CN109576384A - 用于检测食源性致病菌的核酸试剂、试剂盒及系统 - Google Patents

用于检测食源性致病菌的核酸试剂、试剂盒及系统 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于检测食源性致病菌的核酸试剂、试剂盒及系统，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1‑42所示的引物和SEQ ID NO.45‑65所示的探针。本公开通过以上所述的引物和探针建立了检测19种易致病的食源性致病菌的核酸试剂、试剂盒及系统，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对多种食源性致病菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

用于检测食源性致病菌的核酸试剂、试剂盒及系统
技术领域
本公开涉及食源性致病菌的检测，具体地，涉及一种用于检测食源性致病菌的核酸试剂、试剂盒及系统。
背景技术
食源性疾病是世界性的公共健康问题，其大规模爆发在许多国家都经常发生。全球化的食品供应意味着食源性疾病可以在不同的国家快速传播蔓延,严重危害人类健康。目前世界上大概有250种食源性疾病。高发病率以及特定人群如婴幼儿、老人、免疫力低下者中的高致死率是其主要特点。食源性疾病基本上都是由摄入被细菌、病毒、寄生虫或有毒的化学物质、生物毒素污染的水和食物等引起的。引起食源性疾病的致病菌叫做食源性致病菌，主要包括细菌、真菌和病毒。
食源性致病菌是引起食物中毒的重要生物学因素。随着国家对食品安全工作的重视，快速筛查食物中毒原因成为当务之急。根据美国农业部经济研究局的统计结果显示，沙门氏菌、致病性大肠杆菌(EPEC、ETEC、EIEC、EAEC、EHEC)、弯曲杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、致病性蜡样芽胞杆菌、变形杆菌属、李斯特氏菌、志贺氏菌等几类重要的细菌会造成巨大的经济损失。其中副溶血性弧菌是导致我国食物中毒的重要食源性致病菌之一，并且副溶血性弧菌菌株存在多种血清型，例如O3：K6及O4：K68等，导致在食物链中存在大流行菌株且成为食源性疾病的主要致病原因。
近年来食品安全得到了世界各国的普遍关注。每年向卫生部上报的食物中毒人数逐年递增，且大部分是由食源性致病菌所引起。据世界卫生组织估计，全世界每年的食源性疾病患者中，70％都是由致病性微生物引起的。由此可见，食源性疾病与食品污染问题已成为世界范围内举足轻重的公共卫生问题。所以建立有效的食源性致病菌检测体系，快速并且准确地完成对食品中致病菌的检测已成为保障食品安全和防止疾病传染的关键。
在食源性致病菌的检测方法中，传统的平板培养法是广泛使用的方法。其优点是操作简单、成本低。缺点是检测灵敏度低，工作量大，检测周期长，每次只能检出1种致病菌。对于“活的非可培养”状态细菌，传统的培养法会引起假阴性结果的产生，造成漏检，增加食源性疾病的传播几率。目前，已有34个属的68种细菌被证实可进入这一状态并保持毒力或致病性。
核酸法是食源性致病菌检测中普遍采用的一类方法(主要包括普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，多重PCR(multiplex PCR,mPCR)，实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)，核酸依赖性扩增(nuclear acid sequence-basedamplification，NASBA)，环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和基因芯片等，通过设计引物和探针，检测目标致病菌的特异DNA或RNA序列。其特点是快速、准确、灵敏，能够实现样品的痕量检测，在食品检验及食品突发事故应急处理中发挥重要作用。但是在技术上也存在着一定的不足，如易污染；易出现假阳性或假阴性；食品基质影响致病菌DNA的分离和提取，造成漏检等。
常用的PCR检测需要前期复杂的样本处理过程、繁琐的试验程序及复杂的结果判断。此外，RT-PCR所能覆盖的检测目标有限，需要通过多体系的设置才能实现多目标的检测，增加了操作的复杂性。
发明内容
本公开的目的是提供一种快速、准确、一体化的检测多种食源性致病菌的核酸试剂、试剂盒及系统。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种用于检测食源性致病菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-42所示的引物和SEQ ID NO.45-65所示的探针。
可选地，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-42所示的引物的含量各自为0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.5-0.6μM、0.8-0.1μM、0.5-0.6μM、0.6-1.0μM、0.5-0.6μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-0.8μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM和0.4-0.5μM，分别由SEQ ID NO.45-65所示的探针的含量各自独立地为0.1-0.3μM。
可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控；所述的阳性内质控含有SEQ ID NO.43-44所示的引物、SEQ ID NO.66所示的探针和pET28a质粒。
可选地，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-12,43-44所示的引物和SEQ ID NO.45-50,66所示的探针；B管含有SEQ ID NO.13-24,43-44所示的引物和SEQ ID NO.51-56,66所示的探针；C管含有SEQ ID NO.25-36,43-44所示的引物和SEQ IDNO.57-62,66所示的探针；D管含有SEQ ID NO.37-42,43-44所示的引物和SEQ ID NO.63-65,66所示的探针。
可选地，SEQ ID NO.45-47,51-53,57-59,63所示的探针具有第一荧光标记；SEQID NO.48-49,54-55,60-61,64-65所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.50,56,62,66所示的探针具有第三荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记、TAMRA荧光标和ROX荧光标记中的一种
本公开第二方面：提供一种用于检测食源性致病菌的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、氯化镁、DNA聚合酶、dNTP和水中的至少一种。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测食源性致病菌的试剂盒中的用途。
可选地，所述食源性致病菌包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株。
