CN108950032A - 一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用 - Google Patents

一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用，其样品检测反应液中DNA模板为提取的霍乱弧菌基因组DNA，最低检测限为192fg/μL，针对附属毒素蛋白编码基因hlyA、rtxA、tlh，各设计六条特异性引物：FIP、BIP、F3、B3、LF和LF，其核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.18所示，反应恒温为65℃，反应时间为40min，仅通过肉眼观测或在紫外光下观测即可判定检测结果，属于生物检测技术领域，为我国重要食源性致病菌霍乱弧菌的检测及其在食品工业、公共卫生领域的应用提供快速、简单、灵敏、特异的检测方法。

Description

一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用。
背景技术
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是人烈性肠道传染性疾病霍乱的致病菌。该菌隶属于γ变形菌纲(Proteobacteria)、弧菌目(vibrionales)、弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)，革兰氏染色阴性。霍乱弧菌广泛分布于近岸海水、养殖水域，以及鱼类、甲壳类、贝类等水产品中，摄食毒性霍乱弧菌污染的水或水产品会导致严重的呕吐，腹泻，甚至死亡。
根据文献报道，自1817年以来，霍乱弧菌引起全球七次霍乱大流行，其中第七次始于1961年一直延续至今，导致数百万人死亡。根据世界卫生组织(World HealthOrganization，WHO)的最新报道，2017年12月霍乱疫情在索马里暴发，截至2018年6月共造成4643例霍乱病例，32人死亡。迄今为止，已发现至少206种血清型霍乱弧菌，其中仅O1和O139血清型菌株产生霍乱毒素(cholera toxin，CT)及其受体毒素共调节纤毛(toxincoregulated pilus，TCP)，造成霍乱大流行。近年来，大量研究发现，非O1/O139血清型菌株与霍乱局部暴发和临床散发病例相关，其基因组可携带分泌型溶血素A(haemolysin A，HlyA)、毒素中肌纤蛋白交叉连接重复子A(actincross-linking repeats in toxin A，RtxA)、不耐热溶血素(thermolabile haemolysin，Tlh)等附属毒素蛋白(accessory toxinproteins)编码基因，因此，检测这些毒力相关基因对于保障国家食品安全、人民健康迫切需要。
传统的基因体外扩增聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)受诸多因素限制，如需要两条特异性引物；需要30～35个模板DNA的变性、复性和延伸的反应循环，且分别在三种不同的温度条件(93～95℃、55～65℃、72℃)下进行，需要特殊的PCR仪；需要2～3h才能完成；还需要打开PCR反应管，通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像仪检测反应产物等。近年来基因的体外环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术因其恒温特性，而在生物检测领域备受关注。
发明内容
为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，包括：FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物和LB引物。
优选的，所述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因包括溶血素A(hlyA)、毒素中肌纤蛋白交叉连接重复子A(rtxA)、不耐热溶血素(tlh)的编码基因。
更优选的，针对所述hlyA基因，
所述FIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1；
所述BIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2；
所述F3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3；
所述B3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4；
所述LF引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5；
所述LB引物的核苷酸序列为SEQ ID No.6。
更优选的，针对所述rtxA基因，
所述FIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.7；
所述BIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.8；
所述F3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.9；
所述B3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.10；
所述LF引物的核苷酸序列为SEQ ID No.11；
所述LB引物的核苷酸序列为SEQ ID No.12。
更优选的，针对所述tlh基因，
所述FIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.13；
