CN105154530B - 一种检测食品中致病菌的八重pcr扩增试剂盒及其扩增引物 - Google Patents

一种检测食品中致病菌的八重pcr扩增试剂盒及其扩增引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测食品中致病菌的八重PCR扩增试剂盒及其扩增引物，本发明PCR扩增反应液包括如下组分：引物0.4μmol/L‑0.7μmol/L，50‑100mmol/L的pH8.0‑8.5Tris‑HCl，50‑100mmol/L氯化钾，25‑50mmol/L氯化镁，2‑10mmol/L二硫苏糖醇，10％‑15％DMSO，2.5‑5.0mmol/L dNTP，0.1‑0.2μg/μLBSA，1％TritonX‑100，30‑60mmol/L硫酸铵，5U/μL Taq酶。本发明可同时检测7种致病菌，灵敏度高，特异性强，既提高检测速度降又降低了检验成本。

Description

一种检测食品中致病菌的八重PCR扩增试剂盒及其扩增引物
技术领域
本发明涉及食品致病菌检测技术领域，特别涉及一种检测食品中致病菌的八重PCR扩增试剂盒及其扩增引物。
背景技术
食品安全是当今社会最为关注的问题之一，食源性疾病及食物中毒是由病原菌污染食物所引起，引起食源性疾病的常见的病原菌有：沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157、大肠杆菌H7、霍乱弧菌和创伤弧菌等。目前同时对食品或食源性疾病多种病原菌进行分子诊断时常常采用多重PCR方法，因为该方法可同时检测3～4种病原菌，既提高检测速度降又降低了检验成本，由此得到广泛应用。但传统的多重PCR体系中，由于存在多对引物，引物之间的干扰以及引物与模板的错配而造成灵敏度下降与非特异性扩增反应增加等问题，制约多重PCR技术的发展。
DPO引物是近年来国际上新研究的一种PCR引物技术，该引物包含两个各自独立的特异性引物区域，序列5′端区域长度由18～25个碱基组成可与目的模板DNA形成稳定的特异性退火结构，序列3′端区域长度一般含有6～12个碱基并引导PCR反应的特异性延伸，两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤碱基进行桥接，由于次黄嘌呤碱基比一般的自然碱基退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形成两个独立功能的双特异性引物结构，由于DPO引物中寡聚次黄嘌呤碱基(poiy I)的氢键结合力弱，在DPO引物引导PCR扩增时,若其5′端或3′端存在3个以上碱基错配，DPO引物就会与DNA模板脱离并终止反应。基于DPO引物的上述结构特点，与其他PCR引物相比，其具有以下三个特点：第一是可有效地阻断非特异性扩增，增强了检测特异性；第二是DPO引物自身以及引物间难形成二级结构，从而提高了扩增效率；第三是DPO引物的有效退火温度范围较宽，在49～69℃退火温度内，所设计的DPO引物均可获得靶基因的高效扩增，无需对引物退火温度进行优化。第四是较易建立5重以上的多重PCR方法，在现场样本检测中达到真正的一管多检或一管全检的目的，这是其他PCR引物难以达到的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测食品中致病菌的八重PCR扩增试剂盒，可同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和创伤弧菌等7种致病菌，灵敏度高，特异性强，既提高检测速度降又降低了检验成本。
本发明还提供了检测上述7种致病菌的DPO引物。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测食品中致病菌的八重PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括如下组分：霍乱弧菌DPO正、反向引物各0.4μmol/L，副溶血性弧菌DPO正、反向引物各0.4μmol/L，单增李斯特菌DPO正、反向引物各0.4μmol/L，金黄色葡萄球菌DPO正、反向引物各0.5μmol/L，沙门氏菌DPO正、反向引物各0.6μmol/L，创伤弧菌DPO正、反向引物各0.7μmol/L，大肠杆菌O157-DPO正、反向引物各0.7μmol/L，大肠杆菌H7-DPO正、反向引物各0.4μmol/L，50-100mmol/L的pH8.0-8.5Tris-HCl，50-100mmol/L氯化钾，25-50mmol/L氯化镁，2-10mmol/L二硫苏糖醇，10％-15％DMSO，2.5-5.0mmol/L dNTP，0.1-0.2μg/μL BSA，1％TritonX-100，30-60mmol/L硫酸铵，5U/μL Taq酶。
本发明针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和创伤弧菌的特异性靶基因中的保守序列设计DPO引物，针对大肠杆菌O157：H7设计了两对引物。引物特异性强，本发明特定设计的8对引物，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。
作为优选，霍乱弧菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.1所示，霍乱弧菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.2所示。
作为优选，副溶血性弧菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.3所示，副溶血性弧菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.4所示。
作为优选，单增李斯特菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.5所示，单增李斯特菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.6所示。
