CN109022549A - Pma与微滴式数字pcr结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细胞菌的方法 - Google Patents

Pma与微滴式数字pcr结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细胞菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PMA与微滴式数字PCR结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细胞菌的方法，包括如下步骤：（1）样品采集与处理；（2）待测样品DNA提取；（3）采用ddPCR扩增引物及探针引物对副溶血性弧菌tlh基因进行检测。本发明的引物特异性强，灵敏度高，准确性高，可准确定量，检测快速，由于采用分子基因扩增技术，无须经过传统的培养增菌过程，整体检测过程只需3‑4h内完成，检测结果与传统平板计数方法基本一致，检测时间缩短了3‑5d。

Description

PMA与微滴式数字PCR结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细 胞菌的方法
技术领域
本发明属于食品微生物检测领域，具体涉及采用PMA与微滴数字PCR结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细菌的方法。
背景技术
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一种嗜盐性食源性致病菌，属弧菌科弧菌属，主要存在于近海岸的海水，海底沉积物和鱼虾类，贝类及盐渍加工的水产品中。我国华东地区沿岸海水副溶血性弧菌检出率为47.5%-66.5%，海产鱼虾的平均带病率为45.6%-48.7%，夏季甚至高达90%以上，是我国细菌性食物中毒的首要病原菌。传统的副溶血性弧菌定量检测方法主要为培养计数法，通过生化表型对分离培养的可疑细菌进行逐个检测，但因其检测周期长、操作繁琐等缺点不能满足现代快速准确检测的要求。随着分子生物学技术的快速发展，酶联免疫吸附法、聚合酶链式反应、实时荧光定量PCR等方法为细菌的快速检测提供了更多的选择，并且以特异性强、灵敏度高的优势在食品病原微生物的检测中得到了广泛的应用。但这些方法都不能区分死活菌，较高的假阳性结果也给检测结果的准确性带来了很大的干扰，无法对样品中致病性活细胞进行精确定量。
叠氮溴化丙锭（propidiummonoazide，PMA）是一种与核酸具有高度亲和力的荧光染料，它可以选择性地渗透受损细胞的细胞膜，在强光的照射下，与非活性细胞的DNA共价结合，从而抑制后续的PCR反应；而对于具有完整细胞膜的活细胞，PMA被阻隔在细胞外，游离在溶液中与水分子结合并失活，对后续从具有完整细胞膜的活细胞提取的DNA和PCR扩增不会造成影响。通过对细胞膜完整性的辨识，并与PCR结合后，PMA可以实现快速、特异性地对活细胞进行筛选检测，消除对死细胞的干扰，避免基于核酸检测方法中假阳性结果的出现。
微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）是一种核酸分子绝对定量检测技术，一般包括两个部分，即PCR扩增和荧光信号分析。首先，微滴发生器能够将一份样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测。与荧光定量PCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不同，微滴式数字PCR是在扩增结束后对每个液滴反应的荧光信号进行采集，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的个数与比例，通过分析软件计算出待检靶分子的浓度或起始拷贝数。相比实时荧光定量PCR，ddPCR对检测目标的定量无需建立标准曲线，在低浓度的核酸含量下，也可以高度灵敏和准确的实现对核酸拷贝数的绝对定量，广泛应用于基因表达分析、致病菌检测和转基因食品检测等。
