CN102146469B - 副溶血性弧菌双重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明利用双重实时荧光PCR方法，以副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因作为靶基因，toxR基因用于特异性检测副溶血性弧菌，tdh基因用于检测是否携带毒力基因，优化设计引物、探针和反应条件，使得在一次扩增反应中对副溶血性弧菌进行特异性检测的同时检测其毒力基因，检测快速，8-10小时可以完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强，为副溶血性弧菌进行流行病学调查提供了有利工具。适用于食品以及海产品的检验检疫，可供检验检疫局、疾病预防控制中心和质量监督部门对样品进行简便、快速、准确的检测。
Description
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及重要的食源性病原菌副溶血性弧菌(VibrioParahemolyticus)的双重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，适合于进出口食品检验、疾病控制中心、质量监督部门使用。
背景技术：
副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌，是沿海国家的重要食物中毒致病菌之一，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。副溶血性弧菌主要存在于海水及海产品中，在日本由该菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的40％～60％，位居首位。另外，美国、澳大利亚、英国、比利时、法国、韩国和东南亚地区，都有该菌引起食物中毒爆发的报告。我国从1998年以来的资料显示，副溶血弧菌引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，均已超过沙门氏菌食物中毒，跃居细菌性中毒的首位。
副溶血性弧菌传统的检测方法是基于形态特征、染色特征、生化特征、血清分型等表型特征来鉴定。这些常规的方法在副溶血性弧菌研究工作中起到了重要作用，但现代科学技术的发展，传统的依靠表型特征来鉴定副溶血性弧菌的方法，已远远不能满足对该菌的快速诊断以及流行病学研究的需要，暴露出许多不足之处：操作繁琐，鉴定周期长，不利于急性中毒的快速诊断和口岸快速通关的要求；副溶血性弧菌的致病机理复杂且多样化，不含毒力因子的菌株不一定致病，而传统的培养鉴定法短时间内无法确定该菌的毒力强弱，还需继续增加其他特殊的生化等鉴定实验，这无疑使鉴定周期更加漫长。因此，迫切急需研究出能够更加快速、准确无误、检测通量更高、人为影响因素尽可能减少，而且能获得分离的病原体基因型别、毒力基因分布等多重信息的检测方法。
用于副溶血性弧菌分子检测比较常见的主要有常规PCR、单一实时荧光PCR以及基因芯片等。虽然，常规PCR具有高灵敏度、操作简单等优点，但是需要对产物进行后处理，容易污染，同时，染色剂、紫外光等对操作人员身体健康有威胁，不易自动化和标准化；基因芯片技术具有高特异性、高通量等优点，但是需要先扩增再杂交，技术还不是很稳定，尤其是仪器设备昂贵，不利于推广应用。实时荧光PCR技术充分结合了PCR扩增和探针杂交的优势，具有高灵敏度、高特异性，重复性和稳定性良好的优点，一次上机即可完成结果检测，容易自动化。
实时荧光PCR技术根据荧光能量传递原理，融合了PCR技术的高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确性等优点。它是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，在99.7％的置信度时计算出大于平均值的荧光信号即阈值，然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始模板拷贝数。
实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
目前副溶血性弧菌的荧光PCR检测上，文献报道以gyrase为目的基因就无法区分副溶血性弧菌和溶藻弧菌，tlh和tdh为靶基因容易出现假阳性结果。副溶血性弧菌在我妻氏琼脂上引起β-溶血，称为神奈川现(KP现象)。KP现象是鉴定副溶血性弧菌致病性和非致病性菌株的一项重要指标，其主要是热稳定性溶血素tdh基因引起，tdh基因是副溶血性弧菌的主要毒力因子，具有致死毒性、心脏毒性、细胞毒性和肠毒素作用。最近的研究还表明，tdh基因家族也广泛存在于人类致病性弧菌中，如部分霍利斯弧菌(V.hollisae)，某些拟态弧菌菌株中也有tdh基因，非O1群霍乱弧菌中也存在同源性约为93％～96％的tdh相关基因。因此，以单独以tdh基因为目标基因就无法准确鉴定出副溶血性弧菌。
在单一荧光PCR基础上的多重实时荧光PCR方法，可针对多个基团为目的基因进行检测。多重实时荧光PCR法用于病原菌的检测，无论在国内还是在国外都刚刚起步，目前尚无副溶血性弧菌的多重实时荧光PCR的检测试剂盒问世。
发明内容：
本发明的目的是提供一种快速、可靠、灵敏度高、特异性强的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，通过一次反应就能完成副溶血性弧菌的特异性检测和毒力基因检测。
本发明利用双重实时荧光PCR方法，以副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因作为靶基因，toxR基因用于特异性检测副溶血性弧菌，tdh基因用于检测是否携带毒力基因，优化设计引物、探针和反应条件，使得在一次扩增反应中对副溶血性弧菌进行特异性检测的同时检测其毒力基因，达到简便、快速、准确可靠和安全的目的，从而实现了本发明的目的。
本发明的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
针对toxR基因：5`-AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3`；(如SEQ ID NO.1所示)
