；对于可疑阳性样品，重新提取核酸进行检测，如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为阳性，否则判为阴性。
3.根据权利要求2所述的副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法，其特征在于，步骤1）具体为：样品接种至碱性蛋白胨水中，36℃振荡孵育6h-18h，菌液离心后用PBS缓冲液洗涤2-3次后菌重悬于PBS中，在避光条件下向重悬菌液中加入PMA工作液，使其终浓度为4μM，充分混匀后，避光处理、间隔振动，再置于40w光照强度下照射3min。
4.根据权利要求2所述的副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测方法，其特征在于，所述qPCR扩增反应条件为：95℃预变性30sec，每个循环为：95℃，5sec；60℃，34sec；40个循环。
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