作为优选，金黄色葡萄球菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.7所示，金黄色葡萄球菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.8所示。作为优选，沙门氏菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.9所示，沙门氏菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQID No.10所示。
作为优选，创伤弧菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.11所示，创伤弧菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.12所示。
作为优选，大肠杆菌O157-DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.13所示，大肠杆菌O157-DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.14所示。作为优选，大肠杆菌H7-DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.15所示，大肠杆菌H7-DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.16所示。
一种检测食品中致病菌的八重PCR扩增用DPO引物，包括：
霍乱弧菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.1所示；
霍乱弧菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.2所示；
副溶血性弧菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.3所示；
副溶血性弧菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.4所示；
单增李斯特菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.5所示；
单增李斯特菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.6所示；
金黄色葡萄球菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.7所示；
金黄色葡萄球菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.8所示；
沙门氏菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.9所示；
沙门氏菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.10所示；
创伤弧菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.11所示；
创伤弧菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.12所示；
大肠杆菌O157-DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.13所示；
大肠杆菌O157-DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.14所示。
大肠杆菌H7-DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.15所示；
大肠杆菌H7-DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.16所示；
本发明的有益效果是：可同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和创伤弧菌等7种致病菌，灵敏度高，特异性强，既提高检测速度降又降低了检验成本。
附图说明
图1是本发明检测7种致病菌电泳结果图；
图中泳道分别为：M:DL1000，1霍乱弧菌，2单增李斯特菌，3副溶血性弧菌，4金黄色葡萄球菌，5沙门氏菌，6创伤弧菌，7大肠杆菌O157：H7。
图2是检测DPO引物PCR灵敏度的电泳结果图；
图中泳道分别为：M:Mark；1与2:霍乱弧菌(2200CFU/mL与220CFU/mL)；3与4:大肠杆菌O157(2600CFU/mL与260CFU/mL)；5与6：单增李斯特菌(1900CFU/mL与190CFU/mL)；7与8：副溶血弧菌(1900CFU/mL与190CFU/mL)；9与10：大肠杆菌H7(2600CFU/mL与260CFU/mL)；11与12：金黄色葡萄球菌(7000CFU/mL与700CFU/mL)；
13与14：沙门氏菌(9600CFU/mL与960CFU/mL)；15与16：创伤弧菌(1500CFU/mL与150CFU/mL)。
图3是本发明检测检测其它细菌的电泳结果图；
图中泳道分别为：M:Mark；1拟态弧菌，2溶藻弧菌，3哈维弧菌，4美人鱼弧菌，5河弧菌，6麦氏弧菌，7嗜水气单胞菌，8福氏志贺菌，9铜绿假单胞菌，10大肠艾希氏菌，11肠球菌，12链球菌，13变形杆菌，14鲍曼不动杆菌，15表皮葡萄球菌，+大肠杆菌O157：H7。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