本公开第四方面：提供一种用于检测食源性致病菌的系统，该系统包括采样器，具有A管检测器、B管检测器、C管检测器、和D管检测器的PCR仪，计算装置以及输出装置，所述采样器为容纳食源性致病菌症状的样本或核酸的容器，所述检测器为装载有如上所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道标记、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道、TAMRA荧光通道和ROX荧光通道中的一种，所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若A管第一荧光通道有Tm值为58.6℃对应的溶解峰曲线判定为沙门氏菌阳性；A管第一荧光通道有Tm值为62.1℃对应的溶解峰曲线判定为志贺氏菌阳性；A管第一荧光通道有Tm值为65.4℃对应的溶解峰曲线判定为副溶血性弧菌阳性；A管第二荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为空肠弯曲菌阳性；A管第二荧光通道有Tm值为64.5℃对应的溶解峰曲线判定为结肠弯曲菌阳性；A管第三荧光通道有Tm值为57.8℃对应的溶解峰曲线判定为金黄色葡萄球菌阳性；A管第三荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；B管第一荧光通道有Tm值为58℃对应的溶解峰曲线判定为单核细胞增生性李斯特氏菌阳性；B管第一荧光通道有Tm值为61.2℃对应的溶解峰曲线判定为小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性；B管第一荧光通道有Tm值为64.9℃对应的溶解峰曲线判定为阪崎肠杆菌阳性；B管第二荧光通道有Tm值为57.7℃对应的溶解峰曲线判定为大肠埃希氏菌阳性；B管第二荧光通道有Tm值为63.5℃对应的溶解峰曲线判定为霍乱弧菌阳性；B管第三荧光通道有Tm值为57.4℃对应的溶解峰曲线判定为产志贺毒素的大肠杆菌阳性；B管第三荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；C管第一荧光通道有Tm值为57.3℃对应的溶解峰曲线判定为气单胞菌属阳性；C管第一荧光通道有Tm值为61.6℃对应的溶解峰曲线判定为弯曲菌属阳性；C管第一荧光通道有Tm值为64.9℃对应的溶解峰曲线判定为弧菌属阳性；C管第二荧光通道有Tm值为57.4℃对应的溶解峰曲线判定为产气荚膜梭菌阳性；C管第二荧光通道有Tm值为62.6℃对应的溶解峰曲线判定为变形杆菌阳性；C管第三荧光通道有Tm值为63.9℃对应的溶解峰曲线判定为蜡样芽孢杆菌阳性；C管第三荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；D管第一荧光通道有Tm值为62.6℃对应的溶解峰曲线判定为嗜水气单胞菌阳性；D管第二荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为副溶血性弧菌大流行菌株；A管第三荧光通道、B管第三荧光通道、C管第三荧光通道和D管第三荧光通道分别有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控阳性。
本公开的有益效果在于：
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测多种食源性致病菌，能够实现形态学、免疫学及RT-PCR检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：
(一)较高的多重检测能力
近几年关于食源性致病菌的检测报道中大多采用RT-PCR的方法进行检测，该方法虽然可以实现多目标的检测，但是受荧光通道数目的限制，需要多个扩增体系联检才能实现，增加了操作的复杂性。本公开只需四个体系即可一次性的检测食源性致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌十九种目标，并且可对副溶血性弧菌的大流行菌株进行鉴定。检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和物力成本。
(二)简易的操作环节
食物样本或是污染食物样本的增菌液可通过采样器直接放置于ParaDNA的反应器中直接检测即可获得可靠的结果，避免了昂贵费时的样本提取步骤，实现了除专业实验室外的应急检测。
(三)较高程度的检测一体化
针对食源性疾病多种病原体检测的需求，提供了一套全面、快速、准确及操作简便的检测食源性腹泻感染病原体的一体化解决方案，包括了核酸的快速提取、荧光PCR扩增及自动化结果的判定，
(四)特异性好
本公开的核酸试剂，所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性，经过特异性实验验证能够很好的区分包括炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌的其他食源性病原体。
(五)最低检出限
最低检出限可达到10拷贝/反应。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种用于检测食源性致病菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-42所示的引物和SEQ IDNO.45-65所示的探针。
本公开采用Hybeacon探针技术结合ParaDNA分析，能够快速、准确、一体化地检测多种食源性致病菌。其中，所述食源性致病菌可以包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株。
Hybeacon探针技术对探针的要求较高，探针的Tm值尤为重要；此外，探针与引物的组合效果对扩增效果也有重要的影响。上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估Tm值、目标对应探针的Tm值的差值、GC含量、避免出现发夹结构及二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖上述多种食源性致病菌，特异性良好并且覆盖度高。
进一步地，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-42所示的引物的含量可以各自可以为0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.5-0.6μM、0.8-0.1μM、0.5-0.6μM、0.6-1.0μM、0.5-0.6μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-0.8μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM和0.4-0.5μM，分别由SEQ ID NO.45-65所示的探针的含量可以各自独立地可以为0.1-0.3μM。
根据本公开，为做好质量控制，所述核酸试剂还可以包括阳性内质控(InternalAmplification Control，IAC)。进一步地，所述的阳性内质控可以含有SEQ ID NO.43-44所示的引物、SEQ ID NO.66所示的探针和pET28a质粒(模板)。这时，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.43-44所示的引物的含量各自可以为0.6-1.0μM和0.3-0.5μM，由SEQ ID NO.66所示的探针的含量可以为0.1-0.3μM。所述阳性内质控可以有效提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。
根据本公开，为了增强检测结果的准确性，所述核酸试剂可以分为四管，即所述核酸试剂可以包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-12,43-44所示的引物和SEQ IDNO.45-50,66所示的探针；B管含有SEQ ID NO.13-24,43-44所示的引物和SEQ ID NO.51-56,66所示的探针；C管含有SEQ ID NO.25-36,43-44所示的引物和SEQ ID NO.57-62,66所示的探针；D管含有SEQ ID NO.37-42,43-44所示的引物和SEQ ID NO.63-65,66所示的探针。为了增强溶解峰效果，上述目标探针均可为双标记探针。这样，利用4组体系即可敏感特异地实现多种食源性致病菌的系统筛检。