因此，PMA-ddPCR检测方法的建立，不仅能选择性的区分死细菌和活细菌，还能对样品中副溶血性弧菌进行快速、准确的定量检测，为食源性病原菌检测开辟了新的技术领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速，准确并定量检测副溶血性弧菌活细菌的方法，可用于食品中副溶血性弧菌活细菌的定量检测。
本发明采用以下技术方案实现：
一种PMA与微滴式数字PCR结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）样品采集与处理：
PMA处理待测样品：取食品样品，加入APW后均质，取均质液12000r/min下离心，弃上清液，向沉淀中加入去离子水，振荡至沉淀悬浮且分散均匀，加入终浓度为16μg/mL的PMA后混匀，避光孵育，使用核酸光标记仪曝光；
（2）待测样品DNA提取：
采用Chelex-100法提取菌悬液DNA：取PMA处理后的菌悬液至灭菌离心管，12000r/min下离心，弃上清，于沉淀中加入10％Chelex-100溶液，剧烈振荡5~10s；56℃水浴 30min，取出振荡，95℃加热10 min，剧烈振荡5~10s；12000r/min下离心5min，取上清液作为DNA模板；
（3）采用ddPCR扩增引物及探针引物对副溶血性弧菌tlh基因进行检测：
a）ddPCR反应体系设置为20μL，其中包括:
2×Supermix 10μL，
正反向引物各1.5μL，10μmol/L，
探针引物0.5μL，10μmol/L，
DNA模板4μL，无菌超纯水补足至20μL；
b）反应条件设置为：
95 ℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，共40个循环；98℃ 10 min；4℃；
c）ddPCR反应结束后将96孔板放入QX200Droplet Reader，在软件QuantaSoft里依次录入样品信息后点击运行，仪器自动采集荧光信号，运行完毕后自动计算出最终结果；
d）引物序列为：
tlh2-F：CACAATGGCGCTTCCCTAAC；
tlh2-R：GCGCGATGTATTGGTTCTCA；
tlh2-P：FAM-AAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCA-BHQ。
本发明建立了PMA-ddPCR定量检测食品中副溶血性弧菌活细菌，并通过实际样本证明：本发明检测方法灵敏、准确、直观，对农业部、市场监管局、海关、卫生防疫等政府部门以及相关检测机构和企业提供了新的检测方法并具有指导意义。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）引物特异性强，与非近缘菌株如沙门氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无交叉反应，而且不受弧菌科中的溶藻弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、最小弧菌和拟态弧菌等其它常见近缘菌株的干扰。
（2）灵敏度高，相比荧光定量PCR对菌液浓度的检测灵敏度为2×102cfu/mL左右，而本方法采用的微滴式PCR对菌液浓度的灵敏度可达到约2×101cfu/mL，拷贝数浓度为1.55copies/μL。
（3）准确性高，结合ddPCR对检测样本可绝对定量的方式，被检测样本核酸分为几万个微滴进行反应，降低了扩增反应抑制物的影响，避免假阴性结果的出现。
（4）可准确定量，由于PMA可阻隔死亡细菌DNA的扩增，本方法的扩增检测对象就限制在副溶血性弧菌的活细菌中，通过ddPCR绝对定量的方式，定量检测食品中具有致病性的副溶血性弧菌活菌，消除了食品死亡细菌“假阳性”结果的出现。
（5）检测快速，由于采用分子基因扩增技术，无须经过传统的培养增菌过程，整体检测过程只需3-4h内完成，检测结果与传统平板计数方法基本一致，检测时间缩短了3-5d。
附图说明
图1为引物tlh2对非近缘物种菌株和近缘物种菌株的特异性qPCR扩增图；
图1A中有扩增曲线的菌种是副溶血性弧菌，其他无扩增的菌种为非近缘物种菌株；图1B中有扩增曲线的菌种是副溶血性弧菌，其他无扩增的菌种为近缘物种菌株
图2为传统平板计数、荧光定量PCR与PMA-ddPCR在不同活菌比例下的结果；
图3为PMA-ddPCR对副溶血性弧菌的灵敏度检测；
注：H03、A04、B04、C04、D04、E04分别对应为菌液浓度2.4x106～101cfu/ml提取DNA量PMA-ddPCR灵敏度的一维散点图；
