CN101177714A - 添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种生物技术领域用于食品安全的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法。包括以下步骤：人工合成一段扩增内标序列，设计对应的特异引物；通过对MgCl₂浓度和退火温度Tm值进行优化选择；进行PCR检测、对照，选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度；确定引物的特异性及扩增内标在非单核细胞增生李斯特菌样品检测中是否能够正常扩增；通过抗干扰实验判断PCR检测体系的稳定性，通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性，以此来评价建立的PCR检测体系的检测结果是否准确。本发明提高PCR检测的准确率，为满足检疫执法过程中所急需的对食源性致病菌调查和检测提供有效可靠的技术手段。

Description

添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的检测方法，具体地说是一种用于食品安全的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法。

背景技术

PCR，英文polymerase chain reaction的缩写，是指：聚合酶链式反应。单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种重要的食源性致病菌，为革兰氏阳性杆菌，广泛分布于自然界，并可在低温下(4-8℃)生长，单核细胞增生李斯特菌主要是通过食品(特别是动物性食品)传播、感染人体。与其它食源性致病菌例如沙门氏菌引起的疾病相比，食源性李斯特菌病是一种十分严重的疾病，其死亡率高达20-30％，被WHO食品安全工作计划列为重点检测的四大食源性致病菌(沙门氏菌、大肠杆菌0157：H7、副溶血弧菌和单核细胞增生李斯特菌)之一。我国食源性疾病监控网络数据显示，近年来单核细胞增生李斯特菌中毒的发生规模和单核细胞增生李斯特菌人群暴露规模呈明显上升趋势，严重地阻碍着经济的发展和影响人民的健康。因此，通过发展快速的检测技术来解决食品安全问题是国家的迫切需求。我国目前对食品中单核细胞增生李斯特菌的国标检验方法还是采用一些传统培养方法，这些方法存在操作过程复杂、检测时间长、很难及时得到检测结果等诸多缺陷，已不能满足食品生产与消费中对致病菌快速检测的需要。

在1990年，Bessesen MT等人率先以单核细胞增生李斯特菌带有的编码溶血素O基因(Hemolytic factor gene，简称hly基因)设计引物，用于单核细胞增生李斯特菌的PCR检测，详见：Bessesen MT，Luo QA，Rotbart HA，et al.“Detection of Listeria monocytogenes by using the polymerase chain reaction”.Applied and Environmental Microbiology.1990，56(9)：2930-2932.(Bessesen MT，Luo QA，Rotbart HA，et al，等.“运用PCR方法检测单核细胞增生李斯特菌”，应用与环境微生物学，1990，56(9)：2930-2932页)。此后，针对单核细胞增生李斯特菌的PCR检测技术开始广泛应用，用于检测的基因不断的增多，设计的引物也日益多样。

目前，PCR方法在不同的实验室或检测部门所检测的目的基因和操作流程有一定的差异，没有形成标准，得到的检测结果也不尽相同。近年来的实践应用表明，食品和培养基中存在的抑制剂可影响PCR反应，使检测结果呈假阴性。尽管PCR方法在不断的改进和完善，却不能有效地阻止假阴性结果的发生。

有些学者开始认识到在PCR反应体系放置指示假阴性的扩增内标(internalamplification control，IAC)是必要的。在2003年，Malorny等人利用分子克隆的方法，人工构建的一条157bp的扩增内标片段，并在试验结果中能够指示出假阴性的发生。详见：Malomy B，Hoorfar J，Bunge C，et al.Multicenter Validationof the analytical accuracy of Salmonella PCR：toward an international standard.Applied and environment microbiology.2003，69(1)：290-296.(Malomy B，Hoorfar J，Bunge C，等.多渠道确证沙门氏菌PCR检测的正确性：期望形成一项国际标准.应用与环境微生物.2003，69(1)：290-296.)。

