CN113913551B - 一种登革病毒分型的测序引物、检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种登革病毒分型的测序引物、检测方法及试剂盒。本发明建立一种全面覆盖登革病毒4个血清型及其变异株的多重PCR‑MS质谱检测方法，用于登革病毒的实验室诊断和精准基因分型及样本朔源。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种登革病毒分型的测序引物、检测方法及试剂盒。
背景技术
登革病毒(Dengue virus，DV)属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属。登革病毒颗粒呈球形，直径45～55nm，为有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长约 11kb，整个基因的编码顺序为：5’I型帽子结构、非编码区、AUC蛋白(核衣壳蛋白)基因、M蛋白(膜蛋白)基因、E蛋白(包膜蛋白)基因、NS1-2a-2b-3-4a-4b-5 基因、非编码区3’。登革病毒共有4个血清型(DENV-1、DENV-2DENV-3和DENV-4)， 4种血清型均可感染人，可引起隐性感染、登革热(dengue fever，DF)和登革出血热(denguehemorrhagicfever，DHF)，严重的还可导致登革休克综合征 (dengueshocksyndrome，DSS)，其中2型重症率及病死率均高于其它型。患者和隐性感染者为主要传染源，感染后对同型病毒有免疫力，并可维持多年，对异型病毒也有1年以上免疫力。
登革热是由登革病毒引起的急性传染病，主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。主要在热带和亚热带地区流行，我国广东、香港、澳门、云南等地是登革热流行区。随着全球气候变暖和城市化进程的加快，登革热病例正在迅速增加，已威胁到全球三分之一人口的健康安全。为了有效控制登革热的传播和流行，需要建立适应不同情况的检测技术。
登革病毒易发生变异。病毒核苷酸序列分析结果表明相同血清型病毒中不同分离株间的核苷酸变异为10％，而不同血清型病毒间的核苷酸变异为30％。并且根据病毒寡核苷酸指纹图谱的同源程度，可以将同型病毒的不同毒株分为不同的拓扑型。
检测埃及伊蚊或白纹伊蚊体内是否携带登革病毒，及早监测到伊蚊种群中病毒携带比例，对于登革疫情防控有重要作用。因为蚊体积小，病毒载量很低，通常以50只或100只蚊虫为一个反应池，提取总RNA，再通过反转录PCR的方式扩增登革病毒，阳性株进一步做测序，通过序列辨别登革病毒的型别。即便以反应池的方法进行登革病毒的监测，假阴性也仍然存在，且无法确定病毒型别。为了准确监测蚊种群中是否存在登革病毒感染，需要选择超高灵敏度和超宽动态范围的检测方法。多重PCR-MS质谱联用是开创无创产前诊断和液体活检的顶级先进技术。将该技术用于登革病毒检测，将极大提高病毒的检出率。
发明内容
本发明的目的在于建立一种全面覆盖登革病毒4个血清型及其变异株的多重PCR-MS质谱检测方法，用于登革病毒的实验室诊断和精准基因分型及样本朔源。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种用于登革病毒分型检测的引物。
本发明包括11个引物组，分别为：
第1引物组DeV1-1为：
正向序列：10mertag-ATAGAGGGTCCAGGCTGAAG，
反向序列：10mertag-CTGGCATATGTGGTGATAGG，
探针序列：CCCATCTCATTGGCTG，
第2引物组DeV1-2为：
正向序列：10mertag-TGAACACAAGTCAACATGGC，
反向序列：10mertag-ATTGACCATGGATGAGGCTG，
探针序列：GCCTATCATGGATCATATGAG，
第3引物组DeV2-1为：
正向序列：10mertag-GGCAGCAGAGCCATATGGTA，
反向序列：10mertag-CTTCTCCTTCCACTCCACTC，
探针序列：AAGATCCATATGGTACATGTGGC，
第4引物组DeV2-2为：
正向序列：10mertag-CCTAATATCGTATGGAGGAG，
反向序列：10mertag-ACCTGGACTTCTTCTCCTTC，
探针序列：TACTTCCTTCCATTCTCCTT，
第5引物组DeV3-1为：
正向序列：10mertag-ATAACAACACTCTGGGAAGG，
反向序列：10mertag-ATGTTCGCCATGGAAACAGC，
探针序列：TGGGAAGGATCACCTG，
第6引物组DeV3-2为：
正向序列：10mertag-CAATCCAACAGGTGAGAAGC，
反向序列：10mertag-CCTCCTTCCTGAATCTCTTC，
探针序列：CGAAGGCATGTAGTCCAG，
第7引物组DeV4-1为：
正向序列：10mertag-TGGGTTATTGGATAGAGAGC，
反向序列：10mertag-GGCCACAGACATGTTTTCAC，
