CN104630388A - 一种登革病毒快速分型鉴别检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种登革病毒快速分型鉴别检测的试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光快速聚合酶链式反应技术鉴别登革病毒四种血清型即I型、II型、III型、IV型的检测试剂盒。本试剂盒主要包括扩增反应缓冲液、引物探针反应液、扩增反应酶系、阴性质控品、阳性质控品，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒通过多种荧光通道分别检测的方式，应用具有快速聚合反应的Taq酶，采用一步法实时荧光快速PCR反应模式，能准确快速检测出样本中是否含有登革病毒核酸并鉴别出登革病毒的四种血清型，可广泛应用于登革热尤其是重症登革热以及混合感染登革病毒的早期鉴别诊断、疫情防控、检验检疫等多个领域。

Description

一种登革病毒快速分型鉴别检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种登革病毒血清型快速鉴别检测的试剂盒，特别是涉及一种利用快速多重实时荧光聚合酶链式反应技术一管反应即可鉴别出登革病毒四种血清型的试剂盒。本试剂盒主要包括扩增反应缓冲液、引物探针反应液、扩增反应酶系、阴性质控品、阳性质控品，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒能准确区分登革病毒I型、II型、III型、IV型，可广泛应用于登革热临床早期诊断、重症病例预警、口岸检验检疫、疫情防控、媒介控制及科学研究等多个领域。
背景技术
登革热和登革出血热是由登革4个血清型的登革病毒引起的急性虫媒传染病，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，广泛流行于全球热带和亚热带地区，是分布最广，发病最多，危害较大的一种虫媒病毒性疾病。在临床上，登革热主要以高热、头痛、肌肉和关节痛为主，可伴有皮疹、淋巴腺肿和白血球减少，此类疾病传播迅速，可引起较大规模的流行，病死率较低，一般将这种病型称为古典型登革热。而登革出血热是以高热、出血、休克、和高病死率为特征，是较为严重的一种临床类型，伴有休克综合征倾向的称为登革出血热/登革休克综合征。在我国，登革热曾在海南、广东、广西、福建、浙江、江苏和港澳台等地区暴发，而登革出血热/登革休克综合征在我国云南、广东南部和台湾也均有爆发。2013年，云南西双版纳爆发的即为较大规模的重症登革出血热疫情，后经证实病例多为登革血清型合并感染，或输入性和本地感染病例交叉发生，是本次疫情较以往每年流行病学特点出现不同的主要原因。所以值得警惕的是登革热出现交叉或合并感染导致的重症出血热病例有流行的趋势或再度爆发的可能。
在登革热高发期间如果被伊蚊叮咬过，或到过有登革热流行的国家或地区旅游，且有被伊蚊叮咬的经历，就有可能会患上登革热。目前仍未有完全有效预防感染登革热的疫苗，且该病具有传染快、易流行的特点，一旦发生，将严重威胁人们健康和社会安定。为了有效防控登革热的发生与传播，在疾病发生早期实行快速诊断是一个重要的环节。登革病毒毒力变化与疾病的严重性密切相关，尽管4个血清学病毒感染均能发生重症登革热，但临床观察及实验室研究结果表明登革病毒II型和III型感染更容易出现重症临床表现。因此，在急性期及时检测登革病毒核酸和鉴别血清型对重症病例的早期预警判断，提高临床救治水平，降低重症登革热的病死率等方面具有重大意义。
目前，国内外对登革病毒的诊断方法，主要还是依靠血清学试验、病毒培养和常规的PCR检测，其中，血清学试验、组织培养。具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点；而常规PCR也存在容易污染的不足。多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术，该方法具有快速、特异、灵敏、自动化程度高等特点，结合防污染技术处理，特别适合于大规模、快速、早期诊断的需求。该技术采用多色荧光对多条种特异性探针进行标记，配合多重PCR技术和快速热启动Taq酶，可以在同一个PCR反应管中对多个病毒同时进行快速扩增，扩增时间与普通实时荧光PCR相比从100-120min可缩短至50-60min，大大提高了检测效率；另外各色荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病原体类型的目的。因此，将多重实时荧光PCR技术应用于登革病毒分型的快速检测，能够节约时间、减少取材数量、提高检测鉴别效率，能在短时间内判断疑似病例或可疑媒介是否感染登革病毒及同时确认所感染血清型，便于临床及时采取必要的防控和治疗措施，尤其提高重症病例的治愈率，对于防止这些病毒继续传播，提高诊疗效率意义重大，检测结果为快速诊断、有效监测和针对性治疗提供数据支持和依据。
本发明采用实时荧光PCR技术中的多重实时荧光PCR方法，对登革四种血清型(登革病毒I型、II型、III型、IV型)核酸进行扩增，根据标记的四色荧光的扩增情况，来鉴别四种血清型。本发明的快速鉴别试剂盒可广泛地运用于由登革病毒引发的登革热或疑似登革热患者的样本检测和实验室诊断，尤其适用于交叉感染或混合感染的登革热患者的临床样本快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术进行登革病毒四种血清型的鉴别试剂盒，利用本试剂盒可以准确区分登革病毒I型、II型、III型、IV型。
在对GENBANK上所有已知的登革病毒各血清型的核酸序列进行比对的基础上，分别寻找各型别核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反应酶系以及含有Mg2+等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。
