CN103571961B - 克罗诺杆菌检测方法、引物对、目标、内标探针和试剂盒 - Google Patents

克罗诺杆菌检测方法、引物对、目标、内标探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）的检测方法、引物对、目标探针、内标探针和试剂盒。检测方法：1）PCR反应体系中，加入待检样品的DNA、引物对（序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）、目标探针（序列如SEQ ID NO.3）、内标探针（序列如SEQ ID NO.4）和内标模板（序列如SEQ ID NO.5），进行荧光定量PCR扩增；2）收集PCR反应过程中荧光信号。该检测方法检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，且能够很好的避免假阴性结果的发生，结果判定简单。

Description

克罗诺杆菌检测方法、引物对、目标、内标探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及检测阪崎克罗诺杆菌的检测方法、引物对、目标探针、内标探针和试剂盒。
背景技术
阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)又名阪崎肠杆菌，隶属于克罗诺杆菌属，是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌。经临床研究发现阪崎克罗诺杆菌是克罗诺杆菌属临床感染病例中最常见的条件致病菌。阪崎克罗诺杆菌菌株能够引起婴儿致命的感染，致死率高达40%-80%。它通常能导致婴儿严重的临床症状，例如脑脓疡，脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和全身性败血症。曾经有在婴儿配方粉中分离到阪崎克罗诺杆菌菌株的报道。阪崎克罗诺杆菌菌株是通过配方粉危害婴幼儿健康的重要条件性致病菌。新生婴儿或早产儿都存在通过食用污染有阪崎克罗诺杆菌进驻的婴儿配方粉而感染阪崎克罗诺杆菌菌株的风险。在污染环节调查中发现，整个婴幼儿配方粉生产工艺流程中，可检测到阪崎克罗诺杆菌的污染点占到全部取样点的31%。因此，对阪崎克罗诺杆菌菌株快速鉴定与鉴别是实现有效控制的基础。该菌在1980年被首次命名和定义后，又于2008年由一个种被重新分为克罗诺杆菌新属(Cronobacter spp.)，属下分为5个新种(其中Cronobacter sakazakii称为新组合)、1个克罗诺杆菌基因种(Genomospeciese)和3个新亚种。2012年克罗诺杆菌属经多序列比对等进一步鉴定发现，最终确定将该属分为7个种。
尽管该菌的分类和名称已变，但目前检测仍然沿用程序式的阪崎肠杆菌标准检测方法，以传统生化反应进行鉴定，需要18-24h，而且无法区分为哪一种，这显然已经不能满足对阪崎克罗诺杆菌菌株检测的需求。目前常用的API20E试剂条在鉴定阪崎克罗诺杆菌方面也存在一定的局限性（假阴性）。另外，目前常用的普通PCR方法存在一定的假阳性和假阴性的现象。
尽管已有扩增片段长度多态性分析(Amplified fragment lengthpolymorphismas,AFLP)、16S rRNA全序列比较、DNA-DNA杂交实验和多位点测序等多种可靠方法，但这些根据遗传特征的分析方法耗时长、工作量大。目前并没有对阪崎克罗诺杆菌菌株的高效率的鉴定与定量方法，该现象极大的制约了阪崎克罗诺杆菌菌株定性与定量检测的发展，该现象亟待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有传统技术检测时间长、普通PCR检测方法产生假阳性和假阴性，以及遗传特征的分析方法耗时长、工作量大的缺陷，提供一种检测阪崎克罗诺杆菌的检测方法、引物对、目标探针、内标探针和试剂盒。采用本发明的检测方法检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，且能够很好的避免假阴性结果的发生，结果判定简单。
本发明的目的之一在于，提供一种阪崎克罗诺杆菌的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：
（1）在PCR反应体系中，加入从待检样品中提取的DNA、检测阪崎克罗诺杆菌的引物对、目标探针、内标探针和内标模板，进行荧光定量PCR扩增；