霍乱弧菌(VC008(H4_3))、副溶血性弧菌(ATCC17802)、沙门氏菌((CMCC(B)50115))、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、单增李斯特菌(ATCC19115)、创伤弧菌(VV001)、大肠杆菌O157：H7(DEL933)。志贺氏菌(ATCC12022)、肠球菌(ATCC29212)、大肠杆菌(ATCC25922)、河弧菌(V.flu001)、哈维氏弧菌(VH001)、美人鱼弧菌(V.dam001)、拟态弧菌(VM001)、溶藻弧、麦氏弧菌、福氏志贺菌、铜绿色假单胞菌、表皮葡萄球菌、嗜水气单胞菌、鲍曼不动杆菌、变形杆菌、无乳链球菌等。上述菌株由浙江大学提供。
实施例：
一种检测食品中致病菌的八重PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括如下组分：霍乱弧菌DPO正、反向引物各0.4μmol/L，副溶血性弧菌DPO正、反向引物各0.4μmol/L，单增李斯特菌DPO正、反向引物各0.4μmol/L，金黄色葡萄球菌DPO正、反向引物各0.5μmol/L，沙门氏菌DPO正、反向引物各0.6μmol/L，创伤弧菌DPO正、反向引物各0.7μmol/L，大肠杆菌O157-DPO正、反向引物各0.7μmol/L，大肠杆菌H7-DPO正、反向引物各0.4μmol/L，50-100mmol/L的pH8.0-8.5Tris-HCl，50-100mmol/L氯化钾，25-50mmol/L氯化镁，2-10mmol/L二硫苏糖醇，10％-15％DMSO，2.5-5.0mmol/L dNTP，0.1-0.2μg/μL BSA，1％TritonX-100，30-60mmol/L硫酸铵，5U/μL Taq酶。霍乱弧菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.1所示；
霍乱弧菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.2所示；
副溶血性弧菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.3所示；
副溶血性弧菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.4所示；
单增李斯特菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.5所示；
单增李斯特菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.6所示；
金黄色葡萄球菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.7所示；
金黄色葡萄球菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.8所示；
沙门氏菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.9所示；
沙门氏菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.10所示；
创伤弧菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.11所示；
创伤弧菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.12所示；
大肠杆菌O157-DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.13所示；
大肠杆菌O157-DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.14所示。
大肠杆菌H7-DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.15所示；
大肠杆菌H7-DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.16所示。
试验过程：
1、主要仪器：1000bp DNA Marker(大连宝生物工程有限工司)，琼脂糖(大连宝生物工程有限工司)，PCR扩增仪(伯乐公司My Cycler)，凝胶成像仪(伯乐)，电泳仪及配套电泳槽(Tanon EPS-100)，高速离心机(Thermo LEGEND Micro 21R)。
2、DPO引物设计
从NCBI的基因库中上下载霍乱弧菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、创伤弧菌和大肠杆菌O157：H7的靶基因序列，作同源性比对后在各病原菌靶基因的保守区设计特异性DPO引物。引物合成委托大连宝生物生物科技有限公司完成，DPO引物序列见表1。
表1八重PCR的DPO引物序列
上述引物序列中：I为次黄嘌呤碱基，Y、R、W是兼并碱基符号：Y＝C/T，R＝A/G，W＝A/T。
3、病原菌定量菌液的制备
将上述病原菌的标准菌株培养至对数期，通过LB琼脂平板计数测得每mL菌落数，将菌样分别用生理盐水进行10倍连续稀释至10-8CFU/mL。4、病原菌基因组DNA提取：
取3步定量细菌悬液1mL放入1.5mL eppendof管，15000rpm高速离心5min，倒去上清加入DNA提取剂100μL混匀后，置沸水中2min,15000rpm高速离心2min，上清即DNA溶液(PCR模板)。
5、DPO引物八重PCR反应体系优化与建立：
优化后8对引物终浓度分别为：
50μL反应体系为：
引物：霍乱弧菌DPO正向引物0.4μmol/L，霍乱弧菌DPO反向引物0.4μmol/L，副溶血性弧菌DPO正向引物0.4μmol/L，副溶血性弧菌DPO反向引物0.4μmol/L，单增李斯特菌DPO正向引物0.4μmol/L，单增李斯特菌DPO反向引物0.4μmol/L，金黄色葡萄球菌DPO正向引物0.5μmol/L，金黄色葡萄球菌DPO反向引物0.5μmol/L，沙门氏菌DPO正向引物0.6μmol/L，沙门氏菌DPO反向引物0.6μmol/L，创伤弧菌DPO正向引物0.7μmol/L，创伤弧菌DPO反向引物0.7μmol/L，大肠杆菌O157-DPO正向引物0.7μmol/L，大肠杆菌O157-DPO反向引物0.7μmol/L，大肠杆菌H7-DPO正向引物0.4μmol/L，大肠杆菌H7-DPO反向引物0.4μmol/L；DNA模板(步骤4获得)5μL，80mmol/L的pH8.3Tris-HCl，80mmol/L氯化钾，25-50mmol/L氯化镁，5mmol/L二硫苏糖醇，10％(体积)DMSO，各3.0mmol/L dNTP，0.1μg/μL BSA，1％(体积)TritonX-100，50mmol/L硫酸铵，5U/μL Taq酶；补水至50μL。