图4为人工污染副溶血弧菌基围虾样品平板计数与PMA-ddPCR结果对比；
图5为人工污染副溶血弧菌帆立贝样品平板计数与PMA-ddPCR结果对比。
具体实施方式
为了更清楚的说明本发明的方法，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此：
实施例1：引物特异性实验结果
特异性实验用菌株信息：非近缘物种菌株：沙门氏菌（ATCC 14028）、阪崎肠杆菌（ATCC12868）、大肠杆菌（ATCC 25928）、金黄色葡萄球菌（CMCC 26001）；近缘物种菌株：副溶血性弧菌（ATCC 17802）、溶藻弧菌（CMCC 1833）、河流弧菌（CMCC 1613）、创伤弧菌（ATCC27562）、最小弧菌（CMCC 1969）、拟态弧菌（ATCC33847）。
菌株复苏活化后，接种至增菌培养基制备成菌悬液，取菌悬液1mL至1.5mL灭菌离心管，12000r/min下离心1min，弃上清，于沉淀中加入200μL10% Chelex-100溶液，剧烈振荡5~10s；56℃水浴 30min，取出振荡，95℃加热10 min，剧烈振荡5~10s；12000r/min下离心5min，取上清液作为DNA模板。
应用实时荧光PCR进行引物特异性检测，根据副溶血性弧菌不耐热溶血素基因tlh保守区域利用Primer Express 3.0设计引物及探针，序列分别如下：
tlh2-F：CACAATGGCGCTTCCCTAAC；
tlh2-R：GCGCGATGTATTGGTTCTCA；
tlh2-P：FAM-AAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCA-BHQ。
反应体系：qPCR反应体系（25μL）：Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5μL，正反向引物各1.0μL（10μmol/L），探针0.5（10μmol/L），DNA模板5μL，无菌超纯水补足至25μL。反应条件设置为：95 ℃ 5min；95 ℃ 10 s，60℃ 30 s，共45个循环，于60℃进行FAM通道的荧光信号检测。实验设置阴性对照。
从图1中可以看出，引物除了副溶血性弧菌有扩增以外，其他几种菌均无扩增，说明本方法的引物非近缘物种和近缘物种特异性良好。
实施例2：平板计数、PMA-qPCR和PMA-ddPCR对不同比例死/活菌的检测取10-2稀释度的菌悬液95℃下热致死10min作为死菌悬液，与不同体积的10-2稀释度的活菌悬液进行混合，使活菌占总菌量的比例为0%、1%、5%、10%、20%、50%、70%、100%，具体加入比例见表2，对不同比例混合菌液进行平板涂布计数，然后向1mL混合菌液中加入8 μL的PMA工作液使其终浓度为16 μg/mL，避光孵育10min，然后使用HG-EMA核酸光标记仪分别曝光8min，对照组不经PMA处理，按实施例1中Chelex-100法提取DNA后进行qPCR反应和ddPCR反应，qPCR反应体系和条件同实施例1，ddPCR反应体系为：2×Supermix 10μL，正反向引物各1.5μL（10μmol/L），探针引物0.5μL（10μmol/L），DNA模板4μL，无菌超纯水补足至20μL。反应条件设置为：95 ℃10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共40个循环；98 ℃ 10 min；4 ℃。ddPCR反应结束后将96孔板放入QX200Droplet Reader，在软件QuantaSoft里依次录入样品信息后点击运行，仪器自动采集荧光信号，运行完毕后自动计算出最终结果。
由图2可知：
1）当活菌比例为0%即全为死菌时，PMA-ddPCR仍有少量菌检出，这说明PMA-ddPCR在菌液完全灭活情况下检测结果会出现“假阳性”。
2）在活菌比例为1%-5%时，PMA-ddPCR测得的拷贝数浓度根据标准方程换算得到的菌浓度与平板计数的结果之间存在一定差异，但差异不显著（P>0.05），说明PMA-ddPCR在1%-5%活菌比例下可大致检出活菌的浓度，但结果与平板计数结果存在差异；