探针序列：AGCTCAAAAAACCAGACCTG，
第8引物组DeV4-2为：
正向序列：10mertag-GGACTCCGGTGATGGAAATC
反向序列：10mertag-TCGTGTATGACATTCCCTTG，
探针序列：GTATGTGTATATTGCAAGAC，
第9引物组DeV-1为：
正向序列：10mertag-ATACGCCTTTCAATATGCTG，
反向序列：10mertag-CAGCATTCCAAGTGAGAATC，
探针序列：TCGTTTACACGCGGTTTC，
第10引物组Aedes_28s为：
正向序列：10mertag-AGTACCGTGAGGGAAAGTTG，
反向序列：10mertag-AATCGAGTTCAACGGGCTTG，
探针序列：AATAGAGAGTCAAAAAGTACG，
第11引物组RnaseP为：
正向序列：10mertag-TGAGCGGCTGTCTCCACAAG，
反向序列：10mertag-TGGCGGTGTTTGCAGATTTG，
探针序列：GAGCGGGTTCTGAC。
本发明的另一个目的在于提供一种用于登革病毒检测的试剂盒，包含上述的一组或多组引物。
本发明的另一个目的在于提供上述试剂盒在检测登革病毒中的应用。
具体的，上述应用主要用于登革病毒的诊断，基因分型以及样本朔源。
本发明的另一个目的在于提供一种登革病毒的检测方法，用于非疾病的诊断目的，包括以下步骤：
(1)样本中的RNA提取
提取样本中的RNA。提取方法属于现有技术，使用商品化提取试剂盒，提取组织、细胞或血样中的RNA，-80℃储存备用。
(2)PCR扩增
其中所用引物为本发明人所设计，引物如下：
以样本RNA反转录后cDNA为PCR模板进行PCR扩增。PCR扩增采用多重PCR技术，所述技术为现有技术，在多重PCR反应体系加入以上引物配制的引物混合物，将PCR反应板加入多重PCR反应体系和模板，放置于PCR仪上启动PCR反应。
(3)PCR产物碱性磷酸酶处理
所述方法为现有技术，如使用以下方法：在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP 处理，以去除体系中游离的dNTPs。如：配制碱性磷酸酶处理反应液，加入PCR 反应板。将孔板放置在兼容的PCR仪上，设定反应条件启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
(4)单碱基延伸
其中所用引物为本发明人所设计，引物如下：
所述方法为现有技术，如使用以下方法：配制单碱基延伸反应液，加入至SAP 处理后的PCR产物，放置在PCR仪上，设定反应条件，启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
(5)树脂纯化
所述方法为现有技术，如使用以下方法：将树脂平铺到树脂板中；加水到延伸产物的对应孔内；将树脂扣入延伸产物板中，封膜，低速旋转混匀30分钟，使树脂与反应物充分接触；离心。
(6)芯片点样
所述方法为现有技术，如使用以下方法：启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至SpectroCHIP芯片上。
(7)质谱检测
所述方法为现有技术，如使用以下方法：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分析并输出结果。
本发明的检测方法：从NCBI网站获取20090813之前所有登革病毒I-IV型全基因组序列4，502条，其中包括：I型1，874条，II型1，478条，III型944 条和IV型206条。将各型序列根据保守区不同分为两组，设计引物和探针共8 对，覆盖所有已知基因型及变异株序列。在锚定衣壳蛋白ancC基因5’端选取 1个型特异SNP位点(I型/C，II型/A，III型/T，IV型/A)设计1对引物和探针，用于辅助分型。另外，加入伊蚊Aedes_28s和人RnaseP各1个管家基因，作为样本溯源及质控，共11对引物和探针。结果经对11份登革病毒不同载量标准品，I型2份(10-1、10-3)，II型3份(10-1、10-3、10-5)，III型3份(10-1、 10-3、10-5)，IV型3份(10-3、10-4、10-6)，进行检测评估该反应体系的特异性、灵敏度、重复性性能。11份标本经本方法检测全部为阳性，均与预期结果完全一致。各型探针未见有任何交叉反应或交错检出，特异性高。通用引物 SNP位点分型，在II型和III型的高载量样本中成功正确分型。其中III型10-1标本，达到三探针同时检出阳性，从而奠定了三靶基因分型检测法。在I、II、 IV型标本中检出伊蚊28s阳性，人RnaseP均为阴性，表明本批标本的I、II、 IV型源自于伊蚊，而非人源，III型标本来源未定。
本方法可以成功检出荧光定量PCR检测为IV型10-6的样本，表明多重 PCR-MS法与荧光定量PCR法灵敏度一致。
本发明创建的11重PCR-MS质谱登革病毒双靶基因和SNP位点分型检测，具有高度特异性和高灵敏度。高重数PCR，且毋须荧光标记，具有低成本和高通量等优势，可用于登革病毒的快速检测、基因分型鉴定和样本溯源。
对于说明书中出现的英文缩写及技术名词，作进一步的解释：