5`-CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3`；(如SEQ ID NO.2所示)
针对tdh基因：5`-GGCTGACATCCTACATGACTG-3`；(如SEQ ID NO.3所示)
5`-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3`；(如SEQ ID NO.4所示)
本发明的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
toxR基因的探针：5`-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3`；(如SEQ ID NO.5所示)
tdh基因的探针：5`-CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3`；(如SEQ ID NO.6所示)
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，两探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
所述的荧光报告基团优选为FAM、HEX或VIC，所述的荧光淬灭基团优选为BHQ1。
本发明的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，
所述的检测引物包括两对：
(1)针对toxR基因：5`-AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3`；(如SEQ ID NO.1所示)
5`-CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3`；(如SEQ ID NO.2所示)
(2)针对tdh基因：5`-GGCTGACATCCTACATGACTG-3`；(如SEQ ID NO.3所示)
5`-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3`；(如SEQ ID NO.4所示)
所述的检测探针包括：
(1)toxR基因的探针：5`-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3`；(如SEQ ID NO.5所示)
(2)tdh基因的探针：5`-CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3`；(如SEQ ID NO.6所示)
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，两探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
本发明的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测方法，用于检测食品或海产品，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
(2)使用上述针对toxR基因和tdh基因的检测引物及其检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数(Ct)；
(4)根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有副溶血性弧菌，以及该副溶血性弧菌是否含有毒力基因tdh基因。
所述的步骤(2)的扩增反应体系优选为：
| 模板DNA | 2μL |
| 10×TaqMan缓冲液 | 5μL |
| 5mmol/L MgCl2 | 4μL |
| 2.5mmol/L dNTPs | 2μL |
| 20μmol/L TaqMan探针 | 两种探针各1μL(共2μL) |
| 20μmol/L检测引物 | 四条引物各1μL(共4μL) |
| 0.55U UNG酶 | 0.2μL |
| 2.5U/μL Taq聚合酶 | 3μL |
| 去离子水 | 7.8μL |
所述步骤(3)的进行实时荧光PCR反应，其反应参数优选为：95℃30s、93℃5s、60℃30s、40个循环。结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应曲线，且Ct值小于38，则判断为阳性，如果38＜Ct＜40，判断为可疑，可以加大模板量，重复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或40，则判断为阴性。
本发明以toxR基因作为特异性检测的靶基因，以tdh基因作为是否致病性的检测基因，以两个基因的保守序列设计引物及其探针，采用blast分析扩增产物的序列特异性，以保证无同源或序列一致性生物基因信息，并充分考虑能否在同一体系中扩增两个靶基因的特异性序列，而进行精心优化和反复测试而获得本发明的检测引物和检测探针，利用该检测引物和检测探针按照本发明的方法对样品进行双重实时荧光PCR检测，在一次扩增反应中完成对待测样品的副溶血性弧菌的特异性检测和毒力基因检测，从而简便、快速、准确的对待检样品中是否含有副溶血性弧菌以及该副溶血性弧菌是否含有毒力基因进行判断。以本发明的检测引物及探针按照本发明的方法对样品进行双重实时荧光PCR检测，检测快速，8-10小时可以完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强，为副溶血性弧菌进行流行病学调查提供了有利工具。因此本发明适用于食品以及海产品的检验检疫，尤其是对进出口食品及海产品，可供检验检疫局、疾病预防控制中心和质量监督部门对样品进行简便、快速、准确的检测。
附图说明：
图1是实施例1的样品实时荧光PCR检测结果；
图2是特异性实验1中的样品实时荧光PCR检测结果；
图3是特异性实验2中的样品实时荧光PCR检测结果；
图4是敏感性实验中的样品实时荧光PCR检测结果；
图5是副溶血性弧菌分离株21株和阳性副溶血性弧菌ATCC33847进行模拟样品的实时荧光PCR检测结果。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
一、引物和探针的设计和合成。