所述BIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.14；
所述F3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.15；
所述B3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.16；
所述LF引物的核苷酸序列为SEQ ID No.17；
所述LB引物的核苷酸序列为SEQ ID No.18。
本发明的第二方面，上述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组在制备治疗或诊断霍乱疾病药物中的应用。
本发明的第三方面，上述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组在制备核酸扩增试剂中的应用。
本发明的第四方面，霍乱弧菌检测试剂盒，包括上述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，还包括待测样品的霍乱弧菌基因组DNA模板。
优选的，所述霍乱弧菌检测试剂盒还包括甜菜碱、反应缓冲液、dNTPs、显色剂、BstDNA聚合酶，以及灭菌去离子水或超纯水。
优选的，所述DNA模板的最低检测限为192fg/μL。
本发明的第五方面，上述霍乱弧菌检测试剂盒在检测霍乱弧菌上的应用。
本发明的第六方面，霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的霍乱弧菌基因组DNA作为DNA模板；
(2)设计霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组；
(3)配制待测样品的LAMP检测反应液：包括不同终浓度的步骤(1)中所述模板DNA、步骤(2)中所述检测引物组、甜菜碱、反应缓冲液、dNTPs、显色剂和Bst DNA聚合酶的灭菌去离子水或超纯水溶液；
(4)运行LAMP扩增反应：在反应温度为65℃下将步骤(3)中所述LAMP检测反应液恒温孵育40min终止反应；
(5)LAMP扩增结果鉴定：通过肉眼观察经步骤(4)LAMP扩增反应后的显色情况，判断检测结果。
优选的，所述DNA模板的最低检测限为192fg/μL。
优选的，所述检测引物组中，所述FIP引物和所述BIP引物的终浓度均为1.6μM，所述F3引物和所述B3引物的终浓度均为0.2μM，所述LF引物和所述LB引物的终浓度均为0.8μM。
优选的，所述甜菜碱的终浓度为0.8mM。
优选的，所述反应缓冲液中Mn2+的终浓度为0.6mM、Mg2+的终浓度为6.0mM。
优选的，所述dNTPs的终浓度为1.0mM。
优选的，所述显色剂的终浓度为50μM。
优选的，所述Bst DNA聚合酶的终浓度为0.32U/μL。
更优选的，所述显色剂为钙黄绿素。
本发明的第七方面，上述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法用于检测霍乱弧菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明基于LAMP针对每个目标靶基因设计六条特异性引物，识别靶基因六个特定区域，降低了非特异性扩增，增强了检测的特异性；整个扩增反应在65℃恒温条件下40min内完成；不需要打开PCR反应管，避免了气溶胶引起的污染；也不需要特殊的检测设备，仅通过肉眼观测或在紫外光下观测即可判定检测结果；检测方法具有快速、简单、灵敏、特异的优势，尤其适用于大量样品快速筛查等方面。
附图说明
图1是实施例1中霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因hlyA的检测灵敏度结果；其中，反应管号0～10依次表示霍乱弧菌基因组DNA模板的10倍梯度稀释，即192.371ng/μL～192.371×10-10ng/μL，11表示空白对照；(A)：在可见光下的观测结果；(B)：在紫外光下(波长302nm)的观测结果；(C)：琼脂糖凝胶电泳验证结果(2％agarose，100V，45min)；泳道0～11与反应管号一致，M：DNA分子量Marker；
图2是实施例2中霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因rtxA的检测灵敏度结果；其中，反应管号0～10依次表示霍乱弧菌基因组DNA模板的10倍梯度稀释，即192.371ng/μL～192.371×10-10ng/μL，11表示空白对照；(A)：在可见光下的观测结果；(B)：在紫外光下(波长302nm)的观测结果；(C)：琼脂糖凝胶电泳验证结果(2％agarose，100V，45min)；泳道0～11与反应管号一致，M：DNA分子量Marker；
图3是实施例3中霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因tlh的检测灵敏度结果；其中，反应管号0～10依次表示霍乱弧菌基因组DNA模板的10倍梯度稀释，即192.371ng/μL～192.371×10-10ng/μL；11表示空白对照；(A)：在可见光下的观测结果；(B)：在紫外光下(波长302nm)的观测结果；(C)：琼脂糖凝胶电泳验证结果(2％agarose，100V，45min)；泳道0～11与反应管号一致；M：DNA分子量Marker；