所述的检测阪崎克罗诺杆菌的引物对中，一条引物的序列如SEQ IDNO.1所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述的目标探针的序列如SEQ ID NO.3所述，所述的内标探针的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的内标模板的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的目标探针的5′端标记有荧光基团FAM，所述的目标探针的3′端标记有荧光基团BHQ1；所述的内标探针的5′端标记有荧光基团HEX，所述的内标探针的3′端标记有荧光基团BHQ1；
（2）利用荧光定量PCR仪实时跟踪收集PCR反应过程中FAM和HEX的荧光信号，即可。
以下针对上述步骤做进一步说明：
步骤（1）中，所述的待检样品为食品，较佳的为奶粉、米粉、肉泥和肉松。根据本领域常识，所述的待检样品在检测前需要预处理。所述的预处理的方法较佳的为：将所述的食品预增菌，再提取DNA，即可；其中，所述的预增菌的方法较佳的为：将所述的食品添加到缓冲蛋白胨水（bufferpeptone water，BPW，pH8.0）增菌培养基（成分包括：蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、十二水合磷酸氢二钠9.0g、磷酸二氢钾1.5g、蒸馏水1000mL，pH7.2±0.2；制备方法为：将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121℃，15min），在36-38℃中增菌16-24h，即可；其中，所述的增菌的时间较佳的为18h；所述的提取DNA的方法较佳的为：用煮沸法提取DNA，再在12000rpm速度下离心5min，取上清液，即得到待检样品的DNA；所述的煮沸法较佳的为在99-101℃条件下水浴10-20min，即可。
步骤（1）中，所述的待见样品的DNA较佳的为待见样品的基因组DNA。所述的待检样品的DNA的浓度较佳的为10-250ng/μL，更佳的为10-100ng/μL，进一步更佳的为20ng/μL或50ng/μL。
步骤（1）中，所述的目标探针的浓度较佳的为100-500nM，更佳的为200-300nM。
步骤（1）中，所述的内标探针的浓度较佳的为200-600nM，更佳的为200-300nM。
步骤（1）中，所述的内标模板的浓度较佳的为20-400copies/μL，更佳的为400copies/μL。
步骤（1）中，所述的引物的浓度较佳的为200-500nM，更佳的为300-400nM，进一步更佳的为400nM。
步骤（1）中，较佳的，所述的PCR的反应体系为Promega公司提供的Probe qPCR Master Mix（货号为A6102）。所述的qPCR Master Mix中包括：2×PCR缓冲液，Taq酶，dNTP和MgCl2。所述的2×PCR缓冲液的浓度较佳的为10-30mM Tris-HCl，所述的Taq酶的浓度较佳的为0.5-1.5U/PCR，所述的dNTP的浓度较佳的为0.1-0.5mM，所述的MgCl2的浓度较佳的为1-3mM。
步骤（1）中，所述的PCR的扩增程序为本领域常规的扩增程序，所述的扩增程序较佳的为：95℃预变性3-5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：95℃变性3-15s，60℃退火30-60s，收集荧光信号；循环共40个；所述的扩增程序更佳的为：95℃预变性3min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：95℃变性15s，60℃退火30s，收集荧光信号；循环共40个。
步骤（1）中，所述的内标模板是人工合成并添加到PCR反应体系中的一定数量的基因序列，其序列和目标探针的序列同源性较低（＜60%）。所述的内标模板的作用为：指示荧光定量PCR反应体系中是否有PCR抑制剂的存在，从而可以避免假阴性结果的发生。若PCR反应体系中存在PCR反应抑制剂，那么内标模板也无法扩增，就会导致PCR假阴性的发生。通过添加内标模板可以很好地避免PCR假阴性结果的发生。
步骤（1）中，所述的内标模板的引物与所述的待测样品模板的引物相同，所述的内标模板的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
步骤（2）中，所述的检测结果的判断方法如下：在检测的结果中，如果在PCR扩增反应35个循环之前有荧光信号（FAM）的出现，则说明待检样品中含有克罗诺杆菌菌属菌株；如果在PCR扩增反应35个循环之前没有荧光信号的出现，则待检样品中不含有阪崎克罗诺杆菌。
步骤（2）中所述的检测方法为本领域常规的方法。所述的荧光定量PCR仪至少包含两个通道，能够同时收集FAM和HEX的荧光信号。