10mertag：ACGTTGGATG
H2O HPLC grade：水，HPLC级(高效液相色谱级试剂)，
10×PCR Buffer：10×PCR反应缓冲液，含Tris-HCl，MgCl2等
dNTP：为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，用于PCR扩增反应，
Primer mix：多重PCR引物混合溶液，
hot star Taq polymerase：热启动Taq聚合酶，
10×SAP Buffer：SAP反应缓冲液，含Bis-Tris HCl，MgCl2，ZnCl2等，
SAP enzyme(SAP酶)：虾碱性磷酸酶，降解PCR反应中的dNTP，
iPLEX Buffer Plus：iPLEX延伸反应缓冲溶液，提供/维持反应环境，
iPLEX Termination mix：iPLEX反应终止混合溶液，
iPLEX Extend Primer mix：iPLEX延伸反应引物混合物，
iPLEX Pro enzyme：iPLEX延伸反应酶，
MassARRAYTM RS 1000点样仪：点样仪，将样本转移到芯片对应位置，
Massarray系统：台式MALDI-TOF质谱仪，数据处理及分析软件包。
说明书附图
图1、多重PCR_MS质谱扫描法操作流程
图中：设计多重PCR→引物扩增→单碱基延伸→芯片高通量→质谱高精度→自动分析→软件报告
图2、I型登革病毒样本(稀释度10-1)PCR-MS检测结果，其中A：DeV1-1引物组合检测结果，B：DeV1-2引物组合检测结果，C：Aedes_28s引物组合检测结果
图3、I型登革病毒样本(稀释度10-3)PCR-MS检测结果，其中A：DeV1-1引物组合检测结果，B：DeV1-2引物组合检测结果
图4、II型登革病毒样本(稀释度10-2)PCR-MS检测结果，其中A：DeV2-1引物组合检测结果，B：Aedes_28s引物组合检测结果，C：SNP位点引物组合检测结果图5、II型登革病毒样本(稀释度10-3)PCR-MS检测结果，其中A：DeV2-1引物组合检测结果，B：DeV2-2引物组合检测结果
图6、II型登革病毒样本(稀释度10-5)PCR-MS检测结果
图7、III型登革病毒样本(稀释度10-1)PCR-MS检测结果，其中A：DeV3-1引物组合检测结果，B：DeV3-2引物组合检测结果，C：SNP位点引物组合检测结果
图8、III型登革病毒样本(稀释度10-3)PCR-MS检测结果，其中A：DeV3-1引物组合检测结果，B：DeV3-2引物组合检测结果
图9、III型登革病毒样本(稀释度10-5)PCR-MS检测结果
图10、IV型登革病毒样本(稀释度10-3)PCR-MS检测结果，其中A：DeV4-1引物组合检测结果，B：Aedes_28s引物组合检测结果
图11、IV型登革病毒样本(稀释度10-4)PCR-MS检测结果，其中A：Aedes_28s 引物组合检测结果，B：DeV4-1引物组合检测结果
图12、IV型登革病毒样本(稀释度10-6)PCR-MS检测结果，其中A：Aedes_28s 引物组合检测结果，B：DeV4-1引物组合检测结果
图13、阴性对照PCR-MS检测结果
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、本发明的检测方法
本发明的多重PCR_MS质谱扫描法操作流程如图1，具体如下：
(一)建立登革病毒基因数据库：从NCBI网站获取登革病毒I-IV型全基因组序列4,502条，其中包括：I型1,874条，II型1,478条，III型944条和IV型206 条。详见表1。
表1.PCR-MS中登革病毒DENV设计引物的序列来源
Table1.Reference strains used in Multiplex PCR-MS design
(二)建立登革病毒SNP分型：经用Sequencher5.3软件聚类分析，在锚定衣壳蛋白ancC(anchored capsid protein ancC)基因5’端选取1个型特异SNP 位点(I型/C，II型/A，III型/T，IV型/A)设计引物和探针，配合辅助鉴定。建立登革病毒SNP分型表，详见表2。
表2.登革病毒SNP分型表
(三)多重PCR-MS引物设计序列
使用
MassARRAY Assay Designer4.0软件，设计多重PCR特异性引物和探针。
根据通用引物扩增区域设计出特异的延伸探针，探针3′端末尾9个碱基(不包含延伸碱基)，必须在该特异型别所有亚型序列中是保守未发生变异的。另外需要满足质谱系统的要求：延伸探针和产物长度之和应在15-30碱基(约 4500-9000Da)，得到的不同DENV型别的延伸产物与延伸引物之和的分子量差异不小于30Da。
本实验设计11重PCR检测，其中登革病毒四型均为双靶标，覆盖该型的所有已知突变序列，共8对型特异性引物和探针：1DeV1-1，2DeV1-2，3DeV2-1， 4DeV2-2，5DeV3-1，6DeV3-2，7DeV 4-1，8DeV 4-2；采用一个SNP分型(I /C，II/A，III/T，IV/A)9SNP，其中II和IV型均为A不能区分，需要依靠前面的型特异探针作区分；对每型有三个靶标，共有9个登革病毒靶标。在整个质谱实验的引物系统中加入扩增人RnaseP基因和伊蚊Aedes_28s管家基因的PCR引物和延伸探针，作为内参基因，监测cDNA模板的质量和PCR扩增反应的质量及样本溯源。见表3。