2005年Rodríguez-Lázaro D等首次将扩增内标运用于单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR检测，详见：Rodríguez-Lázaro D，Pla M，Scortti M，et al.“A novel real-time PCR for Listeria monocytogenes that monitors analytical performance via an internal amplification control”.Applied andEnvironmental Microbiology.2005，71(12)：9008-9012.(Rodríguez-LázaroD，Pla M，Scortti M，等.“一种含扩增内标的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测方法”，应用与环境微生物学，2005，71(12)：9008-9012页)。但是荧光定量方法对仪器设备要求很高，需另外设计荧光探针，并且试验试剂及探针成本昂贵，不利于普及运用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种添有扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法。本发明利用生物信息技术的方法，重新根据hly基因设计特异性检测引物，同时人工合成了一段扩增内标序列用于单核细胞增生李斯特菌的普通PCR检测，在确保检测准确性与高效性的同时大大降低检测成本，进一步推动单核细胞增生李斯特菌的PCR检测技术成为国家标准。

本发明通过以下技术方案实现，本发明具体步骤如下：

(1)构建扩增内标，即人工合成一段扩增内标序列，设计对应的特异引物；

(2)通过对MgCl₂浓度和退火温度Tm值进行优化选择，使PCR反应体系处于最优的反应条件；

所述的对MgCl₂浓度和退火温度Tm值进行优化选择，具体为：根据引物设计时推荐的Tm值，在Tm±5℃范围内以1℃间隔设置温度梯度，根据扩增产物在电泳图中的亮度来选择退火温度，在确定退火温度后，在反应体系中设置一系列的Mg²⁺浓度的梯度，从1.0mmol/L到3.0mmol/L，间隔0.5mmol/L，同样根据扩增产物在电泳图中的亮度来选择PCR反应体系的Mg²⁺浓度。

(3)首先经过测定的单核细胞增生李斯特菌总DNA溶液用无菌水作10倍梯度稀释至10^-8，以稀释的DNA溶液为模板，分别取5μL加入PCR反应体系，进行PCR检测，同时以金黄色葡萄球菌标准株DNA模板作阴性对照，以无菌水代替DNA模板作空白对照，确定PCR的检测灵敏度；然后，取带有扩增内标的载体，添加到PCR反应体系中：通过向反应体系中添加不同稀释浓度的扩增内标，检测DNA或菌株的灵敏度，选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度；

(4)提取不同血清型的单核细胞增生李斯特菌和不同种属的非单核细胞增生李斯特菌菌株的DNA，进行PCR检测，确定引物的特异性及扩增内标在非单核细胞增生李斯特菌样品检测中是否能够正常扩增；

(5)通过抗干扰实验和人工污染实验对所建立的PCR反应体系进行评价：通过抗干扰实验判断PCR检测体系的稳定性；通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性，以此来评价建立的PCR检测体系的检测结果是否准确。

所述的抗干扰实验，其检测方法为：

将金黄色葡萄球菌(S.aureus)、沙门氏菌(S.choleraesuis)、和大肠杆菌(E.coli)作为干扰菌株，提取它们的DNA加入到单核细胞增生李斯特菌PCR检测体系中，以检测对单核细胞增生李斯特菌检测灵敏度的影响。

所述的人工污染样品，其检测方法为：

(1)取单核细胞增生李斯特菌CMCC54002菌液1ml接入100ml UVM改良李斯特菌增菌液，设空白对照；

(2)采集40份鸡肉样品，无菌取样品25g(mL)放入灭菌均质杯或均质袋中，加225mL UVM改良李斯特菌增菌液，充分均质。在37℃的摇床中增菌培养，并且在增菌8h后取样；

(3)每份样品取样1mL，放入1.5mL离心管中，12000r/min离心1min，收集单核细胞增生李斯特菌菌体；

(4)用无菌双蒸水洗涤一次，12000r/min离心1min；然后加入100μL无菌超纯水重悬菌体，在沸水浴中煮10min；从沸水浴中取出后，立即在-20℃放置10min；

(5)解冻后，12000r/min离心5min，上清液为PCR模板DNA溶液，分别取5μL加入PCR反应体系，进行PCR检测，同时以金黄色葡萄球菌标准株DNA模板作阴性对照，以无菌水代替DNA模板作空白对照。

所述的扩增内标DNA序列是人工合成的，在确保扩增效率的同时与单核细胞增生李斯特菌及其它细菌的基因组非同源。在此DNA序列的两端分别含有检测引物的序列。其用途是显示假阴性的发生，提高PCR检测的准确率。