离心后在BioRad-PTC200型PCR仪上进行扩增；条件为：94℃1min,94℃30sec；57℃30sec；72℃1min；35个循环，72℃10min；4℃；1个循环。反应完毕，2％琼脂糖凝胶电泳观察结果，特异性条带判断参照标准分子量(DL1000)。
本发明可同时对霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌进行检测，实现一管8检。八重PCR所扩增的特异性条带与预期扩增长度一致(霍乱弧菌994bp、单增李斯特菌724bp、副溶血性弧菌606bp、金黄色葡萄球菌432bp、沙门氏菌325bp、创伤弧菌246bp，大肠杆菌O157为863bp、H7为548bp，见图1。
6、DPO引物PCR的灵敏度
取上述7种病原菌的定量菌液1mL提取基因组DNA为PCR模板进行PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳观察有比较明显的特异性扩增条带为阳性，以最低浓度的细菌悬液扩增阳性为DPO-PCR检测灵敏度。
建立的八重PCR方法检测7种病原菌8个靶基因的测定低限分别为：霍乱弧菌(220CFU/mL)；肠出血性大肠杆菌O157(260CFU/mL)；单增李斯特菌(190CFU/mL)；副溶血性弧菌(190CFU/mL)；肠出血性大肠杆菌H7(260CFU/mL)；金黄色葡萄球菌(700CFU/mL)；沙门氏菌(960CFU/mL)；创伤弧菌(150CFU/mL)，见图2。8对DPO引物在一个PCR反应体系中检测一种病原菌时DPO引物之间干扰较小具有良好的扩增效率，仍能保证灵敏度。与普通单重PCR相比两种PCR的检测灵敏度基本一致。
7、DPO引物PCR的特异度
7.1八重PCR内部的特异度
用DPO引物八重PCR反应体系逐一扩增8种靶基因的DNA，观察是否有非特异性扩增条带产生来验证八重PCR内部的特异度。
7.2八重PCR检测其他细菌的特异度
用DPO引物八重PCR反应体系分别对麦氏弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌、美人鱼弧菌、拟态弧菌、溶藻弧、嗜水气单胞菌、福氏志贺菌、铜绿色假单胞菌、大肠艾希氏菌、肠球菌、无乳链球菌、变形杆菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌的基因组DNA作八重PCR反应，观察是否有非特异扩增条带。
建立的八重PCR方法能有效扩增霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌与肠出血性大肠杆菌O157和H7八条特异性扩增条带，上述条带测序后经BLAST比对均处于设计是的靶基因序列范围内。对麦氏弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌、美人鱼弧菌、拟态弧菌、溶藻弧、福氏志贺氏菌、铜绿色假单胞菌、肠球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鲍曼不动杆菌、变形杆菌等16种细菌基因组DNA的扩增结果均为阴性。提示应用DPO引物所建立的八重PCR检测7种致病菌具有很好特异度，见图3(大肠杆菌O157：H7为阳性对照)。
8、方法现场验证
随机选择60份日常检测样本，用出入境行业标准检测方法(SN/T)和本发明的试剂盒对上述7种病原菌作平行检测，并以SN/T方法的检测结果为标准来验证8重DPO-PCR检测的灵敏度与特异度。行业标准检测方法的编号分别为：霍乱弧菌(SN/T1022-2010)、副溶血性弧菌(SN/T0173-2010)、创伤弧菌(DB44/T446-2007)、沙门氏菌(SN/T0170-2010)、金黄色葡萄球菌(SN/T0172-2010)、单增李斯特菌(GB4789-2010)与肠出血性大肠杆菌O157：H7(SN/T0973-2010)。
结果：随机选择60份日常检测样本，用出入境行业标准检测方法(SN/T)和本发明的试剂盒对上述7种病原菌平行检测结果一致，未见有假阳性与假阴性的现象出现。
霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌与肠出血性大肠杆菌O157：H7是食源性疾病的重要病原菌，严重的可危及人的生命。上述病原菌也是水产品、肉制品、禽蛋类食品进出口常规检测项目，快速准确的检测方法建立具有重要的食品卫生及公共卫生学意义。
普通引物构建的多重PCR反应体系较单一PCR更为复杂，由于受到多对引物之间最适退火温度差异、二聚体的形成、二价镁离子最适浓度较难调配等因素的影响，实际操作中常遇到扩增效率下降、非特异性扩增等等问题，目前报道较多的均为5重以下的多重PCR方法，若想突破5重以上的多重PCR就有较大的困难。
本发明针对食品增菌液或食源性疾病样本中的霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌与肠出血性大肠杆菌O157：H7七种病原菌的八个靶基因的保守序列设计DPO引物，开发了检测上述7种病原菌的八重PCR扩增试剂盒，能在同一反应管中实现对上述7种病原菌的鉴别诊断，DPO引物与普通引物相比除了灵敏度相同之外，其特异度更高、扩增产物更纯成像仪上观察到的杂带更少，引物自身及引物之间的干扰更小，更适用于构建5重以上的多重PCR体系。本发明建立的八重PCR技术为食品或食源性疾病样本的中的霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌与肠出血性大肠杆菌O157：H7七种病原菌的的感染提供了高通量的快速检测鉴定方法。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (2)

