CN107400727A - 一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法。本发明依据空肠弯曲菌的马尿酸酶 hipO基因设计的一对特异性PCR检测引物，并在此基础上建立针对空肠弯曲菌的 MPN‑PCR 快速定量检测方法，包括如下步骤S1. 禽肉前处理；S2. PCR反应；S3. PCR产物鉴定；S4. 计算样品中活菌含量：根据PCR鉴定结果，确定空肠弯曲菌阳性的试管数，按照MPN法稀释度选择原则，选择三个连续稀释度，查MPN检索表，报告每g或每mL样品中的值。本发明运用所述引物对应的MPN‑PCR方法，检测结果可信度高，可以用于市场上禽肉制品的空肠弯曲菌快速定量检测，为养禽业中食源性病原菌的防控和禽肉类加工销售过程的监管提供有效的工具。

Description

一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，更具体地，涉及一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法。
背景技术
空肠弯曲菌是鸡群中较为常见的人畜共患致病菌，且流行趋势呈逐年递增，不仅对我国的畜禽养殖业造成了严重的危害，而且在一定程度上还会导致家禽产品及食品的污染，对人类和动物的健康造成了巨大的威胁，危害公共卫生安全。
因此，调查了解该病原菌对日常生活中禽肉产品的污染程度，对控制食品中空肠弯曲菌的污染，以及减少人类食源性疾病的发生显得尤为重要。但目前为止，病原菌的定量检测以传统的平板活菌计数为主，操作繁琐、耗时费力，且存在由于病原菌进入可存活但不可培养(VBNC)状态所导致的漏检，而单纯采用MPN法(Most Probable Number，最大可能数法)则需要通过生化实验进行进一步鉴定，同样操作繁琐。
在分子生物学飞速发展的今天，荧光定量PCR也被用于微生物的定量检测，它具有快速简单、特异性强和敏感性高等特点。中国专利公开号105420404 A公开了一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重PCR引物及其鉴别方法，以空肠弯曲杆菌特有的hipO靶基因设计引物，取样本基因组DNA进行PCR扩增，当电泳检测在653bp和313bp位置有两条扩增条带表示样品为阳性，鉴别出样品中含有空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。但该方法只能对反应体系中模板DNA进行定量，不能鉴别污染食品中死活菌体，无法准确测出污染食品的活菌量。
发明内容
针对上述现有技术中的问题，本发明旨在将MPN法和PCR技术相结合，提供一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物，并建立针对空肠弯曲菌的MPN-PCR快速定量检测方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种用于空肠弯曲菌的活菌定量检测引物，依据空肠弯曲菌的马尿酸酶hipO基因设计的一对特异性PCR检测引物(如序列表SEQ ID NO.1～2所示)：
SEQ ID NO.1：HIP-F1 GAAGAGGGTTTGGGTGGTG；
SEQ ID NO.2：HIP-R1 AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG。
上述引物进行了特异性检测，具体方法为：
取大肠杆菌菌液、产气荚膜梭菌菌液、空肠弯曲菌菌液、沙门氏菌菌液提取细菌DNA做模板，用上述引物进行PCR扩增，对引物进行特异性检测。反应体系为25μL，包括：2×EsTaq MasterMix 10μL，模板2.5μL，上、下游引物各1μL，灭菌双蒸水10.5μL，混匀。PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，进行30个循环，72℃再延伸10min。同时以双蒸灭菌水为模板，设为阴性对照进行同条件扩增。实验结果确定上述引物具有检测空肠弯曲菌的特异性。
一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，包括如下步骤：
S1.禽肉前处理：将采集的肉样加培养液制成质量体积比为1:9的匀浆液，将所述匀浆液进行5个连续梯度的10倍稀释，在微需氧环境下进行增菌培养；
S2.PCR反应：将上述增菌培养的样品，离心弃上清，用双蒸灭菌水重悬沉淀，水浴煮沸5min后冰浴5min，离心，取上清作为PCR模板；取PCR模板5μL，序列表SEQ ID NO.1～2所述的上、下游引物各1μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，灭菌双蒸水8μL，混匀，进行PCR扩增；
S3.PCR产物鉴定：PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，观察，735bp处有条带即为阳性，拍照并分析试验结果；
S4.计算样品中活菌含量：根据PCR鉴定结果，确定空肠弯曲菌阳性的试管数，按照MPN法稀释度选择原则，选择三个连续稀释度，查MPN检索表，报告每g或每mL样品中的值。
优选地，步骤S1所述的增菌培养条件为在42℃培养48h。
优选地，步骤S2所述的2×Es Taq MasterMix包括：Es Taq DNA Polymerase，2×Es Taq PCR Buffer，3mM MgCl2，400μM dNTPmix。
优选地，步骤S2所述的PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，72℃再延伸10min。
优选地，步骤S2所述的离心条件均为12000rpm离心5min。
优选地，步骤S3所述的凝胶电泳条件为120V电压电泳30min。
优选地，所述的禽肉为鸡肉。
优选地，步骤S1所述培养液为添加有相应抗生素的布氏肉汤；所述匀浆液获得的条件为5000rpm速度进行匀浆。
优选地，步骤S2进行PCR扩增时，同时以提取的标准菌DNA和双蒸灭菌水为模板，分别设为阳性对照和阴性对照进行同条件PCR扩增。
优选地，步骤S3中为1％琼脂糖凝胶，取8μL PCR产物和5μL DL2000DNAMarker加样，进行琼脂糖凝胶电泳。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明设计的PCR检测引物具有较高的特异性，运用所述引物对应的MPN-PCR方法，检测结果可信度高，可以用于市场上禽肉制品的空肠弯曲菌快速定量检测，为养禽业中食源性病原菌的防控和禽肉类加工销售过程的监管提供有效的工具，还对食品公共卫生安全领域中食源性病原菌的检测等诸多领域提供一定的帮助。
附图说明
图1为本发明所述引物的特异性检测结果；M：DNA Marker 2000；1：大肠杆菌；2：产气荚膜梭菌；3：空肠弯曲菌；4：沙门氏菌；5：阴性对照。
图2为本发明空肠弯曲菌MPN-PCR法与平板计数法相关性结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。
实施例1PCR特异性引物的设计与合成