进一步地，可以根据探针各自的Tm值进行荧光标记的排列组合，使得同一体系中的不同探针的扩增被分别识别。例如，作为一种实施方式，SEQ ID NO.45-47,51-53,57-59,63所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.48-49,54-55,60-61,64-65所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.50,56,62,66所示的探针具有第三荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记、TAMRA荧光标和ROX荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，SEQ ID NO.45-47,51-53,57-59,63所示的探针具有FAM荧光标记；SEQID NO.48-49,54-55,60-61,64-65所示的探针具有JOE荧光标记；SEQ ID NO.50,56,62,66所示的探针具有TAMRA荧光标记。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明，HEX为六氯-6-甲基荧光素，ROX为6-羧基四甲基罗丹明，VIC为购自ABI公司的染料。
本公开第二方面：提供、一种用于检测食源性致病菌的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、氯化镁、DNA聚合酶、dNTP和水中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒可以用于检测食物样本或污染食物样本的增菌液中的食源性致病菌。其中，所述食源性致病菌可以包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株。
本公开的试剂盒能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对19种食源性致病菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测食源性致病菌的试剂盒中的用途。其中，所述食源性致病菌可以包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株。
本公开第四方面：提供一种用于检测食源性致病菌的系统，该系统包括采样器，具有A管检测器、B管检测器、C管检测器、和D管检测器的PCR仪，计算装置以及输出装置，所述采样器为容纳食源性致病菌症状的样本或核酸的容器，所述检测器为装载有如上所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道标记、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道、TAMRA荧光通道和ROX荧光通道中的一种，所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若A管第一荧光通道有Tm值为58.6℃对应的溶解峰曲线判定为沙门氏菌阳性；A管第一荧光通道有Tm值为62.1℃对应的溶解峰曲线判定为志贺氏菌阳性；A管第一荧光通道有Tm值为65.4℃对应的溶解峰曲线判定为副溶血性弧菌阳性；A管第二荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为空肠弯曲菌阳性；A管第二荧光通道有Tm值为64.5℃对应的溶解峰曲线判定为结肠弯曲菌阳性；A管第三荧光通道有Tm值为57.8℃对应的溶解峰曲线判定为金黄色葡萄球菌阳性；A管第三荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；B管第一荧光通道有Tm值为58℃对应的溶解峰曲线判定为单核细胞增生性李斯特氏菌阳性；B管第一荧光通道有Tm值为61.2℃对应的溶解峰曲线判定为小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性；B管第一荧光通道有Tm值为64.9℃对应的溶解峰曲线判定为阪崎肠杆菌阳性；B管第二荧光通道有Tm值为57.7℃对应的溶解峰曲线判定为大肠埃希氏菌阳性；B管第二荧光通道有Tm值为63.5℃对应的溶解峰曲线判定为霍乱弧菌阳性；B管第三荧光通道有Tm值为57.4℃对应的溶解峰曲线判定为产志贺毒素的大肠杆菌阳性；B管第三荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；C管第一荧光通道有Tm值为57.3℃对应的溶解峰曲线判定为气单胞菌属阳性；C管第一荧光通道有Tm值为61.6℃对应的溶解峰曲线判定为弯曲菌属阳性；C管第一荧光通道有Tm值为64.9℃对应的溶解峰曲线判定为弧菌属阳性；C管第二荧光通道有Tm值为57.4℃对应的溶解峰曲线判定为产气荚膜梭菌阳性；C管第二荧光通道有Tm值为62.6℃对应的溶解峰曲线判定为变形杆菌阳性；C管第三荧光通道有Tm值为63.9℃对应的溶解峰曲线判定为蜡样芽孢杆菌阳性；C管第三荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；D管第一荧光通道有Tm值为62.6℃对应的溶解峰曲线判定为嗜水气单胞菌阳性；D管第二荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为副溶血性弧菌大流行菌株；A管第三荧光通道、B管第三荧光通道、C管第三荧光通道和D管第三荧光通道分别有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控阳性。
本公开建立了检测19种易致病的食源性致病菌的核酸试剂、试剂盒及系统，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对19种食源性致病菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。
以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。
以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在艾吉析科技(上海)有限公司合成。
实施例
1、引物、探针合成
按照表1和表2所示的引物、探针序列，进行序列合成。序列中y代表简并碱基t/c；r代表简并碱基a/g；w代表简并碱基a/t；m代表简并碱基a/c；k代表简并碱基g/t；s代表简并碱基g/c；w代表简并碱基a/t；n代表简并碱基a/t/c/g。探针中FAM为6-羧基荧光素、JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素、TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明。表2的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表1
表2
2、模板提取
使用与ParaDNA配套的采样器采集食物样本或污染食物样本的增菌液后，直接置于ParaDNA的反应器中即可扩增。
3、构建Hybeacon探针技术检测体系
聚合酶Phire Hot Start II DNA Polymerase(货号F122L)，Mg2+、dNTPS购自ThermoFisher公司；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；荧光检测仪为ParaDNA。
反应体系的配制如下：
按照如下操作配制反应体系：总体系15μL。5×PCR Buffer 4μL，氯化镁溶液3-4mM，dNTPS为1-1.5mM，上游引物0.3-1μM，下游引物0.3-0.5μM，Hybeacon探针0.1-0.3μM，具体引物和探针含量见表3，剩余用水补足。
表3
SEQ ID NO 终浓度(μM) SEQ ID NO 终浓度(μM) SEQ ID NO 终浓度(μM)
1 1 23 0.8 45 0.2
2 0.5 24 0.4 46 0.2
3 0.8 25 1 47 0.2
4 0.55 26 0.5 48 0.2
5 0.8 27 0.8 49 0.2
6 0.55 28 0.4 50 0.2
7 1 29 1 51 0.3
8 0.5 30 0.5 52 0.3
9 1 31 0.8 53 0.3
10 0.4 32 0.4 54 0.3
11 0.8 33 0.8 55 0.3
12 0.3 34 0.4 56 0.3
13 0.8 35 1 57 0.3
14 0.4 36 0.5 58 0.3