(四)多重PCR_MS质谱扫描法操作流程
多重PCR_MS分为PCR扩增、SAP酶处理、单碱基延伸和质谱分析四个步骤：
1.引物溶解和稀释
合成的登革病毒四型双靶和SNP分型及人RnaseP和伊蚊Aedes_28s基因，共11对干粉状通用引物采用12000rpm离心3min，按各条引物合成的浓度，加入无菌双蒸水稀释到500μM的储存浓度，涡漩振荡20s，离心30s，室温静置30min。在实验前将引物稀释到500nM的工作浓度。由于各条引物有不同的分子量，根据Sequenom公司的Design iPlex excel公式对延伸引物工作浓度进行调整。
2.多重PCR操作流程
iPLEX基因分型方法分为PCR扩增、SAP酶处理、单碱基延伸和质谱分析四个步骤，如图2所示。
前PCR扩增：
用Complete PCR Reagent试剂盒进行前PCR扩增：
(1)准备工作
(a)采用已灭菌的双蒸水作为阴性对照；
(b)取出前PCR反应试剂，试剂融化后，漩涡振荡20s后离心；
(2)MIX配制按下表顺序加入
(3)在384孔微量滴定板的每孔中加入3μl的PCR混合物，加到管底；
(4)每个样品吸取2μl，直接加到384孔板底部：
(5)全部加完后立即用封口膜封口；
(6)涡旋混匀微量滴定板；
(7)离心微量滴定板，1000rpm离心1min；
(8)热循环如下：
(9)离心384孔微量滴定板，在进行下步实验前置于-20℃保存。
SAP酶消化
(1)准备工作
(a)从-20℃冰箱中取出前PCR反应后384孔微量滴定板，4000rpm离心1min；
(b)取出SAP反应试剂，试剂融化后，涡漩振荡20秒后掌式离心机离心1min。
(2)配制SAP反应MIX，按下表配制：
(3)在384孔微量滴定板的每孔中加入2μl的SAP混合物；
(4)全部加完后用Axygen封口膜封口，涡旋混匀微量滴定板；
(5)离心样品板，4000rpm，1min；
(6)样品板的孵育条件如下：37℃40min；85℃5min；4℃保存；
(7)离心384孔微量滴定板，在进行下步实验前置于-20℃保存。
iPLEX延伸反应
用iPLEX Pro Reagent试剂盒进行延伸反应：
(1)准备工作
(a)从-20℃冰箱中取出SAP反应后384孔微量滴定板，4000rpm离心1min；
(b)取出iPLEX延伸反应试剂，试剂融化后，涡漩振荡20s后掌式离心机离心1min；
(2)配制iPLEX延伸反应，按下表配制：
(3)在384孔微量滴定板的每孔中加入iPLEX延伸反应混合物；
(4)全部加完后立即用封口膜封口，涡旋混匀微量滴定板；
(5)4000rpm离心样品板1min。
(6)反应程序
树脂纯化
用Spectro CHIP Arrays和Clean Resin试剂盒进行树脂纯化：
(1)准备工作
(a)从-20℃冰箱中取出iPLEX延伸反应后384孔微量滴定板，4000rpm离心1min。
(b)准备用于树脂纯化的384孔dimple板、刮刀、长匙、树脂和纯水；
(2)涂布树脂
(a)用长匙将约6mg树脂转移到384孔dimple板上；
(b)用刮刀来回刮动将树脂涂布于每个孔中；
(c)回收多余的树脂，在室温下放置约10min待树脂干燥；
(3)加水到384孔样品板
(a)撕开封口膜，在每孔加入16μl水，水加在管壁中间
(b)用封板膜封上样品板，离心样品板，4000rpm，30s；
(4)添加树脂到样品板
(a)撕去封口膜；
(b)将样品板轻轻地倒放于dimple板上，固定在一起，轻轻地颠倒，使得树脂倒入样品板；
(c)轻拍dimple板确保所有树脂掉下来；
(5)旋转、离心iPLEX反应产物
(a)室温下，在混旋仪上旋转样品板60min，沿着长轴旋转360°；
(b)3200rpm离心样品板5min。
质谱上机
(1)准备工作
(a)检查质谱仪状态和芯片使用情况；
(b)编辑分析程序：将质谱前PCR反应和延伸反应的引物序列信息按Sequenom 公司软件要求录入；
(c)编辑反应板：录入每个反应孔对应的样本。
(2)点芯片
(a)50％的乙醇清洗仪器；
(b)根据芯片使用情况和所编辑的反应板的位置，编辑mapping文件；
(c)选择合适的点样条件点芯片；
(3)将编辑的反应板信息与质谱仪信息联系起来；
(4)质谱分析和输出检测报告。
四、检测结果
对不同型别不同稀释度的登革病毒样本，I型2份(10-1、10-3)，II型3份 (10-1、10-3、10-5)，III型3份(10-1、10-3、10-5)，IV型3份(10-3、10-4、10-6)，进行检测评估该反应体系的特异性、灵敏度、重复性性能。
经11份标本检测全部为阳性(见表4和图2-图 13)。I-III型均有双探针阳性，IV型为4-1探针阳性，SNP探针2型10-1A，3型10-1T均被正确检出，均与预期结果完全一致。各型探针之间未见有任何交叉反应或交错检出，特异性高。通用引物SNP位点分型，在II型和III型的高载量样本中成功正确分型。其中III型10-1标本，达到三探针同时检出阳性，从而奠定了三靶基因分型检测法。在I、II、 IV型标本中检出伊蚊28s阳性，人RnaseP均为阴性，表明本批标本的I、II、 IV型源自于伊蚊，而非人源，III型标本来源未定。