本发明首先对副溶血性弧菌及其近似种或相关种进行序列比较分析，找出副溶血性弧菌不同于其他相关菌种的特异碱基序列toxR基因，根据toxR基因和tdh基因的碱基序列，设计引物对和探针，并分析扩增产物的序列特异性并结合考虑两对引物以及探针之间的特异性，反复的比对筛选所设计引物对和探针的特异性，得到的两对引物的扩增产物是特异的，从而保证扩增产物的特异性。
所设计的检测引物：
针对toxR基因的引物：5`-AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3`；
5-CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3`；
toxR基因的探针：5`-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3`，荧光报告基团FAM标记在5`端，而淬灭集团BHQ1标记在3`端。
针对tdh基因的引物：5`-GGCTGACATCCTACATGACTG-3`；
5`-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3`；
tdh基因的探针：5`-CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3`，荧光报告基团HEX标记在5`端，而淬灭基团BHQ1标记在3`端。
实施例1：
取1mL 37℃过夜培养的副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)ATCC33847(tdh基因阳性)悬液，12000r/min离心5min，去上清，用1mL去离子水漂浮沉淀，12000r/min离心3min，去上清，重复两次，最后加200μL去离子水，在核酸提取仪上提取基因组DNA，将其作为模板DNA用于实时荧光PCR扩增。
实时荧光PCR扩增体系，反应体系30μL，包括：模板DNA 2μL、10×TaqMan缓冲液5μL、5mmol/L MgCl2 4μL、2.5mmol/L dNTPs 2μL、TaqMan探针20μmol/L各1μL(包括toxR基因的探针和tdh基因的探针，共2μL)、引物20μmol/L各1μL(包括针对toxR基因和针对tdh基因的4条引物，共4μL)、UNG酶0.55U 0.2μL、Taq聚合酶2.5U/μL 3μL、去离子水7.8μL。荧光PCR反应参数为95℃30s、93℃5s、60℃30s、40个循环。其检测结果如图1所示，从图1中可以看出，经本实施例的实时荧光PCR扩增，同时出现了toxR与tdh扩增曲线，表明测试菌株为带tdh毒力基因的副溶血性弧菌，这与副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)ATCC33847的本身性质是相符的。由此表明本发明的测试方法是可行的。
二、特异性实验
1、特异性实验1：
以阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC29544、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922、沙门氏菌(Salmonella typhi)CMCC50071、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)CMCC51582、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)CMCC51334、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)NICPBP51252、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)NICPBP51571、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)CMCC52221、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)CMCC53510、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae suhsp Pneumoniae)CMCC46102作为待检样品，上述菌株均购自中国药品食品检定所。以副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)ATCC33847(VP标准)作为阳性对照。
分别提取上述各待测菌株和阳性对照的基因组DNA，调整DNA浓度为10～20ng/μL，按照以下反应体系分别进行实时荧光PCR扩增反应。
实时荧光PCR扩增体系，反应体系30μL，包括：模板DNA 2μL、10×TaqMan缓冲液5μL、5mmol/L MgCl2 4μL、2.5mmol/L dNTPs 2μL、TaqMan探针20μmol/L各1μL(包括toxR基因的探针和tdh基因的探针，共2μL)、引物20μmol/L各1μL(包括针对toxR基因和针对tdh基因的4条引物，共4μL)、UNG酶0.55U 0.2μL、Taq聚合酶2.5U/μL 3μL、去离子水7.8μL。荧光PCR反应参数为95℃30s、93℃5s、60℃30s、40个循环。
结果如图2所示，实时荧光PCR结果显示，阳性对照副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)ATCC33847(图中的VP标准)的toxR和tdh基因的S型扩增曲线指数期明显，而阪崎肠杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、肺炎克雷伯氏菌无特异性S扩增曲线产生。
2、特异性实验2：
副溶血性弧菌ATCC17028(tdh基因阴性，购自中国普通微生物菌种保藏中心)，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、霍利斯弧菌(V.hollisae)、最小弧菌(V.mimicus)、霍乱弧菌(V.cholera)、塔式弧菌(Vibrio tubiashii)，由中国南海水产研究所赠送。以上述细菌作为待测样品，以副溶血性弧菌ATCC33847作为阳性对照。
分别提取上述各待测菌株和阳性对照的基因组DNA，调整DNA浓度为10～20ng/μL，按照以下反应体系分别进行实时荧光PCR扩增反应。