依据空肠弯曲菌特有的马尿酸酶hipO基因设计一对特异性PCR检测引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，如序列表SEQ ID NO.1～2所示。
SEQ ID NO.1：HIP-F1 GAAGAGGGTTTGGGTGGTG；
SEQ ID NO.2：HIP-R1 AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG。
将上述引物进行特异性检测：取大肠杆菌菌液、产气荚膜梭菌菌液、空肠弯曲杆菌菌液、沙门氏菌菌液提取细菌DNA做模板，用空肠弯曲杆菌hipO基因引物进行PCR扩增，对引物进行特异性检测。
反应体系为25μL，包括：2×EsTaq MasterMix 10μL，模板2.5μL，上、下游引物各1μL，灭菌双蒸水10.5μL，混匀。PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，进行30个循环，72℃再延伸10min。同时以双蒸灭菌水为模板，设为阴性对照进行同条件扩增。hipO引物特异性检测结果见图1。
实施例2空肠弯曲菌活菌定量检测方法的建立
一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，包括如下步骤：
S1.禽肉前处理：将采集的肉样加培养液制成质量体积比为1:9的匀浆液，将所述匀浆液进行5个连续梯度的10倍稀释，在微需氧环境下进行增菌培养；
S2.PCR反应：将上述增菌培养的样品，离心弃上清，用双蒸灭菌水重悬沉淀，水浴煮沸5min后冰浴5min，离心，取上清作为PCR模板；取PCR模板5μL，实施例1所述的上、下游引物各1μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，灭菌双蒸水8μL，混匀，进行PCR扩增；
S3.PCR产物鉴定：PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，观察，735bp处有条带即为阳性，拍照并分析试验结果；
S4.计算样品中活菌含量：根据PCR鉴定结果，确定空肠弯曲菌阳性的试管数，按照MPN法稀释度选择原则，选择三个连续稀释度，查MPN检索表，报告每g或每mL样品中的值。
实施例3鸡肉中空肠弯曲菌活菌定量检测
本实施例在实施例2的基础上，分次多点采集鸡肉作为禽肉实验样本，用保鲜袋包好采集的样品于冰盒中运送到实验室。
具体的实验步骤如下：
S1.禽肉前处理：在无菌超净台中，将采集的鸡肉肉样剪碎，并称取10g放入200mL的无菌烧杯中，加入90mL布氏肉汤，用匀浆器以5000rpm速度进行匀浆，获得匀浆液；
样品的增菌培养：取1mL所述匀浆液入9mL空肠弯曲杆菌的布氏肉汤(已经添加了相应的抗生素)增菌液中，振荡试管使其混匀，再从混匀的稀释液中取1mL加入9mL布氏肉汤增菌液中，依此方法共进行5个连续梯度的10倍系列稀释，每个梯度平行接种3管，42℃微需氧环境下增菌培养48h。
S2.PCR反应：取2mL上述增菌培养获得的样品，12000rpm离心5min，弃上清液，用50μL双蒸灭菌水重新悬浮沉淀，置于100℃水浴中煮沸5min，冰浴5min，12000rpm离心5min，取上清液作为PCR模板。PCR反应体系PCR扩增反应总体积为25μL，包括：2×Es Taq MasterMix10μL(包括：Es Taq DNA Polymerase，2×Es Taq PCR Buffer，3mM MgCl2，400μMdNTPmix)，模板5μL，实施例1上、下游引物各1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行30循环，72℃再延伸10min。同时以提取的标准菌DNA和双蒸灭菌水为模板，分别设为阳性对照和阴性对照进行同条件扩增。
S3.PCR产物鉴定：配制1％琼脂糖凝胶，待PCR扩增结束后，取8μL PCR产物和5μLDL2000DNAMarker加样，120V电压电泳30min，进行凝胶紫外成像系统观察，735bp处有条带即为阳性，拍照并分析试验结果。
S4.计算样品中活菌含量：根据PCR鉴定结果，确定空肠弯曲杆菌阳性的试管数，按照MPN法稀释度选择原则，选择三个连续稀释度，查MPN检索表，报告每g(mL)样品中的值。
对比例
按照与实施例1相同的设计原则，设计出另一对特异性PCR检测引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，如序列表SEQ ID NO.3～4所示。
SEQ ID NO.3：HIP-F2 ATGATGGCTTCTTCGGATAG；
SEQ ID NO.4：HIP-R2 GCTTCGCATAATAACTTGC。
将以上引物按照实施例1相同的方法进行特异性检测，仅在空肠弯曲杆菌菌液的DNA做模板时，上述引物在598bp处有条带。
将序列表SEQ ID NO.3～4所示的以上引物替代实施例1中的引物应用在相同方法条件下(实施例3)进行的空肠弯曲菌活菌定量检测。
应用例MPN-PCR法和平板计数法的一致性检测
将不同稀释梯度的空肠弯曲杆菌菌液进行MPN-PCR法检测和平板计数，每个稀释梯度作为一个独立样品进行两种方法的一致性检测。MPN-PCR法根据阳性管数和稀释梯度选择原则，查MPN检索表(附录)，计算MPN值；平板计数选择3个平板上生长的菌落均在30～300个之间的稀释梯度，进行计数求平均值，根据平板对应的稀释倍数和接种涂布的量换算出空肠弯曲杆菌不同稀释梯度的含菌量。取空肠弯曲杆菌6个样品分别用MPN-PCR法和平板计数法进行定量检测，其结果见下表。
附录
细菌的最可能数(MPN)检索表
相关性分析结果表明，SEQ ID NO.1～2引物对应的MPN-PCR方法与平板计数法相关性较好，而SEQ ID NO.3～4引物对应的MPN-PCR方法与平板计数法相关性较差。SEQ IDNO.1～2的MPN-PCR方法与平板计数法线性方程式为y＝0.9898x-0.1225，R2＝0.9905(如图2所示)，该MPN-PCR法检测结果和平板计数结果相关性良好，即本发明运用SEQ ID NO.1～2引物对应的MPN-PCR方法进行空肠弯曲杆菌定量检测的结果可信。而在相同设计原则下获得的其他引物运用至本发明MPN-PCR方法时，对于禽肉中空肠弯曲菌的活菌定量检测的效果不佳。
以上详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列HIP-F1
<400> 1
gaagagggtt tgggtggtg 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列HIP-R1
<400> 2
agctagcttc gcataataac ttg 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列HIP-F2
<400> 3
atgatggctt cttcggatag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列HIP-R2
<400> 4
gcttcgcata ataacttgc 19