所述的扩增内标，是指：人工设计合成扩增内标，减少了非单核细胞增生李斯特菌(绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌、格氏李斯特菌、墨氏李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌等)的DNA对PCR检测的干扰，同时也避免了扩增内标对目的基因的同源交联干扰。降低扩增内标对目的基因在检测过程中的干扰，增加检测的准确率。

所述的扩增内标的构建方法，具体如下：采用序列分析、基因比对的手段选择用于构建单核细胞增生李斯特菌PCR检测的扩增内标的特异基因序列，并与检测的目的基因的同源性极低；将所设计的扩增内标序列人工合成，并克隆到载体中；采用转基因方法转移上述带有扩增内标的载体到大肠杆菌(E.coli 5α)中，然后涂布于选择性平板(90mm培养皿，100mg/ml氨苄青霉素10μl，20％的IPTG溶液7μl，2％的X-gal溶液40μl)上，37℃培养12h。用灭菌的牙签从选择性平板上挑取白色菌落，接菌到装有5ml LB培养液的PA瓶中，再在37℃下以150r/min培养8h，提取质粒pMD-hlys的DNA，经PCR扩增后，确定获得转化子。

所述的载体，其转化的宿主细胞，在实例中它是大肠杆菌，其中包含有扩增内标的DNA片段。

所述的特异引物，是指：一对用于单核细胞增生李斯特菌的PCR检测的检测引物(hlysF/sR)，进行PCR检测时，其能扩增到单核细胞增生李斯特菌种菌株特有的检测基因，或者是PCR体系中添加的扩增内标。

所述的一段用于构建扩增内标的DNA序列，此序列是人工设计合成的。

所述的目的基因，是指：单核细胞增生李斯特菌的hly基因。

所述的假阴性，是指PCR反应受到了食品或培养基等物质中存在的抑制剂的影响而没有发生反应，或者是由于操作人员的操作失误导致结果呈现阴性。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。将用于作为扩增内标的基因序列可操作地连于表达调控序列，从而带有扩增内标的载体。

本发明的PCR检测方法是在普通PCR方法的基础上添加了一条扩增内标的片段，采用生物信息技术的方法，在同一PCR扩增过程中，可以用同一检测引物与目的基因同时进行扩增。当样品中含有单核细胞增生李斯特菌的DNA含量高于检测灵敏度时，电泳结果中含有目的基因的扩增片段，检测结果呈阳性；当样品中不含或者低于检测灵敏度时，电泳结果中只含有扩增内标的扩增片段，检测结果为阴性；当电泳结果中不含有任何扩增片段时，检测结果即为假阴性。该方法有助于PCR检测体系能够显示假阴性的发生，避免了因样品中存在的抑制剂或操作失误所导致检测结果呈现假阴性而作出的结果误判，从而提高PCR检测的准确率，为满足检疫执法过程中所急需的对食源性致病菌调查和检测提供有效可靠的技术手段。

附图说明

图1未添加IAC时单核细胞增生李斯特菌检测的灵敏度示意图

图中：电泳泳道1～7：每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为7.30ng/μL，730pg/μL，73.0pg/μL，7.30pg/μL，730fg/μL，73.0fg/μL，7.30fg/μL；电泳泳道8：阴性对照(金黄色葡萄球菌标准株DNA)，电泳泳道9：空白对照(dH₂O)。M：100bp DNA分子量标准。

图2添加IAC8.02×10⁴拷贝时单核细胞增生李斯特菌检测灵敏度示意图

图中：电泳泳道1～7：每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为7.30ng/μL，730pg/μL，73.0pg/μL，7.30pg/μL，730fg/μL，73.0fg/μL，7.30fg/μL；电泳泳道8：阴性对照(金黄色葡萄球菌标准株DNA)，电泳泳道9：空白对照(dH₂O)。M：100bp DNA分子量标准。

图3单核细胞增生李斯特菌菌落灵敏度的检测示意图

图中：电泳泳道1～6：每个PCR反应中所含有的单核细胞增生李斯特菌的菌落数依次为1.16×10⁶cfu/μL，1.16×10⁵cfu/μL，1.16×10⁴cfu/μL，1.16×10³cfu/μL，116cfu/μL，11.6cfu/μL；电泳泳道7：阴性对照(金黄色葡萄球菌标准株DNA)，电泳泳道8：空白对照(dH₂O)。M：100bp DNA分子量标准。