15 0.8 37 1 59 0.3
16 0.5 38 0.4 60 0.3
17 1 39 1 61 0.3
18 0.5 40 0.5 62 0.3
19 1 41 1 63 0.2
20 0.5 42 0.5 64 0.2
21 1 43 1 65 0.2
22 0.5 44 0.5 66 0.2
试剂盒分为A管、B管、C管和D管4个反应管，A管含有上表1中SEQ ID NO.1-12,43-44所示的引物和上表2中SEQ ID NO.45-50,66所示的探针；B管含有上表1中SEQ ID NO.13-24,43-44所示的引物和上表2中SEQ ID NO.51-56,66所示的探针；C管含有上表1中SEQ IDNO.25-36,43-44所示的引物和上表2中SEQ ID NO.57-62,66所示的探针；D管含有上表1中SEQ ID NO.37-42,43-44所示的引物和上表2中SEQ ID NO.63-65,66所示的探针。
反应条件：选择FAM、JOE和TAMRA作为报告基团，反应程序如下：45℃-55℃，7-10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，30-40个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
4、特异性验证
选择炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等(上述样本均来源于国家CDC)作为特异性评估样本，人工提取核酸。每种核酸模板取10μL等体积混合，综合核酸作为特异性评估模板。
按照如下操作配制反应体系：总体系15μL。5x Phire Buffer 4μL，Phire HotStart II DNA Polymerase1-1.2μL，氯化镁溶液0.2μL(25mM)，dNTPS为0.4μL(10mM)，上游引物3μL(10μM)，下游引物1.5μL(10μM)，Hybeacon探针0.6μL(10μM)，模板4.2μL，剩余用水补足；
反应条件：选择FAM、JOE、TAMRA作为报告基团，反应程序如下：98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，35个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
反应结果判断：空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若A管FAM通道有Tm值为58.6℃对应的溶解峰曲线判定为沙门氏菌阳性；A管FAM荧光通道有Tm值为62.1℃对应的溶解峰曲线判定为志贺氏菌阳性；A管FAM荧光通道有Tm值为65.4℃对应的溶解峰曲线判定为副溶血性弧菌阳性；A管JOE荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为空肠弯曲菌阳性；A管JOE荧光通道有Tm值为64.5℃对应的溶解峰曲线判定为结肠弯曲菌阳性；A管TAMRA荧光通道有Tm值为57.8℃对应的溶解峰曲线判定为金黄色葡萄球菌阳性；A管TAMRA荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；B管FAM荧光通道有Tm值为58℃对应的溶解峰曲线判定为单核细胞增生性李斯特氏菌阳性；B管FAM荧光通道有Tm值为61.2℃对应的溶解峰曲线判定为小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性；B管FAM荧光通道有Tm值为64.9℃对应的溶解峰曲线判定为阪崎肠杆菌阳性；B管JOE荧光通道有Tm值为57.7℃对应的溶解峰曲线判定为大肠埃希氏菌阳性；B管JOE荧光通道有Tm值为63.5℃对应的溶解峰曲线判定为霍乱弧菌阳性；B管TAMRA荧光通道有Tm值为57.4℃对应的溶解峰曲线判定为产志贺毒素的大肠杆菌阳性；B管TAMRA荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；C管FAM荧光通道有Tm值为57.3℃对应的溶解峰曲线判定为气单胞菌属阳性；C管FAM荧光通道有Tm值为61.6℃对应的溶解峰曲线判定为弯曲菌属阳性；C管FAM荧光通道有Tm值为64.9℃对应的溶解峰曲线判定为弧菌属阳性；C管JOE荧光通道有Tm值为57.4℃对应的溶解峰曲线判定为产气荚膜梭菌阳性；C管JOE荧光通道有Tm值为62.6℃对应的溶解峰曲线判定为变形杆菌阳性；C管TAMRA荧光通道有Tm值为63.9℃对应的溶解峰曲线判定为蜡样芽孢杆菌阳性；C管TAMRA荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；D管FAM荧光通道有Tm值为62.6℃对应的溶解峰曲线判定为嗜水气单胞菌阳性；D管JOE荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为副溶血性弧菌大流行菌株；A管TAMRA荧光通道、B管TAMRA荧光通道、C管TAMRA荧光通道和D管TAMRA荧光通道分别有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控阳性，用于质控样本提取、检测质量。
结果显示在阳性对照成立的条件下，待检目标均无特异性的溶解峰，表明本公开试剂盒能够有效区分检测目标与非检测目标，具有较好的特异性。
5、最低检出限验证
评估用检测样本：选取初始浓度为105拷贝/μL的沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株核酸梯度稀释为104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL，作为最低检出限评估的模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。
结果显示本公开试剂盒的最低检出限可达到10拷贝/反应。
6、覆盖度验证
选择20种来源不同的沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株的增菌液核酸作为覆盖度评估用模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。
结果显示对上述所有食源性致病菌均可覆盖检测出。
7、试剂盒的保存期试验
以100拷贝/μL的沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株的增菌液样本作为评估用样本。
在第0天时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。
结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为一年。
对比例
1、引物、探针合成
按照表4和表5所示的引物、探针序列，进行序列合成。序列中y代表简并碱基t/c；r代表简并碱基a/g；w代表简并碱基a/t；m代表简并碱基a/c；k代表简并碱基g/t；s代表简并碱基g/c；w代表简并碱基a/t；n代表简并碱基a/t/c/g。表5中探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择
表4
表5
2、特异性验证
按照实施例的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的反应结果均为阴性。
3、最低检出限验证
按照实施例的方法进行最低检出限验证。实施例与对比例的最低检出限对比如下表6。
表6
检测目标 实施例 对比例
沙门氏菌 10拷贝/反应 50拷贝/反应
志贺氏菌 10拷贝/反应 50拷贝/反应
副溶血性弧菌 10拷贝/反应 100拷贝/反应
空肠弯曲菌 10拷贝/反应 100拷贝/反应
结肠弯曲菌 10拷贝/反应 100拷贝/反应
金黄色葡萄球菌 10拷贝/反应 100拷贝/反应
单核细胞增生性李斯特菌 10拷贝/反应 50拷贝/反应
小肠结肠炎耶尔森氏菌 10拷贝/反应 50拷贝/反应
阪崎肠杆菌 10拷贝/反应 50拷贝/反应
大肠埃希氏菌 10拷贝/反应 100拷贝/反应
霍乱弧菌 10拷贝/反应 50拷贝/反应