Claims (8)

1.一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物，其特征在于，依据空肠弯曲菌的马尿酸酶hipO基因设计的一对特异性PCR检测引物：
HIP-F1 GAAGAGGGTTTGGGTGGTG；
HIP-R1 AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG。
2.一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 禽肉前处理：将采集的肉样加培养液制成质量体积比为1:9的匀浆液，将所述匀浆液进行5个连续梯度的10倍稀释，在微需氧环境下进行增菌培养；
S2. PCR反应：将上述增菌培养的样品，离心弃上清，用双蒸灭菌水重悬沉淀，水浴煮沸5min后冰浴5min，离心，取上清作为PCR模板；取PCR模板5 μL，权利要求1所述的上、下游引物各1 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL，灭菌双蒸水8 μL，混匀，进行PCR扩增；
S3. PCR产物鉴定：PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，观察，735bp处有条带即为阳性，拍照并分析试验结果；
S4. 计算样品中活菌含量：根据PCR鉴定结果，确定空肠弯曲菌阳性的试管数，按照MPN法稀释度选择原则，选择三个连续稀释度，查MPN检索表，报告每g或每mL样品中的值。
3.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S1所述的增菌培养条件为在42℃培养48h。
4.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S2所述的2×Es Taq MasterMix包括：Es Taq DNA Polymerase，2×Es Taq PCR Buffer，3 mMMgCl2，400 μM dNTPmix。
5.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S2所述的PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行30个循环，72℃再延伸10 min。
6.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S2所述的离心条件均为12000rpm离心5min。
7.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S3所述的凝胶电泳条件为120 V 电压电泳 30 min。
8.根据权利要求2~7任一项所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，所述的禽肉为鸡肉。
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WO2023203217A1 (en) * 2022-04-22 2023-10-26 Biosynth Ag Method of detecting a microorganism having hippuricase activity

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