实时荧光PCR扩增体系，反应体系30μL，包括：模板DNA 2μL、10×TaqMan缓冲液5μL、5mmol/L MgCl2 4μL、2.5mmol/L dNTPs 2μL、TaqMan探针20μmol/L各1μL(包括toxR基因的探针和tdh基因的探针，共2μL)、引物20μmol/L各1μL(包括针对toxR基因和针对tdh基因的4条引物，共4μL)、UNG酶0.55U 0.2μL、Taq聚合酶2.5U/μL 3μL、去离子水7.8μL。荧光PCR反应参数为95℃30s、93℃5s、60℃30s、40个循环。
实验结果如图3所示，实时荧光PCR结果显示，阳性对照副溶血性弧菌ATCC33847(图中的VP标准)的toxR和tdh基因的S型扩增曲线指数期明显，副溶血性弧菌ATCC17028(图中的ATCC17028)只出现toxR基因扩增曲线，而无tdh基因扩增曲线，表面该菌株无tdh基因，与该菌株的实际情况相符，溶藻弧菌、创伤弧菌、霍利斯弧菌、最小弧菌、霍乱弧菌、塔式弧菌都无特异性S扩增曲线产生。
综合特异性实验1和特异性实验2的结果，说明本研究建立的方法检测是否含有副溶血性弧菌以及该菌是否含有tdh基因，具有高度的特异性，适合用于副溶血性弧菌及其致病性的检测。
三、敏感性检测：
取1mL经平板菌落计数原始浓度为3.6×107cfu/ml的副溶血性弧菌ATCC33847纯培养液，10倍梯度稀释。然后分别取1ml各浓度的菌悬液，12000r/min离心5min，去上清，用1mL去离子水漂浮沉淀，12000r/min离心3min，去上清，重复两次，最后加200μL去离子水，在核酸提取仪上提取DNA，将其作为模板DNA用于实时荧光PCR扩增。实时荧光PCR扩增体系，反应体系30μL，模板DNA 2μL、10×TaqMan缓冲液5μL、5mmol/L MgCl2 4μL、2.5mmol/L dNTPs 2μL、TaqMan探针20μmol/L各1μL(包括toxR基因的探针和tdh基因的探针，共2μL)、引物20μmol/L各1μL(包括针对toxR基因和针对tdh基因的4条引物，共4μL)、UNG酶0.55U 0.2μL、Taq聚合酶2.5U/μL3μL、去离子水7.8μL。荧光PCR反应参数为95℃30s、93℃5s、60℃30s、40个循环。
表1：副溶血性弧菌不同浓度与Ct值
结果如图4和表1所示，由图4和表1可以观察到，副溶血性弧菌的浓度与Ct值有很好的线性关系，浓度越高Ct值越低，图4中从左到右副溶血性弧菌的浓度依次为3.6×107cfu/ml(图4中1所代表)、3.6×106cfu/ml(图4中2所代表)、3.6×105cfu/ml(图4中3所代表)、3.6×104cfu/ml(图4中4所代表)、3.6×103cfu/ml(图4中5所代表)、3.6×102cfu/ml(图4中6所代表)、3.6×101cfu/ml(图4中7所代表)。由图4和表1可以看出，本发明所建立的实时荧光PCR检测方法对样品进行副溶血性弧菌特异性检测和毒力基因检测的敏感性为36CFU。另外相同浓度的副溶血性弧菌，tdh的Ct值始终滞后于toxR的Ct值，这可能是两种基因的拷贝数不同。
四、传统检测方法与本研究建立的双重实时荧光PCR检测方法的比较：
从进出口食品中分离的副溶血性弧菌(VP)分离株共21株(菌株均用API 20E，VITEK细菌自动鉴定仪和国家标准鉴定为副溶血性弧菌)，如表2所示，分别取1ml上述21株副溶血性弧菌(VP)的菌悬液加入含有25g鱼肉的225ml的碱性蛋白胨水中，37℃培养4～6h，再取1mL培养液，12000r/min离心5min，去上清，用1mL去离子水漂浮沉淀，12000r/min离心3min，去上清，重复两次，最后加200μL去离子水，在核酸提取仪上提取DNA，将其作为模板DNA用于实时荧光PCR扩增。
实时荧光PCR扩增体系，反应体系30μL，模板DNA 2μL、10×TaqMan缓冲液5μL、5mmol/L MgCl2 4μL、2.5mmol/L dNTPs 2μL、TaqMan探针20μmol/L各1μL(包括toxR基因的探针和tdh基因的探针，共2μL)、引物20μmol/L各1μL(包括针对toxR基因和针对tdh基因的4条引物，共4μL)、UNG酶0.55U 0.2μL、Taq聚合酶2.5U/μL 3μL、去离子水7.8μL。荧光PCR反应参数为95℃30s、93℃5s、60℃30s、40个循环。
以副溶血性弧菌ATCC33847作为阳性对照。
结果如图5所示，副溶血性弧菌ATCC33847(图中的VP标准)出现toxR与tdh基因扩增曲线，21株分离株均出现toxR扩增曲线，结果与传统方法检测结果一致，但未出现tdh基因，表明分离的副溶血性弧菌为无毒力基因tdh。ISO/TS21872-1-2007《食品和动物饲料的微生物学.潜在肠道致病性弧菌属的水平检测法》中规定，分离的副溶血性弧菌需进行毒力试验-tdh基因检测，但副溶血性弧菌的毒力tdh基因携带率为1％。本实验的结果显示，近几年进出口食品中分离的副溶血性弧菌tdh基因携带率低于国际统计结果。
表2：21株副溶血性弧菌菌株信息
Claims (7)
1.一种副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)双重实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
针对toxR基因：5`-AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3`；
5`-CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3`；
针对tdh基因：5`-GGCTGACATCCTACATGACTG-3`；
5`-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3`。
2.一种副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：toxR基因的探针：5`-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3`；
tdh基因的探针：5`-CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3`；