图4是实施例1中霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因hlyA的检测特异性结果；其中，反应管号1～9分别表示DNA模板抽提自霍乱弧菌GIM1.449、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus ATCC33847)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、沙门氏菌(Salmonella)，以及阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)；10表示空白对照；(A)：在可见光下的观测结果；(B)：在紫外光下(波长302nm)的观测结果；(C)：琼脂糖凝胶电泳验证结果(2％agarose，100V，45min)；泳道1～10与反应管号一致；M：DNA分子量Marker；
图5是实施例2中霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因rtxA的检测特异性结果；其中，反应管号1～9分别表示DNA模板抽提自霍乱弧菌GIM1.449、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、沙门氏菌，以及阴沟肠杆菌；10表示空白对照；(A)：在可见光下的观测结果；(B)：在紫外光下(波长302nm)的观测结果；(C)：琼脂糖凝胶电泳验证结果(2％agarose，100V，45min)；泳道1～10与反应管号一致；M：DNA分子量Marker；
图6是实施例3中霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因tlh的检测特异性结果；其中，反应管号1～10分别表示DNA模板抽提自霍乱弧菌GIM1.449、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、沙门氏菌，以及阴沟肠杆菌；(A)：在可见光下的观测结果；(B)：在紫外光下(波长302nm)的观测结果；(C)：琼脂糖凝胶电泳验证结果(2％agarose，100V，45min)；泳道1～10与反应管号一致；M：DNA分子量Marker。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例中所用的MnCl2购自上海生工生物工程技术服务有限公司；1×Thermopolbuffer、MgSO4、Bst DNA聚合酶(8U/μl)均购自New England Bio-labs公司；甜菜碱、钙黄绿素均购自Sigma-Aldrich公司；dNTPs购自Takara-宝生物工程(大连)有限公司；Luria-Bertani(LB)培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；基因组DNA提取试剂盒TakaraMiniBEST Genome Purification Kit Ver.2.0购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司。
引物合成委托上海生工生物工程技术服务有限公司，且经过测序验证。
实施例中所用的霍乱弧菌基因组DNA的提取：
供试霍乱弧菌标准菌株为GIM 1.449(非O1血清型)，购自广东省微生物菌种保藏中心。接种上述霍乱弧菌于5ml LB培养基(3％NaCl，pH 8.5)，37℃培养16-18h。采用上述Takara Mini BEST Genome Purification Kit Ver.2.0试剂盒，根据试剂盒说明书步骤进行操作，提取基因组DNA。采用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA，采用Synergy 2型多功能酶标仪(BioTek公司)测定DNA浓度。提取的基因组DNA置于-20℃备用。
实施例中用于本发明提供的检测方法特异性分析的8种常见致病菌副溶血性弧菌、大肠杆菌均购自美国模式培养物积存库(American Type Culture Collection)；创伤弧菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、沙门氏菌，以及阴沟肠杆菌为实验室保存菌种，它们的基因组DNA的提取同样采用上述Takara MiniBEST Genome Purification KitVer.2.0试剂盒。
实施例1
制备样品检测反应液:在200μl PCR反应管内，依次加入适量的无菌水，1×Thermopol buffer[(20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100(pH 8.8，25℃))]，1.0mM dNTPs，6mM MgSO4，0.8mM甜菜碱，FIP引物和BIP引物各1.6μM，F3引物和B3引物各0.2μM，LF引物和LB引物各0.8μM，0.32U/μL Bst DNA聚合酶，1-2μlDNA模板，总体积为25μl。再加入50μM钙黄绿素，0.6mM MnCl2。阴性对照不加DNA模板。
hlyA基因序列：Genebank，基因ID：2612877，全长2，226bp。
hlyA基因的保守序列为第210至460nt：
TTTGGTGATTAACCAGCAAAAACGCGTTTTGGTTGATTTCAGTCAGATCAGTGATGCTGAAGGTCAAGCAGAGATGCAAGCCCAATTCAGAAAGGCTTATGGGGTGGGTTTTGCTAATCAATTTATTGTCATCACTGAACATAAAGGGGAACTGCTGTTTACACCTTTTGATCAGGCAGAAGAGGTTGACCCTCAATTACTCGAAGCGCCGCGTACCGCTCGCTTATTAGCGCGCTCTGGTTTTGCAAGTC，如SEQ ID No.19所示。
针对hlyA基因保守序列设计的FIP引物序列(5’→3’)为AGCCTTTCTGAATTGGGCTTGTTTCAGTCAGATCAGTGATGC。
针对hlyA基因保守序列设计的BIP引物序列(5’→3’)为TATGGGGTGGGTTTTGCTAATCATCTGCCTGATCAAAAGGTG。