本发明所涉及的试剂盒主要包括：1)扩增反应缓冲液、引物探针反应液、扩增反应酶系、阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明的一个优选实施方案是引物探针混合液由登革病毒各血清型特异性的正、反向引物，登革病毒血清型特异性的探针组成，其特征在于登革病毒I型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TTGAGATCTCTTTTTTGAAACC-3’(SEQ ID NO：1)和5’-TCTAAGATTTCTAGCCATACCC-3’(SEQ ID NO：2)；登革病毒I型特异性的探针的序列是5’-TCGCTCCATTCTTCTTGAATGAGCC-3’(SEQ ID NO：3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；登革病毒II型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GACGAGGACCATTAAAACTG-3’(SEQ ID NO：4)和5’-CATCTCTTCAATATCCCTGC-3’(SEQ ID NO：5)，登革病毒II型特异性的探针的序列是5’-CATTCCTTCGTTTCCTAACAATCCCA-3’(SEQ ID NO：6)，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团Eclipse；登革病毒III型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TGTGTGATGACACGGTCACTT--3’(SEQ ID NO：7)和5’-CACCAGCAGTCAATGTCTTCA-3’(SEQ ID NO：8)，登革病毒III型特异性的探针的序列是5’-CAAATGCCCCCACATTACCGAAGTG-3’(SEQ ID NO：9)，探针的两端分别结合有荧光发生基团TexasRed和荧光淬灭基团Eclipse；登革病毒IV型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGA-3’(SEQ ID NO：10)和5’-GCAACCTCACGTCTACCTGG-3’(SEQ IDNO：11)，登革病毒IV型特异性的探针的序列是5’-CTCGTCTCCGTTCTCCGCTCTGG-3’(SEQ IDNO：12)，探针的两端分别结合有荧光发生基团Cy5和荧光淬灭基团Eclipse。
本发明的另一个优选实施方案是引物探针混合液中引物浓度均为0.2mmol/L，探针浓度均为O.1mmol/L。
本发明的另一个优选实施方案是扩增反应缓冲液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0)、MgCl2(8mmol/L)、KCl(250mmol/L)组成。
本发明的另一个优选实施方案是扩增反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成。逆转录酶可选择mMLV等常用逆转录酶。热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs均可采用市售产品，如Qiagen公司的产品，其中每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5U，逆转录酶用量为2.5U，dNTPs用量为0.4mmol。
本发明的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为：50℃15分钟，95℃5分钟；94℃5秒，60℃20秒，45个循环(60℃时收集荧光信号)。
本发明的一个优选实施方案是试剂盒提供了质控品，分别为阴性质控品和阳性质控品。阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为含有登革病毒四种血清型的灭活病毒液，由四种登革病毒血清型阳性核酸按照浓度为2.0×103copies/mL～5.0×107copies/mL等体积比混合而成，优选1.0×105copies/mL，并以等体积比混合均匀制备成阳性质控品。试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测时FAM、HEX、Texas Red及CY5通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测四个通道荧光信号均呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。
本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于登革病毒分型、辅助临床诊断及常规监测等多个领域研究。
本发明与现有技术相比优点为：①一份样本一次检测即可鉴别四种血清型的感染情况，检测过程只需50min，相比一个样本进行4次检测或只进行登革病毒通用型荧光法检测，大大减少了工作量，提高了检测效率；相对于已有的核酸杂交法检测技术，检测所需时间缩短了一半以上；②分别针对四种血清亚型病毒核酸特异性序列设计专用引物、探针，保证检测的特异性和准确性，也具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点，更适用于多数患者检测；③对登革病毒四种血清型核酸扩增水平进行检测，可反映出样本中登革病毒感染的状态及确认是何种血清型登革病毒感染，可用于登革热的监测和防控及临床诊断，有助于登革热的早期诊断和治疗；④试剂采用灭活病毒作为阳性质控品，即可以对试剂进行质控，也可以监控提取过程的有效性，比质粒作为质控更具有效性和科学性；⑤试剂采用扩增反应缓冲液、引物探针混合液、扩增反应酶系的大包装设置，适合多种荧光检测设备，具有适用性更加广泛的特点，同时对于试剂盒温度储存条件要求大大降低，可采用低温4-6℃存放，有效期可达6个月。
附图说明
图1显示PCR扩增的反应条件。
图2显示试剂盒阴性质控品的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明FAM、HEX、Texas Red及CY5通道荧光信号均呈阴性。
图3显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。