步骤（2）中，较佳的，收集PCR反应过程中FAM和HEX的荧光信号后，根据收集的荧光信号生成的扩增曲线来判断样品中是否含有阪崎克罗诺杆菌，以及含有的阪崎克罗诺杆菌的量。具体而言，若待检样品中经PCR扩增后，在35个循环之前如果有扩增曲线的产生，说明样品中含有阪崎克罗诺杆菌的基因组DNA，如果在35个循环之前没有扩增曲线的产生，则说明待检样品中不含有阪崎克罗诺杆菌的基因组DNA。样品中所述的阪崎克罗诺杆菌数量的确定是根据收集的荧光信号的扩增曲线中的阈值（Ct值）来确定的，将待检样品荧光定量PCR扩增曲线中的阈值代入到标准曲线中，就可以确定待检样品中阪崎克罗诺杆菌的数量。
本发明的目的之二在于，提供一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对；所述的检测阪崎克罗诺杆菌的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.1所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之三在于，提供一种检测阪崎克罗诺杆菌的目标探针和内标探针。所述的目标探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述的内标探针的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明中，所述的目标探针的作用为：检测和指示样品中是否含有阪崎克罗诺杆菌。若待检样品中含有阪崎克罗诺杆菌，那么样品中DNA经PCR扩增后，目标探针就会和PCR产物中的互补序列进行结合，从而可以产生荧光信号，生成扩增曲线。反之，如果待检样品中不含有阪崎克罗诺杆菌，那么目标探针就无法和PCR产物进行结合，从而没有荧光信号的产生，也没有扩增曲线的生成。
本发明中，所述的内标探针的作用为：指示荧光定量PCR反应体系中是否有PCR抑制剂的存在，从而可以避免假阴性结果的发生。所述的内标探针和添加到荧光定量PCR反应体系中的内标结合，若PCR反应体系中没有PCR反应抑制剂的存在，那么人工添加的内标序列经PCR扩增后就会和内标探针结合，从而可以产生荧光信号。
本发明的目的之四在于，提供一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，所述的试剂盒包括检测阪崎克罗诺杆菌的引物对、目标探针、内标探针和内标模板；所述的检测阪崎克罗诺杆菌的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.1所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述的目标探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述的内标探针的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的内标模板的序列如SEQ ID NO.5所示。
所述的目标探针的浓度较佳的为100-500nM，更佳的为200-300nM。
所述的内标探针的浓度较佳的为200-600nM，更佳的为200-300nM。
所述的内标模板的浓度较佳的为20-400copies/μL，更佳的为400copies/μL。
所述的引物的浓度较佳的为200-500nM，更佳的为300-400nM，进一步更佳的为400nM。
较佳的，所述的试剂盒中还包括2×PCR缓冲液，Taq酶，dNTP和MgCl2。所述的2×PCR缓冲液的浓度较佳的为10-30mM Tris-HCl，所述的Taq酶的浓度较佳的为0.5-1.5U/PCR，所述的dNTP的浓度较佳的为0.1-0.5mM，所述的MgCl2的浓度较佳的为1-3mM。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的检测方法可定量检测出食品中，特别是奶粉中的克罗诺杆菌菌株，检测时间短，降低了检测成本；提高了检测效率；本发明的检测方法，具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单。本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的定量检测克罗诺杆菌属细菌的方法，对我国的食品安全具有较大意义。
附图说明
图1实施例2中内标-目标探针共同反应优化结果图。
图2为实施例2中阪崎克罗诺杆菌荧光定量PCR标准曲线
图3为实施例3中添加有扩增内标的荧光定量PCR实际检测样品检测结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