针对hlyA基因保守序列设计的F3引物序列(5’→3’)为AAAACGCGTTTTGGTTGA。
针对hlyA基因保守序列设计的B3引物序列(5’→3’)为TCGAGTAATTGAGGGTCAAC。
针对hlyA基因保守序列设计的LF引物序列(5’→3’)为CATCTCTGCTTGACCTTC。
针对hlyA基因保守序列设计的LB引物序列(5’→3’)为AAGGGGAACTGCTGTTTA。
放置样品检测反应管于65℃恒温箱中或在水浴条件下，反应40min。
在可见光下，肉眼观测反应管内的样品检测反应液，存在hlyA基因扩增的阳性样品显绿色(如图1中A：反应管0～6所示)；而不存在hlyA基因扩增的阴性样品显橙黄色(如图1中A：反应管11所示)。
在紫外光下(302nm)，阳性样品发射出肉眼可见的荧光(如图1中B：反应管0～6所示)；而阴性样品无荧光(如图1中B：反应管11所示)。
采用琼脂糖凝胶电泳(2％agarose，100V，45min)进行验证，得到了与可视化结果一致的分析结果(如图1中C所示)。
通过10倍梯度稀释霍乱弧菌基因组DNA模板，即192.371ng/μL～192.371×10- 10ng/μL，分析检测方法的灵敏度，结果显示最低检测限为192fg/μl(如图1所示)。
提取8种常见致病菌基因组DNA，并分别以其为模板，分析本发明提供的检测方法的特异性，结果显示均无非特异性扩增(如图4所示)。
实施例2
样品检测反应液的制备，反应条件和反应时间均与实施例1相同，只是使用针对rtxA基因设计的六条特异性引物。
rtxA基因序列：Genebank，基因ID:2613957，全长13，677bp。
rtxA基因的保守序列为第468至956nt：
GGGATACAATGCCCTCTGGCATGAAACCAACCAAGGGAACCTGTCTTTTACAGGAGCAGGCGCAGGTAATAAATTAGACCGTACTTGGTCTAACCGTTATCAAGGCTCGCATGGCGATGTGACCTTTGATGGTGCTGGTGCCGCGAACAGCATCAGTTCACGCGTTGAGACAGGTAACATCACCTTCCGTGGCGCAGGTGCGGATAACCATTTAGTCCGTAAAGGCAAAGTGGGCGATATTACTCTGCAAGGTGCTGGGGCTTCAAACCGCATTGAGCGGACACATCAGGCCGAAGATGTCTACACGCAAACCCGCGGCAATATTCGTTTTGAAGGTGTGGGTGGTTACAACAGTCTTTACTCTGATGTGGCTCATGGTGACATTCATTTCTCGGGTGGCGGTGCGTACAACACCATTATTCGTAAAGGTTCTGGAAATGACTTTGCGAAAGAAGGCATGACCAATGCTAAGGCTGATGAGATTGTAT，如SEQ ID No.20所示。
针对rtxA基因保守序列设计的FIP引物序列(5’→3’)为GCCCACTTTGCCTTTACGGACTCAGTTCACGCGTTGAGACA。
针对rtxA基因保守序列设计的BIP引物序列(5’→3’)为CTGCAAGGTGCTGGGGCTTCGCGGGTTTGCGTGTAGAC。
针对rtxA基因保守序列设计的F3引物序列(5’→3’)为GACCTTTGATGGTGCTGGT。
针对rtxA基因保守序列设计的B3引物序列(5’→3’)为ACTGTTGTAACCACCCACAC。
针对rtxA基因保守序列设计的LF引物序列(5’→3’)为AAATGGTTATCCGCACCT。
针对rtxA基因保守序列设计的LB引物序列(5’→3’)为AAACCGCATTGAGCGGAC。
在可见光下，肉眼观测反应管内的样品检测反应液，存在rtxA基因扩增的阳性样品显绿色(如图2中A：反应管0～4所示)；而不存在rtxA基因扩增的阴性样品显橙黄色(如图2中A：反应管11所示)。
在紫外光下(302nm)，阳性样品发射出肉眼可见的荧光(如图2中B：反应管0～4所示)；而阴性样品无荧光(如图2中B：反应管11所示)。
采用琼脂糖凝胶电泳(2％agarose，100V，45min)进行验证，得到了与可视化结果一致的分析结果(如图2中C所示)。
通过10倍梯度稀释霍乱弧菌基因组DNA模板，即192.371ng/μL～192.371×10- 10ng/μL，分析检测方法的灵敏度，结果显示最低检测限为19.23pg/μL(如图2所示)。
提取8种常见致病菌基因组DNA，并分别以其为模板，分析本发明提供的检测方法的特异性，结果显示均无非特异性扩增(如图5所示)。
实施例3
样品检测反应液的制备，反应条件和反应时间均与实施例1相同，只是使用针对tlh基因设计的六条特异性引物。
tlh基因序列：Genebank，基因ID：2612876，全长1，257bp。
tlh基因的保守序列为第196至469nt：
TGGGAGTGGGCAAAGAATGCGGATGGTAGCTATTACACTATTCAGGGTTATTGGTGGTCGAGTATTCGACAAAAAAACATGTTTTACACGACAGTTCAGCCAGAAACCCTGTTAGAACGCTGTGAAGAGACGCTTGGTGTCAACCACGATTTTGCCGATATTACCTATTTCGCGGCCGATCATCGCTTTTCATACAACCACACTATTTGGAGCAATGATCCGGAGGTTCAGTCCAACCGCATCAGCAAAGTGATCGCGTTTGGCGATAGCCTTT，如SEQ ID No.21所示。
针对tlh基因保守序列设计的FIP引物序列(5’→3’)为ACAGGGTTTCTGGCTGAACTGTTTCAGGGTTATTGGTGGTCG。
针对tlh基因保守序列设计的BIP引物序列(5’→3’)为AGAACGCTGTGAAGAGACGCTTGATGATCGGCCGCGAAAT。