本方法可以成功检出荧光定量PCR检测为IV型10-6的样本，II型10-5和III型 10-5标本，经从2ul放大至6ul样本检测后呈阳性，表明多重PCR-MS法与荧光定量PCR法灵敏度一致。
表4.质谱扫描登革病毒基因分型检测结果
注：本报告仅对本次受检样本负责。本测试结果仅供科研或流行病学调查使用，不作为临床诊断。
五、结论
本研究创建的11重PCR-MS质谱登革病毒双靶基因和SNP位点分型检测，具有高度特异性和高灵敏度。高重数PCR，且毋须荧光标记，具有低成本和高通量等优势，可用于登革病毒的快速检测、基因分型鉴定和样本溯源。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种登革病毒分型的测序引物、检测方法及试剂盒
<160> 33
<210> 1
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>1
ACGTTGGATGATAGAGGGTCCAGGCTGAAG
<210> 2
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>2
ACGTTGGATGCTGGCATATGTGGTGATAGG
<210> 3
<211> 核苷酸16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（16）
<223> 特异性探针
<400>3
CCCATCTCATTGGCTG
<210> 4
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>4
ACGTTGGATGTGAACACAAGTCAACATGGC
<210> 5
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>5
ACGTTGGATGATTGACCATGGATGAGGCTG
<210> 6
<211> 核苷酸21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（21）
<223> 特异性探针
<400>6
GCCTATCATGGATCATATGAG
<210> 7
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>7
ACGTTGGATGGGCAGCAGAGCCATATGGTA
<210> 8
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>8
ACGTTGGATGCTTCTCCTTCCACTCCACTC
<210> 9
<211> 核苷酸23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（23）
<223> 特异性探针
<400>9
AAGATCCATATGGTACATGTGGC
<210> 10
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>10
ACGTTGGATGCCTAATATCGTATGGAGGAG
<210> 11
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>11
ACGTTGGATGACCTGGACTTCTTCTCCTTC
<210> 12
<211> 核苷酸20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（20）
<223> 特异性探针
<400>12
TACTTCCTTCCATTCTCCTT
<210> 13
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>13
ACGTTGGATGATAACAACACTCTGGGAAGG
<210> 14
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>14
ACGTTGGATGATGTTCGCCATGGAAACAGC
<210> 15
<211> 核苷酸16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（16）
<223> 特异性探针
<400>15
TGGGAAGGATCACCTG
<210> 16
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>16
ACGTTGGATGCAATCCAACAGGTGAGAAGC
<210> 17
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>17
ACGTTGGATGCCTCCTTCCTGAATCTCTTC
<210> 18