产志贺毒素大肠杆菌 10拷贝/反应 100拷贝/反应
气单胞菌属 10拷贝/反应 100拷贝/反应
弯曲菌属 10拷贝/反应 100拷贝/反应
弧菌属 10拷贝/反应 50拷贝/反应
产气荚膜梭菌 10拷贝/反应 50拷贝/反应
变形杆菌 10拷贝/反应 50拷贝/反应
蜡样芽孢杆菌 10拷贝/反应 100拷贝/反应
嗜水气单胞菌 10拷贝/反应 100拷贝/反应
副溶血性弧菌的大流行菌株 10拷贝/反应 100拷贝/反应
由上表可知，对于样本中痕量的食源性致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌和嗜水气单胞菌核酸和副溶血性弧菌的大流行菌株，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。
4、覆盖度验证
按照实施例的方法进行覆盖度验证。实施例与对比例的覆盖度对比如下表7。
表7
检测目标 实施例 对比例
沙门氏菌 10 10
志贺氏菌 10 10
副溶血性弧菌 10 9
空肠弯曲菌 10 9
结肠弯曲菌 10 9
金黄色葡萄球菌 10 8
单核细胞增生性李斯特菌 10 10
小肠结肠炎耶尔森氏菌 10 8
阪崎肠杆菌 10 7
大肠埃希氏菌 10 9
霍乱弧菌 10 9
产志贺毒素大肠杆菌 10 9
气单胞菌属 10 8
弯曲菌属 10 9
弧菌属 10 9
产气荚膜梭菌 10 10
变形杆菌 10 9
蜡样芽孢杆菌 10 8
嗜水气单胞菌 10 8
副溶血性弧菌的大流行菌株 10 8
由表7可知，本公开的试剂盒检测覆盖度远远大于对比例的检测覆盖度。
由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以一次性检测出包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株在内的19种食源性致病菌，探针特异性高，且最低检出限更低，覆盖度更广。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
<120> 用于检测食源性致病菌的核酸试剂、试剂盒及系统
<130> 11660ABT-R
<160> 129
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggggtcgt tctacattga ca 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tactgatcga taatgccaga cgaaa 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagtctttc gctgttgct 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccagaattt cgaggcggaa c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagcgccag tagtacctga 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatactcacc aatctgacgg aac 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acatactact tctttattgc ttgct 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgtgccatc caaaaacata atcac 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaatccta atggagcatc tttaac 26
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctactagcaa ataaactata tccccat 27
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcctgaagc aagtgcatt 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtttagcca agccttgacg a 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctagctcatt tcacatcgtc ca 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accagtgcat tctttagcgt a 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catcatggcc cttacgag 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aacgtattca ccgtagcatt 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgctttacta tcgccattga c 21
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cccttcgccg atgatcca 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttaccgacga aaacggcaag 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
accacggtga tatcgtcca 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgcaggacga taccaacaac 20
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgccgccact gaaccatg 18
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ataaatcgcc attcgttgac t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tctgtatttg ccgaaaacgt a 21
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggcytacaac aagatctcc 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttgaagctg tccttttgca 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agctaacgca ttaagtgtac cg 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atatcaagcc caggtaaggt tc 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
trggtaatgc acttcgccgt a 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttcrgcaacg cgaacagcya 20
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgacacagg ggaatcaca 19
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cctgcgctat caacgg 16
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cactccagta atccgtggtt c 21
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
actgtaccac ggcctga 17