3）在活菌比例为10-100%时，PMA-ddPCR测得的拷贝数浓度根据标准方程换算得到的菌浓度与平板计数结果基本一致，且均随活菌比例上升而上升，表明PMA-ddPCR测得的是活菌浓度，且方法的准确度较高；说明PMA-ddPCR在活菌比例大于1%时可对活菌进行检测，而在活菌比例大于10%时检测结果与平板计数结果在对数值上基本一致。
表2 死菌液中活菌的添加比例
菌液cfu/mL 0% 1% 5% 10% 20% 50% 70% 100%
活菌 0 2.00×103 1.00×104 2.00×104 4.00×104 1.00×105 1.40×105 2.00×105
死菌 2.00×105 1.98×105 1.90×105 1.80×105 1.60×105 1.00×105 6.00×104 0
实施例3：PMA-ddPCR对副溶血性弧菌检测的灵敏度实验
将副溶血性弧菌菌株接种至APW培养基制备菌悬液，使用细菌浊度计调整菌悬液浊度至0.8，将此时的菌悬液作为初始稀释液，对该菌液进行梯度稀释，并同时进行平板计数。取稀释后浓度为106~101cfu/ml菌悬液500μL按实施例2进行PMA处理，按实施例1中Chelex-100法提取DNA后进行ddPCR反应，反应体系和条件同实施例2。从图3可以看出，PMA-ddPCR对副溶血性弧菌检测灵敏度为2×101cfu/mL，测得的拷贝数浓度为1.55copies/μL。根据《国家食品安全标准 GB 29921食品中致病菌限量》的要求，本方法对副溶血性弧菌的检测限满足该标准对副溶血性弧菌最高安全限量值的检出要求。
实施例4：PMA-ddPCR检测人工污染样品中副溶血性弧菌活菌
称取经国标方法检测无副溶血性弧菌污染的基围虾和小帆立贝（样品来自当地海产品零售市场）25g，向其中分别加入稀释度100~10-6副溶血性弧菌（ATCC17802）活菌悬液2mL以制备人工污染样品，将人工污染样品加入至225mL APW后均质，取1mL均质液12000r/min下离心1min，弃上清液，向沉淀中加入500μL去离子水，振荡至沉淀悬浮且分散均匀，按实施例3的方法进行PMA处理，操作提取DNA后进行ddPCR反应，反应体系和条件同实施例3。由图4、图5可知，在103-102cfu/ml菌污染浓度下，PMA-ddPCR测定菌浓度与平板计数结果基本吻合，PMA-ddPCR测定人工污染基围虾中活菌的灵敏度为1.12×101cfu/g，测定人工污染小帆立贝的灵敏度为8.96 cfu/g。

Claims (1)

1.一种PMA与微滴式数字PCR结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）样品采集与处理：
PMA处理待测样品：取食品样品，加入APW后均质，取均质液12000r/min下离心，弃上清液，向沉淀中加入去离子水，振荡至沉淀悬浮且分散均匀，加入终浓度为16μg/mL的PMA后混匀，避光孵育，使用核酸光标记仪曝光；
（2）待测样品DNA提取：
采用Chelex-100法提取菌悬液DNA：取PMA处理后的菌悬液至灭菌离心管，12000r/min下离心，弃上清，于沉淀中加入10％Chelex-100溶液，剧烈振荡5~10s；56℃水浴 30min，取出振荡，95℃加热10 min，剧烈振荡5~10s；12000r/min下离心5min，取上清液作为DNA模板；
（3）采用ddPCR扩增引物及探针引物对副溶血性弧菌tlh基因进行检测：
a）ddPCR反应体系设置为20μL，其中包括:
2×Supermix 10μL，
正反向引物各1.5μL，10μmol/L，
探针引物0.5μL，10μmol/L，
DNA模板4μL，无菌超纯水补足至20μL；
b）反应条件设置为：
95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，共40个循环；98℃ 10 min；4℃；
c）ddPCR反应结束后将96孔板放入QX200Droplet Reader，在软件QuantaSoft里依次录入样品信息后点击运行，仪器自动采集荧光信号，运行完毕后自动计算出最终结果；
d）引物序列为：
tlh2-F：CACAATGGCGCTTCCCTAAC；
tlh2-R：GCGCGATGTATTGGTTCTCA；
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