图4显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中HEX通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。
图5显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中Texas Red通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。
图6显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中CY5通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。
图7显示4例阳性血清样本的扩增曲线。图中4例样本的FAM通道有明显扩增曲线，说明该样本有登革病毒I型核酸的扩增，表示样本中存在登革病毒I型。
图8显示1例阳性血清样本的扩增曲线。图中HEX通道有明显扩增曲线，说明该样本有登革病毒II型核酸的扩增，表示样本中存在登革病毒II型。
图9显示1例阳性血清样本的扩增曲线。图中Texas Red通道有明显扩增曲线，说明该样本有登革病毒III型核酸的扩增，表示样本中存在登革病毒III型。
图10显示1例阳性血清样本的扩增曲线。图中Cy5通道有明显扩增曲线，说明该样本有登革病毒IV型核酸的扩增，表示样本中存在登革病毒IV型。
图11显示1例混合感染样本的扩增曲线。图中HEX通道和Texas Red通道均有明显扩增曲线，表示样本中同时存在II型和III型核酸。
图12显示1例混合感染样本的扩增曲线。图中FAM通道和Texas Red通道均有明显扩增曲线，表示样本中同时存在I型和III型核酸。
图13显示1例混合感染样本的扩增曲线。图中HEX通道和Cy5通道均有明显扩增曲线，表示样本中同时存在II型和IV型核酸。
图14显示乙型脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、汉滩病毒、汉城病毒样本的扩增曲线。图中无扩增曲线，说明该样本中不含有登革病毒任一血清型核酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1登革病毒分型鉴别检测试剂盒及其使用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒：引物探针混合液(50μl/管)1管，扩增反应缓冲液(375μl/管)，扩增反应酶系(75μl/管)1管，阳性质控品(200μl/管)1管，阴性质控品(200μl/管)1管。
2、标本的采集、保存和运输
2.1标本类型：血清、血浆样本。
2.2标本采集：
2.2.1血清：无菌采集发病后5天内静脉血3～5ml，室温静置30分钟使其凝固，然后1500～2000rpm离心10min，去除纤维蛋白和血红球，收集血清于2ml无菌螺口塑料管中。
2.2.2血浆：无菌采集血液样本，置于含有适量抗凝剂的试管内；缓慢摇动试管12次后，以2000-3000rpm离心10min(血样采集后1h之内进行)；将血浆置于标记有日期、采集时间、病历号的试管内，立即进行核酸提取操作或冷藏、冷冻储存。
2.3样品保存和运送
标本装入螺口塑料血清管，用耐低温油性记号笔记上编号，于-70℃以下运输或保存待检。亦可参照有关国家标准或有关行业标准中推荐的方法。
3、核酸提取：
可采用市售的RNA提取试剂盒，建议使用中山大学达安基因股份有限公司生产的磁珠提取试剂盒、柱提取试剂盒，并按照试剂盒的说明书进行操作，最后收集到50～80μl RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
4、实时荧光定量PCR扩增及检测
4.1试剂准备：按比例取相应量的引物探针混合液、扩增反应缓冲液、扩增反应酶系(引物探针混合液2μl/人份+扩增反应缓冲液15μl/人份+扩增反应酶系3μl/人份)，充分混匀后按20μl/管分装成PCR反应管，备用。
4.2加样：向PCR反应管中，分别加入提取后的阴、阳性质控品、样本RNA溶液5μl，盖紧管盖，放入仪器样品槽。
4.3编辑：(ABI Prism 7500荧光定量PCR仪)
打开Setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector，选择Reporter为FAM和Quencher为none，再选择Reporter为HEX和Quencher为none；再选择Reporter为Texas Red和Quencher为none；然后选择Reporter为Cy5和Quencher为none后关闭窗口。在PassiveReference中选择(none)。打开instrument窗口设置循环条件：50℃15分钟，95℃5分钟；94℃5秒，60℃20秒，45个循环(见附图1)。所有设置完成后保存文件，运行。
4.4结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amp plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：1.5±100000。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口，将Post Run Settings中Log改为Linear，OK后打开Analysis preferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。
实施例2应用登革病毒分型鉴别检测试剂盒检测临床样品
选取经过病毒培养方法分别鉴定为登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III型、登革病毒IV型阳性血清标本各1例，以及经病毒培养方法鉴定为基孔肯雅病毒、乙型脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、汉滩病毒、汉城病毒阳性的血清样本各1例作为特异性样本，对所有样本进行核酸提取，PCR扩增及结果分析步骤参照实施例1进行，同时进行阴，阳性质控品的检测。