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atggaacaaa agcaaatgca agaa 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tagatccaat atacatacca gggc 24
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aagcgttaat cggaattact ggg 23
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgcatttcac cgctacacct 20
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctgatgagat attgtttgtt gt 22
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tcagccattt agtacctgac 20
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ttaagcgcct atatgacag 19
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctgattttgt gaagaccgta 20
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gattcatggc tcagaacgaa c 21
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cgctttactc atcccgttg 19
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cagtaccgca ggaaacgttg 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ttcgataatg ataccggcgc tct 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
actgctgttt acaaacccwg gaa 23
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctaaggcaat gatagaagat ggattgt 27
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
atctgggctt taaatcctgg caattgg 27
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cagcataaat atacgctaag ccac 24
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tatttgccwg gtaacgcgag a 21
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
attactagcg attccgactt catgga 26
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tccgcctgam gtctgccgtc t 21
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ctctacacca cgcctgaac 19
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cttcccctga ggcagaagtg ctt 23
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
atgtcgcata gtggaacctc 20
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tcccaagtat caggtcatca aca 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ttaatcttgc gaccgtactc ccc 23
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tactcgtgca gaacgccttc gat 23
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
aacattagca ggatgatatg gagt 24
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cagagcgtgc aattgacaaa ccat 24
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acaggtrctt gaaggactag argcagtt 28
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ggctcaacct gggaattgca ttta 24
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
agctccggtc aatgtaaagg tctc 24
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
atacgatggc tgctctttct g 21
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ctttcrcgcr cgacttgcat 20
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
tggttgattt cctgatcgca ct 22
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ttaacagtac cgcaggaaac gt 22
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
atgtatatcy cgtttatcsg tagaag 26
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
catattttcr ataatcgaay cgcct 25
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
accaacaaag cggcaac 17
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
acgccaaaca aactcgtg 18
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tcgtgcagat atggatgctt 20
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acaatccatc ttctatcatt gcctt 25
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cctatagaaa tggcatcgtt cat 23
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
attcttccat tacatttgaa acaggt 26
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
agctcagcaa atgcatcaca aa 22
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cgtatcacca tcaatcgctt 20
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tatttgccwg gtaacgmgag a 21