引物、内标序列和探针合成
合成能够PCR扩增阪崎克罗诺杆菌特异性基因序列（CS44）的引物、内标序列（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）和探针（英潍捷基（上海）贸易有限公司），其序列如下：
SEN2-L（引物）：5’-aatgcacaagcgcgatttc-3’（SEQ ID NO:1）
SEN2-R（引物）：5’-tgcaaaaggcgctgtgataa-3’（SEQ ID NO:2）
Probe-1（目标探针）：5’-FAM-tgctcgcccaatctcaacgcc-BHQ1-3’（SEQ IDNO:3）
Probe-2（内标探针）：5’-HEX-ccttagtaaaaccggtacctc-BHQ1-3’SEQ IDNO:4）
内标模板：
5’-aatgcacaagcgcgatttccacgccttagtaaaaccggtacctctacaattatcacagcgccttttgca-3’（SEQ ID NO:5）
实施例2
阪崎克罗诺杆菌的检测
1、PCR检测反应体系的建议和反应参数
采用如实施例1所述的引物和探针，以阪崎克罗诺杆菌标准菌株ATCC29544（购自ATCC）的基因组DNA为模板，PCR反应试剂使用的是Promega公司提供的Probe qPCR Master Mix(货号为A6102)，通过调整和优化反应体系中引物和目标探针以及内标探针的浓度使PCR反应体系达到最佳的反应体系。引物的浓度是400nM，待检样品的基因组DNA的浓度为20ng/μL。
将原始浓度为10μM的目标探针和内标探针添加到不同的PCR反应管中，将目标探针和内标探针的浓度从100nM依次梯度稀释到500nM（100nM，150nM，200nM，250nM，300nM，350nM，400nM，450nM，500nM），然后进行荧光定量PCR反应，根据荧光定量PCR仪收集到的荧光信号的扩增曲线确定目标探针和内标探针的最适浓度，主要依据Ct值和扩增效率来进行判断，一般来讲，Ct值越小，扩增效率越高的浓度为最适浓度。
图1为该实施例中内标-目标探针共同反应优化结果图。图1中的每一条曲线均是荧光定量仪根据PCR反应过程中收集到的荧光信号值而绘制成的扩增曲线，代表的是上述从100nM依次梯度稀释到500nM的不同浓度的目标探针和内标探针的反应体系。由图1可以确定目标探针和内标探针的最适浓度。具体方法为：目标探针和内标探针的最适浓度根据Ct值（荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数）的大小和扩增效率（根据扩增曲线的斜率在判定的，扩增曲线指数期斜率和扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高）来判断的。通常情况下，在相同的反应条件下，Ct值越小，说明该浓度为最适浓度。在Ct值相同情况下，扩增效率越高，说明该浓度为最适浓度。
在图1中，曲线1表示目标探针浓度为200nM，内标探针浓度为300nM时的曲线，该曲线斜率最大，说明扩增效率最高，由此认为：上述浓度为二者分别的最适浓度。而其余浓度的目标探针浓度和内标探针的体系，扩增效果均不如曲线1的体系。
由图1可知：最终确定目标探针的较佳浓度是200-300nM，最适浓度是200nM，内标探针的较佳浓度是200-300nM，最适浓度是300nM。
然后将已知目标模板的浓度从5pg/μL依次梯度稀释到5×10-5pg/μL，经荧光PCR反应验证后确定了内标模板的检测限是0.005pg/μL（相当于1copy/μL），并据此制定了阪崎克罗诺杆菌基因组拷贝数和Ct值之间的标准曲线，如图2所示，其标准曲线方程为：Ct=-3.543lgX+34.086；其中，X为模板浓度，R2=0.999。
将内标模板添加到目标PCR反应体系中，确定了内标模板的浓度是400copies/μL，以及PCR反应体系中目标探针和内标探针的浓度分别是200nM和300nM时，添加单链DNA内标对目标模板的PCR扩增效率不会产生影响，而且还能够指示PCR体系中是否存在PCR抑制剂，可以很好的避免PCR假阴性结果的发生。
因此，本发明建立了最优的PCR检测方法：确定目标探针的浓度200nM，内标探针的浓度300nM，引物的浓度400nM，待检样品的基因组DNA的浓度20ng/μL，内标模板的浓度400copies/μL。检测方法如下：先加入4.0μL无菌水到PCR反应管中，再依次加入qPCR Master Mix10μL，10μM引物1.0μL，10μM目标探针0.4μL，10μM内标探针0.6μL，最后加内标模板和待检样品的基因组DNA溶液各2μL，并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。然后将PCR反应管离心后，放入荧光定量PCR反应仪中，按照以下PCR程序进行：95℃预变性3min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：95℃变性15s，60℃退火30s（在此步收集荧光信号）；循环共40个。