图4单核细胞增生李斯特菌抗干扰实验示意图

图中：电泳泳道1～7：每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为7.30ng/μL，730pg/μL，73.0pg/μL，7.30pg/μL，730fg/μL，73.0fg/μL，7.30fg/μL；电泳泳道8：阴性对照(金黄色葡萄球菌标准株DNA)，电泳泳道9：空白对照(dH₂O)。M：100bp DNA分子量标准。

具体实施方式

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

一、检测体系初步建立

1.选取检测的目的基因

利用生物信息学对单核细胞增生李斯特菌的已知特异基因进行分析，从中选出用于检测的目的基因hly。通过Genbank中公用的BLAST软件(为现有技术，共用免费)，将hly基因的序列与其他微生物进行比对，选出特异性较高的序列区段。然后用软件Primer 5.0(为现有技术，市售，Premier公司，加拿大)在这段特异序列中设计一对内标引物。引物序列如下：

hlysF：5’-TATCCAGGTGCTCTCGT-3’

hlysR：5’-ACTGTAAGCCATTTCGTC-3’

(a)检测目的基因的序列特征：

*长度：264碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线形

(b)分子类型：DNA

(c)最初来源：单核细胞增生李斯特菌

(d)序列描述：SEQ ID NO.1：

TATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCCAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGT

序列中下划线部分的字母代表引物hlysF和hlysR的位置。

2.PCR反应体系的优化

通过对退火温度和Mg²⁺浓度的优化，确定的反应体系如下：

10×buffer            2.5μl

MgCl₂溶液(25mM)       1.5μl

dNTP(2.5mM)           1.0μl

上下游引物(各10μM)   0.5μl+0.5μl

Taq DNA聚合酶(1U/μl) 1μl

模板                  5.0μl

                                               

补无菌水至            25μl

PCR循环参数为：在95℃预变性3min，接着作35个循环，每个循环的程序包括95℃变性30s，退火温度56℃，退火时间为30s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸10min，最后降温至4℃，结束所有操作程序。

二、扩增内标的制备

1.  选取用于制备扩增内标的基因序列

所述的构建扩增内标，是指：人工设计合成的一段扩增内标序列，减少了非单核细胞增生李斯特菌(绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌、格氏李斯特菌、墨氏李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌等)的DNA对PCR检测的干扰，同时也避免了扩增内标对目的基因的同源交联干扰。使扩增内标降低对目的基因在检测过程中的干扰，增加检测的准确率。

(a)构建扩增内标的基因序列特征：

*长度：184碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线形

(b)分子类型：DNA

(c)最初来源：人工合成

(d)序列描述：SEQ ID NO.2：

TATCCAGGTGCTCTCGTCGACGACAAGACCATCACCAATTCACAGCAGAAGCCACAGCATGGCACCACCAGCATCTATAGGAGCACTCGCCGCCCACATCATCGAAAAGAAACACGCGGATGTAAACTGGACCACGGTGACTGCGAGCGAATTACTATTTGAATTCGACGAAATGGCTTACAGT

序列中下划线部分的字母代表引物hlysF和hlysR的位置，扩增序列长度184bp。

2.连接

按PCR回收Kit说明书回收扩增产物片段。回收的扩增产物片段与pMD18-T载体在Ligation Solution I作用下16℃过夜。

3.转化大肠杆菌

用氯化钙法转化大肠杆菌，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆。

4.检测

利用特异引物(hlysF和hlysR)对筛选的大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测，并对PCR检测所确定的大肠杆菌阳性克隆抽取质粒pMD-hlys的DNA进一步进行测序验证。

三、模板DNA的灵敏度测定

1.  扩增内标及单核细胞增生李斯特菌纯培养总DNA的定量测定

纯化的扩增内标和单核细胞增生李斯特菌纯培养的总DNA，经DU-800紫外分光光度计(Beckman Coulter)测量，其含量分别为24.9ng/μL和36.5ng/μL。根据计算公式N copies/μL＝PCR片段的质量(g/μL)/(660g/mol×碱基数)×(6.023×10²³)可以得到1μL扩增内标的拷贝数为8.02×10⁹。