<210> 80
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tactatattt cggataaagy gtrgtg 26
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gcggaccaca taaagtctgt 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ccgggaacgt attcaccgta 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gtatgatycg acccgctgct 20
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tttctcccag gcgtaccc 18
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
tgtcgcgcaa gactgtaacc a 21
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
agttcaacgc tgacatcacc 20
<210> 87
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
acagcagaat cgctactca 19
<210> 88
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
ccgaagagtc gatgataaaa tccgta 26
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
ataagtcgcc atacgttgac t 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tcagtatttg cggaaatcgt a 21
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
agaacttcgg yctgagcg 18
<210> 92
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
ttgaaggcgg agaggct 17
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
cgtgcctaat acatgcaagt cgaa 24
<210> 94
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
tgtgtagggc agattaacta tacctt 26
<210> 95
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gtggctttgg tcayactc 18
<210> 96
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gcagaacgcc ttcgat 16
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
agatatgaat ggcaaagagg aaac 24
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gctatcaacg gcagtaacat tag 23
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
ctggcgttga aatgttccgy a 21
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
cagtacytgw ccacgttcga t 21
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tckaaagatc cmgcaattag tga 23
<210> 102
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
ccrtaataat tgtacgmact tcatca 26
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
atgcgttaat ccgatttact ggg 23
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
cgcatatcac ggctagacct 20
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
ccgatgagac atcgttagta gt 22
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
acatccatgg agtacatgac 20
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
tcaggcgact agatcacag 19
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
ttgatcgtgt gatgtcccta 20
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
accccataaa caccaatatc g 21
<210> 110
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
attaccamcg cactgggat 19
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
acgataggaa gtaacgaaag ccgta 25
<210> 112
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
atgtccatca tgaccraag 19
<210> 113
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
gagactttat ccgatgacta atggtgct 28
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
attacataaa gaacctgcga catt 24
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
accagtgcat tctttagcgt a 21
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
actccatgaa gtcggaatcg cta 23
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
acagcccggc cacatgaaag atat 24
<210> 118
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
accactgcca gtcaaca 17
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
cacccacaaa gctcggtcga ac 22
<210> 120
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
atgtcccaag tgcaacctc 19
<210> 121
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
tggagccgtt gcct 14
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
tcacccgtgc gccacaatcc a 21
<210> 123