2、检测
取阪崎克罗诺杆菌标准菌株1株及42株阪崎克罗诺杆菌分离菌株（如表1所示，其中，阪崎克罗诺杆菌分离菌株是参考：GB4789.40—2010中的方法分离得到的，且鉴定为阪崎克罗诺杆菌；其余菌株均市售可得），按照基因组DNA模板提取方法，分别提取基因组DNA。提取过程如下：将阪崎克罗诺杆菌标准菌株和分离菌株等43株菌株（如表1所示）分别接种至5mL的TSB液体培养基（购自英国OXOID公司，货号为CM0129）中，在37℃增菌8h后，取1mL菌液，放入1.5mL离心管中；之后在5,000r/min离心10min，弃上清液。用无菌双蒸水重新悬浮菌体，再在12,000r/min离心5min，收集菌体。离心洗涤后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮10min，立即取出，在-20℃放置10min。在37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用。
每株菌株的DNA溶液（DNA浓度50ng/μL）均取2μL作为PCR反应模板添加到PCR反应体系中进行扩增反应。采用荧光定量PCR仪7500FAST（美国ABI公司）收集FAM和HEX的荧光信号，根据扩增曲线判定结果见表1。
从表1中可知，除了阪崎克罗诺杆菌菌株的标准菌株和食品分离株外，其余阴性对照菌株均没有特异扩增曲线。表1中，-：荧光定量PCR结果为阴性；+：荧光定量PCR结果为阳性。表1中阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)模式菌株为ATCC29544。阪崎克罗诺杆菌和肠杆菌属的亲缘关系最近，尤其和肠杆菌属内的阴沟肠杆菌亲缘关系最近。本次试验共使用了肠杆菌属标准菌株12株，志贺氏菌属标准菌株3株，沙雷氏菌属标准菌株2株，克雷伯属标准菌株2株，葡萄球菌属标准菌株2株，假单胞菌属标准菌株3株，李斯特菌属标准菌株2株，弧菌属标准菌株3株及分离菌株1株。所使用的这些菌株都是食源性致病菌，而且绝大多数都属于肠杆菌科的，它们和阪崎克罗诺杆菌菌株具有较近的亲缘关系。如果这些菌株经本发明的引物通过PCR实验后扩增不到特异的片段，那么其它的和阪崎克罗诺杆菌菌株亲缘关系较远的菌株更加难以扩增到目的片段，因此经过这些亲缘关系较近的菌株的系统生物学实验验证，充分保证了本次试验设计的引物的特异性。并且，除表1所示的菌株以外，当添加克罗诺杆菌属的其他6个种的菌株时（菌数为1），采用同样的方法，也无法检测到这6个种的菌株。上述结果充分证明本发明的方法能扩增阪崎克罗诺杆菌的任何菌株，而不会扩增其它的任何菌株。
表1.特异性评价所用菌株及试验结果
本实验通过添加人工构建并合成的单链DNA扩增内标到荧光定量PCR反应体系中，通过对其添加量进行优化即可用做指示假阴性的作用，并且不会对原有的PCR反应产生影响。该人工内标设计简便快捷，而且合成方便，定量容易。因此使用起来极为方便，而且操作简单，而且不会降低原来的检测灵敏度。
实施例3
30份食品样品（包括奶粉和蔬菜等）均购于上海的农贸市场和大型超市。将30份样品，每份取50g添加到450mL缓冲蛋白胨水(buffer peptone water，BPW，pH8.0)增菌培养基（成分包括：蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠9.0g、磷酸二氢钾1.5g、蒸馏水1000mL，pH7.2±0.2；制备方法为：将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121℃，15min）中进行增菌培养，37℃增菌18h后每份样品取1mL放入1.5mL离心管中，并用煮沸法提取基因组DNA，在12000rpm转速下离心5min后取2.5μL上清液作为PCR模板，以无菌水作阴性对照，进行荧光定量PCR检测。