2.未添加扩增内标时的检测灵敏度

将上述经过测定的单核细胞增生李斯特菌总DNA溶液用无菌水作10倍梯度稀释，从36.5ng/μL-36.5fg/μLDNA溶液中分别取5μL加入PCR反应体系，使每个PCR反应体系(25μL)分别含DNA为：7.30ng/μL，730pg/μL，73.0pg/μL，7.30pg/μL，730fg/μL，73.0fg/μL，7.30fg/μL。扩增结果如图1所示，只是含7.64fg/μL DNA的PCR反应体系没有目标序列扩增带，而其他PCR反应体系均有目标序列扩增带。因此，其检测灵敏度为73.0fg/μL(如图1所示)。

3.添加扩增内标后的检测灵敏度

纯化的扩增内标先用无菌水作10倍梯度稀释，从8.02×10⁶拷贝/μL-802拷贝/μL。然后在上述的PCR检测体系中分别加入扩增内标，研究扩增内标对灵敏度的影响。当PCR反应体系添加扩增内标的量为8.02×10⁴拷贝时，其检测灵敏度仍然为73.0fg/μL，且扩增内标的扩增产物条带清晰(如图2所示)。当PCR反应体系添加扩增内标的量小于8.02×10⁴拷贝时，由于扩增内标的扩增产物的荧光强度较弱，达不到指示假阴性结果的目的而没有采用。因此，添加8.02×10⁴拷贝的扩增内标对上述PCR检测体系的灵敏度几乎没有影响，在本实施例建立的PCR检测体系中则采用8.02×10⁴拷贝的扩增内标。

4.菌落灵敏度的检测

从试管斜面或平板上，挑取单核细胞增生李斯特菌接入UVM改良李斯特菌增菌液中，经8小时增菌之后，用生理盐水作10倍梯度稀释，共稀释了9个梯度，同时用平板计数法计算副溶血弧菌的菌落浓度。经计算，APW液体培养基中单核细胞增生李斯特菌的菌落浓度为5.8×10⁸cfu/mL。经PCR扩增之后，每个PCR反应体系(25μL)中可检测到的菌落灵敏度为116cfu/μL(如图3所示)。

四、特异性检测

采用本实施例建立的PCR检测体系对6株单核细胞增生李斯特菌和66株非单核细胞增生李斯特菌分别进行扩增检测，发现以单核细胞增生李斯特菌DNA为模板皆能扩增出264bp的目标序列特异产物和184bp的扩增内标产物，而以非单核细胞增生李斯特菌基因组DNA为模板时只能扩增出184bp的扩增内标产物。

五、PCR检测体系评价

1.抗干扰实验

将金黄色葡萄球菌(S.aureus)、沙门氏菌(S.choleraesuis)、和大肠杆菌(E.coli)作为干扰菌株，提取它们的DNA加入到单核细胞增生李斯特菌PCR检测体系中(每个PCR反应体系分别含单核细胞增生李斯特菌DNA为：7.30ng/μL，730pg/μL，73.0pg/μL，7.30pg/μL，730fg/μL，73.0fg/μL，7.30fg/μL)，实验结果表明，在金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌、和大肠杆菌的干扰下，单核细胞增生李斯特菌DNA检测灵敏度不受影响，仍为73.0fg/μL(如图4所示)，具有良好的稳定性。

2.人工污染样品的检测

取单核细胞增生李斯特菌CMCC54002菌液1ml接入100mlUVM改良李斯特菌增菌液，设空白对照；采集40份鸡肉样品，无菌取样品25g(mL)放入灭菌均质杯或均质袋中，加225mLUVM改良李斯特菌增菌液，充分均质。在37℃的摇床中增菌培养，并且在增菌8h后取样。提取单核细胞增生李斯特菌DNA进行PCR检测，检测结果中有38份为阳性，2份假阴性(没有目标序列和扩增内标的扩增产物)，阴性对照与空白对照仅有扩增内标的扩增产物无目标序列扩增产物。出现假阴性的样品经过重新纯化DNA后，再次进行检测，假阴性样品均显示为阳性结果。这说明从这2份假阴性样品中提取得到的模板DNA溶液中存在干扰因子，本实施例建立的检测体系在进行大量样品检测时确实能够指示假阴性，有助于提高检测的准确率。

Claims (8)

1.一种添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)人工合成一段扩增内标序列，设计对应的特异引物；