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gacgaaagca aaatacggcg aagtgca 27
<210> 124
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
gctacattct atcttggaga ggct 24
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
acgttctcac cngcacgacc ttc 23
<210> 126
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
cttgtttgcn gatccaccsg caga 24
<210> 127
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
ggctcatcct gggaatcgca tata 24
<210> 128
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
cgctcaggtc agtgcatagc tctc 24
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
atacgatggc tgctctttct g 21

Claims (9)

1.一种用于检测食源性致病菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-42所示的引物和SEQ ID NO.45-65所示的探针。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-42所示的引物的含量各自为0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.5-0.6μM、0.8-0.1μM、0.5-0.6μM、0.6-1.0μM、0.5-0.6μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-0.8μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM和0.4-0.5μM，分别由SEQID NO.45-65所示的探针的含量各自独立地为0.1-0.3μM。
3.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂还包括阳性内质控；所述的阳性内质控含有SEQ ID NO.43-44所示的引物、SEQ ID NO.66所示的探针和pET28a质粒。
4.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-12,43-44所示的引物和SEQ ID NO.45-50,66所示的探针；B管含有SEQ IDNO.13-24,43-44所示的引物和SEQ ID NO.51-56,66所示的探针；C管含有SEQ ID NO.25-36,43-44所示的引物和SEQ ID NO.57-62,66所示的探针；D管含有SEQ ID NO.37-42,43-44所示的引物和SEQ ID NO.63-65,66所示的探针。
5.根据权利要求4所述的核酸试剂，其中，SEQ ID NO.45-47,51-53,57-59,63所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.48-49,54-55,60-61,64-65所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.50,56,62,66所示的探针具有第三荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记、TAMRA荧光标和ROX荧光标记中的一种。
6.一种用于检测食源性致病菌的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、氯化镁、DNA聚合酶、dNTP和水中的至少一种。
7.权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测食源性致病菌的试剂盒中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述食源性致病菌包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、产志贺毒素大肠杆菌、气单胞菌属、弯曲菌属、弧菌属、产气荚膜梭菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的大流行菌株。
9.一种用于检测食源性致病菌的系统，该系统包括采样器，具有A管检测器、B管检测器、C管检测器、和D管检测器的PCR仪，计算装置以及输出装置，所述采样器为容纳食源性致病菌症状的样本或核酸的容器，所述检测器为装载有权利要求5所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道标记、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道、TAMRA荧光通道和ROX荧光通道中的一种，所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若A管第一荧光通道有Tm值为58.6℃对应的溶解峰曲线判定为沙门氏菌阳性；A管第一荧光通道有Tm值为62.1℃对应的溶解峰曲线判定为志贺氏菌阳性；A管第一荧光通道有Tm值为65.4℃对应的溶解峰曲线判定为副溶血性弧菌阳性；A管第二荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为空肠弯曲菌阳性；A管第二荧光通道有Tm值为64.5℃对应的溶解峰曲线判定为结肠弯曲菌阳性；A管第三荧光通道有Tm值为57.8℃对应的溶解峰曲线判定为金黄色葡萄球菌阳性；A管第三荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；B管第一荧光通道有Tm值为58℃对应的溶解峰曲线判定为单核细胞增生性李斯特氏菌阳性；B管第一荧光通道有Tm值为61.2℃对应的溶解峰曲线判定为小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性；B管第一荧光通道有Tm值为64.9℃对应的溶解峰曲线判定为阪崎肠杆菌阳性；B管第二荧光通道有Tm值为57.7℃对应的溶解峰曲线判定为大肠埃希氏菌阳性；B管第二荧光通道有Tm值为63.5℃对应的溶解峰曲线判定为霍乱弧菌阳性；B管第三荧光通道有Tm值为57.4℃对应的溶解峰曲线判定为产志贺毒素的大肠杆菌阳性；B管第三荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；C管第一荧光通道有Tm值为57.3℃对应的溶解峰曲线判定为气单胞菌属阳性；C管第一荧光通道有Tm值为61.6℃对应的溶解峰曲线判定为弯曲菌属阳性；C管第一荧光通道有Tm值为64.9℃对应的溶解峰曲线判定为弧菌属阳性；C管第二荧光通道有Tm值为57.4℃对应的溶解峰曲线判定为产气荚膜梭菌阳性；C管第二荧光通道有Tm值为62.6℃对应的溶解峰曲线判定为变形杆菌阳性；C管第三荧光通道有Tm值为63.9℃对应的溶解峰曲线判定为蜡样芽孢杆菌阳性；C管第三荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为IAC阳性，用于质控样本提取、检测质量；D管第一荧光通道有Tm值为62.6℃对应的溶解峰曲线判定为嗜水气单胞菌阳性；D管第二荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为副溶血性弧菌大流行菌株；A管第三荧光通道、B管第三荧光通道、C管第三荧光通道和D管第三荧光通道分别有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控阳性。
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