针对tlh基因保守序列设计的F3引物序列(5’→3’)为AAAGAATGCGGATGGTAGCT。
针对tlh基因保守序列设计的B3引物序列(5’→3’)为TCCGGATCATTGCTCCAAAT。
针对tlh基因保守序列设计的LF引物序列(5’→3’)为CGTGTAAAACATGTTTTTTTGTCG。
针对tlh基因保守序列设计的LB引物序列(5’→3’)为AACCACGATTTTGCCGATATTAC。
在可见光下，肉眼观测反应管内的样品检测反应液，存在tlh基因扩增的阳性样品显绿色(如图2中A：反应管0～5所示)；而不存在tlh基因扩增的阴性样品显橙黄色(如图3中A：反应管11所示)。
在紫外光下(302nm)，阳性样品发射出肉眼可见的荧光(如图2中B：反应管0～5所示)；而阴性样品无荧光(如图3中B：反应管11所示)。
采用琼脂糖凝胶电泳(2％agarose，100V，45min)进行验证，得到了与可视化结果一致的分析结果(如图3中C所示)。
通过10倍梯度稀释霍乱弧菌基因组DNA模板，即192.371ng/μL～192.371×10- 10ng/μL，分析检测方法的灵敏度，结果显示最低检测限为1.92pg/μL(如图3所示)。
提取8种常见致病菌基因组DNA，并分别以其为模板，分析本发明提供的检测方法的特异性，结果显示均无非特异性扩增(如图6所示)。
上述实施例1、2、3证明本发明中霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法快速、简单、灵敏、特异。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法和应用
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agcctttctg aattgggctt gtttcagtca gatcagtgat gc 42
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tatggggtgg gttttgctaa tcatctgcct gatcaaaagg tg 42
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aaaacgcgtt ttggttga 18
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tttggtgatt aaccagcaaa aacgcgtttt ggttgatttc agtcagatca gtgatgctga 60
aggtcaagca gagatgcaag cccaattcag aaaggcttat ggggtgggtt ttgctaatca 120
atttattgtc atcactgaac ataaagggga actgctgttt acaccttttg atcaggcaga 180
agaggttgac cctcaattac tcgaagcgcc gcgtaccgct cgcttattag cgcgctctgg 240
ttttgcaagt c 251
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gggatacaat gccctctggc atgaaaccaa ccaagggaac ctgtctttta caggagcagg 60
cgcaggtaat aaattagacc gtacttggtc taaccgttat caaggctcgc atggcgatgt 120
gacctttgat ggtgctggtg ccgcgaacag catcagttca cgcgttgaga caggtaacat 180
caccttccgt ggcgcaggtg cggataacca tttagtccgt aaaggcaaag tgggcgatat 240
tactctgcaa ggtgctgggg cttcaaaccg cattgagcgg acacatcagg ccgaagatgt 300
ctacacgcaa acccgcggca atattcgttt tgaaggtgtg ggtggttaca acagtcttta 360
ctctgatgtg gctcatggtg acattcattt ctcgggtggc ggtgcgtaca acaccattat 420
tcgtaaaggt tctggaaatg actttgcgaa agaaggcatg accaatgcta aggctgatga 480
gattgtat 488
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tgggagtggg caaagaatgc ggatggtagc tattacacta ttcagggtta ttggtggtcg 60
agtattcgac aaaaaaacat gttttacacg acagttcagc cagaaaccct gttagaacgc 120
tgtgaagaga cgcttggtgt caaccacgat tttgccgata ttacctattt cgcggccgat 180
catcgctttt catacaacca cactatttgg agcaatgatc cggaggttca gtccaaccgc 240
atcagcaaag tgatcgcgtt tggcgatagc cttt 274

Claims (15)

1.霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，包括：FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物和LB引物。