PCR检测的反应体系如实施例1所示；反应条件为：目标探针的浓度200nM，内标探针的浓度300nM，引物的浓度400nM，待检样品的基因组DNA的浓度20ng/μL，内标模板的浓度400copies/μL；检测方法为：先加入4.0μL无菌水到PCR反应管中，再依次加入qPCR Master Mix10μL，10μM引物1.0μL，10μM目标探针0.4μL，10μM内标探针0.6μL，最后加内标模板和待检样品的基因组DNA溶液各2μL，并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。然后将PCR反应管离心后，放入荧光定量PCR反应仪中，按照以下PCR程序进行：95℃预变性3min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：95℃变性15s，60℃退火30s（在此步收集荧光信号）；循环共40个。
每个实验重复3次。同时，样品增菌18-24h后，按国标法GB4789.40-2010进行分离鉴定阪崎克罗诺杆菌，并将最后鉴定结果与荧光定量PCR方法结果进行对照。
经本发明中建立的荧光定量PCR检测方法对上述样品进行检测，检测得到的扩增曲线的结果如图3所示。在图3中，每条曲线的含义均表明该样品中含有阪崎克罗诺杆菌，如果样品中不含有阪崎克罗诺杆菌菌株，则不会有扩增曲线的产生。也就是说：本实施例的30分样品中，有5份含有阪崎克罗诺杆菌菌株（如曲线1-5所示）。并且，在图3中，扩增曲线的位置不同表明样品中含有的阪崎克罗诺杆菌的数量不同。实际样品中阪崎克罗诺杆菌含量高的样品，其Ct值越小，曲线最先出现，也就是越靠图的左侧，反之亦然。图3中，曲线1表示该样品中阪崎克罗诺杆菌的数量最多，曲线2-5依次次之。
在得到了如图3的曲线后，将每一条曲线中对应的Ct值代入到标准曲线的公式（Ct=-3.543lgX+34.086）中即可得到每条曲线对应的样品浓度。
由图3的结果可知：有5份样品均有特异性扩增曲线产生，而该5份样品经国标方法也均分离到阪崎克罗诺杆菌菌株，两者相符率高达100%，由此可见本实验建立的方法具有较高的可靠性。

Claims (14)

1.一种奶粉中阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：
(1)所述的奶粉在检测前进行预处理；
所述的预处理的方法为：将所述的奶粉预增菌，再提取DNA，即可；其中，所述的预增菌的方法为：将所述的奶粉添加到缓冲蛋白胨水增菌培养基中，在36-38℃中增菌16-24h，即可；所述的提取DNA的方法为：用煮沸法提取DNA，所述的煮沸法为在99-101℃条件下水浴10-20min，再在12000rpm速度下离心5min，取上清液，即可；
在PCR反应体系中，加入从奶粉中提取的DNA、检测阪崎克罗诺杆菌的引物对、目标探针、内标探针和内标模板，进行荧光定量PCR扩增；
所述的检测阪崎克罗诺杆菌的引物对中，一条引物的序列如SEQ IDNO.1所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述的目标探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述的内标探针的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的内标模板的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的目标探针的5′端标记有荧光基团FAM，所述的目标探针的3′端标记有荧光基团BHQ1；所述的内标探针的5′端标记有荧光基团HEX，所述的内标探针的3′端标记有荧光基团BHQ1；
(2)利用荧光定量PCR仪实时跟踪收集PCR反应过程中FAM和HEX的荧光信号，即可。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述的奶粉的DNA的浓度为10-250ng/μL；
步骤(1)中，所述的目标探针的浓度为100-500nM；
步骤(1)中，所述的内标探针的浓度为200-600nM；
步骤(1)中，所述的内标模板的浓度为20-400copies/μL；
步骤(1)中，所述的引物的浓度为200-500nM；
步骤(1)中，所述的PCR的反应体系为Promega公司提供的Probe qPCR Master Mix；所述的qPCR Master Mix中包括：2×PCR缓冲液，Taq酶，dNTP和MgCl2；
步骤(1)中，所述的PCR的扩增程序为：95℃预变性3-5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：95℃变性3-15s，60℃退火30-60s，收集荧光信号；循环共40个。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的奶粉的DNA的浓度为10-100ng/μL；
步骤(1)中，所述的目标探针的浓度为200-300nM；