<211> 核苷酸18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（18）
<223> 特异性探针
<400>18
CGAAGGCATGTAGTCCAG
<210> 19
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>19
ACGTTGGATGTGGGTTATTGGATAGAGAGC
<210> 20
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>20
ACGTTGGATGGGCCACAGACATGTTTTCAC
<210> 21
<211> 核苷酸20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（20）
<223> 特异性探针
<400>21
AGCTCAAAAAACCAGACCTG
<210> 22
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>22
ACGTTGGATGGGACTCCGGTGATGGAAATC
<210> 23
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>23
ACGTTGGATGTCGTGTATGACATTCCCTTG
<210> 24
<211> 核苷酸20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（20）
<223> 特异性探针
<400>24
GTATGTGTATATTGCAAGAC
<210> 25
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>25
ACGTTGGATGATACGCCTTTCAATATGCTG
<210> 26
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>26
ACGTTGGATGCAGCATTCCAAGTGAGAATC
<210> 27
<211> 核苷酸18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（18）
<223> 特异性探针
<400>27
TCGTTTACACGCGGTTTC
<210> 28
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>28
ACGTTGGATGAGTACCGTGAGGGAAAGTTG
<210> 29
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>29
ACGTTGGATGAATCGAGTTCAACGGGCTTG
<210> 30
<211> 核苷酸21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（21）
<223> 特异性探针
<400>30
AATAGAGAGTCAAAAAGTACG
<210> 31
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 上游引物
<400>31
ACGTTGGATGTGAGCGGCTGTCTCCACAAG
<210> 32
<211> 核苷酸30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（30）
<223> 下游引物
<400>32
ACGTTGGATGTGGCGGTGTTTGCAGATTTG
<210> 33
<211> 核苷酸14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（14）
<223> 特异性探针
<400>33
GAGCGGGTTCTGAC
Claims (7)
1.一种用于登革病毒分型检测的引物，其特征在于，包括：11个引物组，
第1引物组为：
正向序列：10mertag-ATAGAGGGTCCAGGCTGAAG，
反向序列：10mertag-CTGGCATATGTGGTGATAGG，
单碱基延伸引物序列：CCCATCTCATTGGCTG，
第2引物组为：
正向序列：10mertag-TGAACACAAGTCAACATGGC，
反向序列：10mertag-ATTGACCATGGATGAGGCTG，
单碱基延伸引物序列：GCCTATCATGGATCATATGAG，
第3引物组为：
正向序列：10mertag-GGCAGCAGAGCCATATGGTA，
反向序列：10mertag-CTTCTCCTTCCACTCCACTC，
单碱基延伸引物序列：AAGATCCATATGGTACATGTGGC，
第4引物组为：
正向序列：10mertag-CCTAATATCGTATGGAGGAG，
反向序列：10mertag-ACCTGGACTTCTTCTCCTTC，
单碱基延伸引物序列：TACTTCCTTCCATTCTCCTT，
第5引物组为：
正向序列：10mertag-ATAACAACACTCTGGGAAGG，
反向序列：10mertag-ATGTTCGCCATGGAAACAGC，