检测结果：阴性质控品的扩增曲线不呈S型(见附图2)，阳性质控品的扩增曲线为明显S型曲线(见附图3，4，5，6)，阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。由待检标本的检测结果可知本试剂盒均检测到相应的登革病毒四种血清型核酸的扩增(见附图7，8，9，10)；另可检测到混合感染的重症登革热病例样本中含有至少两种血清型登革病毒核酸的扩增(见附图11、12、13)，对基孔肯雅病毒、乙型脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、汉滩病毒、汉城病毒、普马拉病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒、伤寒杆菌、疟原虫无非特异扩增(见附图14)。
本次试验中17例标本的检测结果与分离培养等鉴定结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测及鉴别登革病毒血清型是可行的。本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，加之其价格低廉，可应用于登革热的临床检测、检验检疫以及疫情监测，对重症登革热的快速检测，提高治疗效率和预后具有重大意义。

Claims (7)

1.一种登革病毒快速分型鉴别检测试剂盒，包括：1)扩增反应缓冲液、引物探针反应液、扩增反应酶系、阴性质控品、阳性质控品、DEPC H2O和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中引物探针反应液由登革病毒四种型特异性的正、反向引物，登革病毒四种型特异性的探针组成，其特征在于：
登革病毒I型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TTGAGATCTCTTTTTTGAAACC-3’和5’-TCTAAGATTTCTAGCCATACCC-3’，登革病毒I型特异性探针的序列是5’-TCGCTCCATTCTTCTTGAATGAGCC-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；该对引物探针可特异性地检测登革病毒I型，对登革病毒II型、III型及IV型无交叉反应；
登革病毒II型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GACGAGGACCATTAAAACTG-3’和5’-CATCTCTTCAATATCCCTGC-3’，登革病毒II型特异性探针的序列是5’-CATTCCTTCGTTTCCTAACAATCCCA-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1；该对引物探针可特异性地检测登革病毒II型，对登革病毒I型、III型及IV型无交叉反应；
登革病毒III型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TGTGTGATGACACGGTCACTT-3’和5’-CACCAGCAGTCAATGTCTTCA-3’，登革病毒III型特异性探针的序列是5’-CAAATGCCCCCACATTACCGAAGTG-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团Texas Red和荧光淬灭基团Eclipse；该对引物探针可特异性地检测登革病毒III型，对登革病毒I型、II型及IV型无交叉反应；
登革病毒IV型特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGA-3’和5’-GCAACCTCACGTCTACCTGG-3’，登革病毒IV型特异性探针的序列是5’-CTCGTCTCCGTTCTCCGCTCTGG-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团Cy5和荧光淬灭基团Eclipse；该对引物探针可特异性地检测登革病毒IV型，对登革病毒I型、II型及III型无交叉反应。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所用探针5‘端可采用FAM、VIC、YELLOW、TAMRA、NED、JOE、Texas Red、Cy5、Cy3中任一种荧光基团标记；3‘端可采用TAMRA、BHQ1、BHQ2、Eclipse中任一荧光淬灭基团标记。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于引物探针混合液中引物浓度均为0.2mmol/L，探针浓度均为0.1mmol/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于扩增反应缓冲液由pH值为8.0～8.8的50mmol/L Tris-HCl、3～8mmol/L MgCl2、150～350mmol/L KCl组成。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中扩增反应酶系由Fast-Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，特征在于每人份扩增反应酶系中Fast-Taq酶的用量为3～8U，最佳用量5U；逆转录酶用量为1.5～5U，最佳用量2.5U；dNTPs为0.2～0.4mmol，最佳用量为0.4mmol。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的条件为：50℃15分钟，95℃5分钟；94℃5秒，60℃20秒，45个循环。
7.根据权利要求1的试剂盒，还提供了阴性质控品和阳性质控品，其特征在于阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为含有登革病毒四种血清型的灭活病毒液，由四种病毒液按照浓度为1.0×105copies/mL浓度等体积比混合而成。
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