(2)通过对MgCl₂浓度和退火温度Tm值进行优化选择；

(3)首先经过测定的单核细胞增生李斯特菌总DNA溶液用无菌水作10倍梯度稀释至10^-8，以稀释的DNA溶液为模板，进行PCR检测，同时以金黄色葡萄球菌标准株DNA模板作阴性对照，以无菌水代替DNA模板作空白对照，

然后，取带有扩增内标的载体，检测DNA或菌株的灵敏度，选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度；

(4)提取不同血清型的单核细胞增生李斯特菌和不同种属的非单核细胞增生李斯特菌菌株的DNA，进行PCR检测，确定引物的特异性及扩增内标在非单核细胞增生李斯特菌样品检测中是否能够正常扩增；

(5)通过抗干扰实验和人工污染实验对所建立的PCR反应体系进行评价：通过抗干扰实验判断PCR检测体系的稳定性，通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性，以此来评价建立的PCR检测体系的检测结果是否准确。

2.如权利要求1所述的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法，其特征是，步骤(2)中所述的对MgCl₂浓度和退火温度Tm值进行优化选择，具体为：根据引物设计时推荐的Tm值，在Tm±5℃范围内以1℃间隔设置温度梯度，根据扩增产物在电泳图中的亮度来选择退火温度，在确定退火温度后，在反应体系中设置一系列的Mg²⁺浓度的梯度，从1.0mmol/L到3.0mmol/L，间隔0.5mmol/L，同样根据扩增产物在电泳图中的亮度来选择PCR反应体系的Mg²⁺浓度。

3.如权利要求1所述的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法，其特征是，步骤(4)中所述的抗干扰实验，其检测方法为：将金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、和大肠杆菌作为干扰菌株，提取它们的DNA加入到单核细胞增生李斯特菌PCR检测体系中，以检测对单核细胞增生李斯特菌检测灵敏度的影响。

4.如权利要求1所述的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法，其特征是，步骤(5)中所述的人工污染样品，其检测方法为：

(1)取单核细胞增生李斯特菌CMCC54002菌液1ml接入100ml UVM改良李斯特菌增菌液，设空白对照；

(2)采集40份鸡肉样品，无菌取样品25g放入灭菌均质杯或均质袋中，加225mL UVM改良李斯特菌增菌液，充分均质。在37℃的摇床中增菌培养，并且在增菌8h后取样；

(3)每份样品取样1mL，放入1.5mL离心管中，12000r/min离心1min，收集单核细胞增生李斯特菌菌体；

(4)用无菌双蒸水洗涤一次，12000r/min离心1min；然后加入100μL无菌超纯水重悬菌体，在沸水浴中煮10min；从沸水浴中取出后，立即在-20℃放置10min；

(5)解冻后，12000r/min离心5min，上清液为PCR模板DNA溶液，分别取5μL加入PCR反应体系，进行PCR检测，同时以金黄色葡萄球菌标准株DNA模板作阴性对照，以无菌水代替DNA模板作空白对照。

5.如权利要求1所述的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法，其特征是，所述的扩增内标，是指：人工设计合成扩增内标，减少了非单核细胞增生李斯特菌的DNA对PCR检测的干扰，同时也避免了扩增内标对目的基因的同源交联干扰。

6.如权利要求1或者5所述的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法，其特征是，所述的扩增内标的构建方法，具体如下：采用序列分析、基因比对的手段选择用于构建单核细胞增生李斯特菌PCR检测的扩增内标的特异基因序列，并与检测的目的基因的同源性极低；将所设计的扩增内标序列人工合成，并克隆到载体中；采用转基因方法转移上述带有扩增内标的载体到大肠杆菌中，然后涂布于选择性平板上，37℃培养12h，用灭菌的牙签从选择性平板上挑取白色菌落，接菌到装有5ml LB培养液的PA瓶中，再在37℃下以150r/min培养8h，提取质粒pMD-hlys的DNA，经PCR扩增后，确定获得转化子。

7.如权利要求1或者5所述的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法，其特征是，所述的扩增内标，DNA序列是人工合成的，DNA序列的两端分别含有检测引物的序列。

8.如权利要求1所述的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法，其特征是，所述的假阴性，是指PCR反应受到了食品或培养基等物质中存在的抑制剂的影响而没有发生反应，或者是由于操作人员的操作失误导致结果呈现阴性。

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