1.一种检测食品中致病菌的八重PCR扩增试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括如下组分：霍乱弧菌DPO正、反向引物各0.4μmol/L，副溶血性弧菌DPO正、反向引物各0.4μmol/L，单增李斯特菌DPO正、反向引物各0.4μmol/L，金黄色葡萄球菌DPO正、反向引物各0.5μmol/L，沙门氏菌DPO正、反向引物各0.6μmol/L，创伤弧菌DPO正、反向引物各0.7μmol/L，大肠杆菌O157-DPO正、反向引物各0.7μmol/L，大肠杆菌H7-DPO正、反向引物各0.4μmol/L，50-100mmol/L的pH8.0-8.5Tris-HCl，50-100mmol/L氯化钾，25-50mmol/L氯化镁，2-10mmol/L二硫苏糖醇，10％-15％DMSO，2.5-5.0mmol/L dNTP，0.1-0.2μg/μL BSA，1％TritonX-100，30-60mmol/L硫酸铵，5U/μL Taq酶；其中，霍乱弧菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.1所示，霍乱弧菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ IDNo.2所示；副溶血性弧菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.3所示，副溶血性弧菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.4所示；单增李斯特菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.5所示，单增李斯特菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.6所示；金黄色葡萄球菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.7所示，金黄色葡萄球菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.8所示；沙门氏菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQID No.9所示，沙门氏菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.10所示；创伤弧菌DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.11所示，创伤弧菌DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQID No.12所示；大肠杆菌O157-DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.13所示，大肠杆菌O157-DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.14所示；大肠杆菌H7-DPO正向引物核苷酸序列信息见SEQ ID No.15所示，大肠杆菌H7-DPO反向引物核苷酸序列信息见SEQ IDNo.16所示。
2.一种检测食品中致病菌的八重PCR扩增用DPO引物，其特征在于，包括：
霍乱弧菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.1所示；
霍乱弧菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.2所示；
副溶血性弧菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.3所示；
副溶血性弧菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.4所示；
单增李斯特菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.5所示；
单增李斯特菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.6所示；
金黄色葡萄球菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.7所示；
金黄色葡萄球菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.8所示；
沙门氏菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.9所示；
沙门氏菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.10所示；
创伤弧菌DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.11所示；
创伤弧菌DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.12所示；
大肠杆菌O157-DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.13所示；
大肠杆菌O157-DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.14所示；
大肠杆菌H7-DPO正向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.15所示；
大肠杆菌H7-DPO反向引物，核苷酸序列信息见SEQ ID No.16所示。
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