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，两探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM、HEX或VIC，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。
4.一种副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，
所述的检测引物包括两对：
(1)针对toxR基因：5`-AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3`；
5`-CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3`；
(2)针对tdh基因：5`-GGCTGACATCCTACATGACTG-3`；
5`-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3`；
所述的检测探针包括：
(1)toxR基因的探针：5`-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3`；
(2)tdh基因的探针：5`-CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3`；
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，两探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
5.一种副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测方法，用于检测食品或海产品，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
(2)使用权利要求1所述的针对toxR基因和tdh基因的检测引物和权利要求2所述的toxR基因和tdh基因的检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数(Ct)；
(4)根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有副溶血性弧菌，以及该副溶血性弧菌是否含有毒力基因tdh基因。
6.根据权利要求5所述的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：模板DNA、2μL；10×TaqMan缓冲液、5μL；5mmol/L MgCl2、4μL；2.5mmol/L dNTPs、2μL；20μmol/L TaqMan探针、两种探针各1μL，共2μL；20μmol/L检测引物、四条引物各1μL，共4μL；0.55U UNG酶、0.2μL；2.5U/μL Taq聚合酶、3μL；去离子水、7.8μL。
7.根据权利要求5或6所述的副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的进行实时荧光PCR反应，其反应参数为：95℃30s、93℃5s、60℃30s、40个循环。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: YUAN MUYUN Effective date: 20120705 Owner name: XU LONGYAN Free format text: FORMER OWNER: INSPECTION AND QUARANTINE TECHNIC CENTER, GUANGDONG ENTRY-EXIT INSPECTION AND QU Effective date: 20120705 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Xu Longyan Inventor after: Yuan Muyun Inventor before: Xu Longyan Inventor before: Yuan Muyun Inventor before: Yi Minying Inventor before: Ling Li Inventor before: Yang Jing Inventor before: Zhang Wang Inventor before: Zou Zhifei Inventor before: Xiang Dapeng |
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Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: XU LONGYAN YUAN MUYUN YI MINYING LING LI YANG JING ZHANG WANG ZOU ZHIFEI XIANG DAPENG TO: XU LONGYAN YUAN MUYUN |
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Effective date of registration: 20120705 Address after: 510623 B1405 room, No. 66 Huacheng Avenue, Zhujiang New Town, Guangzhou, Guangdong Applicant after: Xu Longyan Co-applicant after: Yuan Muyun Address before: 510623 B1405 room, No. 66 Huacheng Avenue, Zhujiang New Town, Guangzhou, Guangdong Applicant before: Guangdong Inspection & Quarantine Technology Center of Guangdong Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau |
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