步骤(1)中，所述的内标探针的浓度为200-300nM；
步骤(1)中，所述的内标模板的浓度为400copies/μL；
步骤(1)中，所述的引物的浓度为300-400nM；
所述的2×PCR缓冲液的浓度为10-30mM Tris-HCl，所述的Taq酶的浓度为0.5-1.5U/PCR，所述的dNTP的浓度为0.1-0.5mM，所述的MgCl2的浓度为1-3mM；
所述的扩增程序为：95℃预变性3min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：95℃变性15s，60℃退火30s，收集荧光信号；循环共40个。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的奶粉样品的DNA的浓度为20ng/μL或50ng/μL；
步骤(1)中，所述的引物的浓度为400nM。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
步骤(2)中，所述的荧光定量PCR仪至少包含两个通道，能够同时收集FAM和HEX的荧光信号。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
步骤(2)中，收集PCR反应过程中FAM和HEX的荧光信号后，根据收集的荧光信号生成的扩增曲线来判断样品中是否含有阪崎克罗诺杆菌，以及含有的阪崎克罗诺杆菌的量；若待检样品中经PCR扩增后，在35个循环之前如果有扩增曲线的产生，说明样品中含有阪崎克罗诺杆菌的DNA，如果在35个循环之前没有扩增曲线的产生，则说明待检样品中不含有阪崎克罗诺杆菌的DNA；样品中所述的阪崎克罗诺杆菌数量的确定根据收集的荧光信号的扩增曲线中的阈值来确定。
7.一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对，其特征在于：所述的检测阪崎克罗诺杆菌的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.1所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种检测阪崎克罗诺杆菌的目标探针和内标探针，其特征在于：所述的目标探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述的内标探针的序列如SEQ IDNO.4所示。
9.一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括检测阪崎克罗诺杆菌的引物对、目标探针、内标探针和内标模板；所述的检测阪崎克罗诺杆菌的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.1所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述的目标探针的序列如SEQ IDNO.3所示，所述的内标探针的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的内标模板的序列如SEQ ID NO.5所示。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述的目标探针的浓度为100-500nM；
所述的内标探针的浓度为200-600nM；
所述的内标模板的浓度为20-400copies/μL；
所述的引物的浓度为200-500nM。
11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述的目标探针的浓度为200-300nM；
所述的内标探针的浓度为200-300nM；
所述的内标模板的浓度为400copies/μL；
所述的引物的浓度为300-400nM。
12.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述的引物的浓度为400nM。
13.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中还包括2×PCR缓冲液，Taq酶，dNTP和MgCl2。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于：所述的2×PCR缓冲液的浓度为10-30mM Tris-HCl，所述的Taq酶的浓度为0.5-1.5U/PCR，所述的dNTP的浓度为0.1-0.5mM，所述的MgCl2的浓度为1-3mM。
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