2.如权利要求1所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，所述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因包括溶血素A(hlyA)、毒素中肌纤蛋白交叉连接重复子A(rtxA)、不耐热溶血素(tlh)的编码基因。
3.如权利要求1或2所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，针对所述hlyA基因，
所述FIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1；
所述BIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2；
所述F3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3；
所述B3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4；
所述LF引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5；
所述LB引物的核苷酸序列为SEQ ID No.6。
4.如权利要求1或2所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，针对所述rtxA基因，
所述FIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.7；
所述BIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.8；
所述F3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.9；
所述B3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.10；
所述LF引物的核苷酸序列为SEQ ID No.11；
所述LB引物的核苷酸序列为SEQ ID No.12。
5.如权利要求1或2所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，其特征在于，针对所述tlh基因，
所述FIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.13；
所述BIP引物的核苷酸序列为SEQ ID No.14；
所述F3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.15；
所述B3引物的核苷酸序列为SEQ ID No.16；
所述LF引物的核苷酸序列为SEQ ID No.17；
所述LB引物的核苷酸序列为SEQ ID No.18。
6.如权利要求1～5任一项所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组在制备治疗或诊断霍乱疾病药物中的应用。
7.如权利要求1～5任一项所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组在制备核酸扩增试剂中的应用。
8.一种霍乱弧菌检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～5任一项所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组，还包括待测样品的霍乱弧菌基因组DNA模板。
9.如权利要求8所述的霍乱弧菌检测试剂盒，其特征在于，还包括甜菜碱、反应缓冲液、dNTPs、显色剂、Bst DNA聚合酶、及灭菌去离子水或超纯水。
10.如权利要求8所述的霍乱弧菌检测试剂盒，其特征在于，所述待测样品的霍乱弧菌基因组DNA模板的最低检测限为192fg/μL。
11.如权利要求8～10任一项所述霍乱弧菌检测试剂盒在检测霍乱弧菌上的应用。
12.一种霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的霍乱弧菌基因组DNA作为DNA模板；
(2)设计如权利要求1～5任一项所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测引物组；
(3)配制待测样品的LAMP检测反应液：包括不同终浓度的步骤(1)中所述模板DNA、步骤(2)中所述检测引物组、甜菜碱、反应缓冲液、dNTPs、显色剂和Bst DNA聚合酶的灭菌去离子水或超纯水溶液；
(4)运行LAMP扩增反应：在反应温度为65℃下将步骤(3)中所述LAMP检测反应液恒温孵育40min终止反应；
(5)LAMP扩增结果鉴定：通过肉眼观察经步骤(4)LAMP扩增反应后的显色情况，判断检测结果。
13.如权利要求12所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法，其特征在于，
所述DNA模板的最低检测限为192fg/μL；
所述检测引物组中，所述FIP引物和所述BIP引物的终浓度均为1.6μM，所述F3引物和所述B3引物的终浓度均为0.2μM，所述LF引物和所述LB引物的终浓度均为0.8μM；
所述甜菜碱的终浓度为0.8mM；
所述反应缓冲液中Mn2+的终浓度为0.6mM、Mg2+的终浓度为6.0mM；
所述dNTPs的终浓度为1.0mM；
所述显色剂的终浓度为50μM；
所述Bst DNA聚合酶的终浓度为0.32U/μL。
14.如权利要求12或13所述的霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法，其特征在于，所述显色剂为钙黄绿素。
15.如权利要求12～14任一项所述霍乱弧菌附属毒素蛋白编码基因的检测方法用于检测霍乱弧菌。
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