单碱基延伸引物序列：TGGGAAGGATCACCTG，
第6引物组为：
正向序列：10mertag-CAATCCAACAGGTGAGAAGC，
反向序列：10mertag-CCTCCTTCCTGAATCTCTTC，
单碱基延伸引物序列：CGAAGGCATGTAGTCCAG，
第7引物组为：
正向序列：10mertag-TGGGTTATTGGATAGAGAGC，
反向序列：10mertag-GGCCACAGACATGTTTTCAC，
单碱基延伸引物序列：AGCTCAAAAAACCAGACCTG，
第8引物组为：
正向序列：10mertag-GGACTCCGGTGATGGAAATC
反向序列：10mertag-TCGTGTATGACATTCCCTTG，
单碱基延伸引物序列：GTATGTGTATATTGCAAGAC，
第9引物组为：
正向序列：10mertag-ATACGCCTTTCAATATGCTG，
反向序列：10mertag-CAGCATTCCAAGTGAGAATC，
单碱基延伸引物序列：TCGTTTACACGCGGTTTC，
第10引物组为：
正向序列：10mertag-AGTACCGTGAGGGAAAGTTG，
反向序列：10mertag-AATCGAGTTCAACGGGCTTG，
单碱基延伸引物序列：AATAGAGAGTCAAAAAGTACG，
第11引物组为：
正向序列：10mertag-TGAGCGGCTGTCTCCACAAG，
反向序列：10mertag-TGGCGGTGTTTGCAGATTTG，
单碱基延伸引物序列：GAGCGGGTTCTGAC。
2.一种用于登革病毒检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的用于登革病毒分型检测的引物。
3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
10×PCR Buffer
MgCl2
dNTP
Primer Mix
hot star Taq polymerase。
4.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
5.权利要求2所述的试剂盒在检测登革病毒中的应用，所述的应用为非疾病诊断目的。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，用于登革病毒的基因分型或样本朔源。
7.一种登革病毒的检测方法，用于非疾病的诊断目的，包括以下步骤：
(1)样本中的RNA提取
使用商品化提取试剂盒，提取组织、细胞或血样中的RNA，-80℃储存备用；
(2)PCR扩增
其中所用引物如下：
以样本RNA反转录后cDNA为PCR模板进行PCR扩增，PCR扩增采用多重PCR技术,在多重PCR反应体系加入以上引物配制的引物混合物，将PCR反应板加入多重PCR反应体系和模板，放置于PCR仪上启动PCR反应；
(3)PCR产物碱性磷酸酶处理
在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP处理，以去除体系中游离的dNTPs；
(4)单碱基延伸
其中所用引物如下：
使用以下方法：配制单碱基延伸反应液，加入至SAP处理后的PCR产物，放置在PCR仪上，设定反应条件，启动PCR仪进行单碱基延伸反应；
(5)树脂纯化
将树脂平铺到树脂板中；加水到延伸产物的对应孔内；将树脂扣入延伸产物板中，封膜，低速旋转混匀30分钟，使树脂与反应物充分接触；离心；
(6)芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至SpectroCHIP芯片上；
(7)质谱检测
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER 4.0软件分析并输出结果。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202110694630.3A CN113913551B (zh) | 2021-06-22 | 2021-06-22 | 一种登革病毒分型的测序引物、检测方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110694630.3A CN113913551B (zh) | 2021-06-22 | 2021-06-22 | 一种登革病毒分型的测序引物、检测方法及试剂盒 |
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ID=79232762
Family Applications (1)
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- 2021-06-22 CN CN202110694630.3A patent/CN113913551B/zh active Active
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| CN113913551A (zh) | 2022-01-11 |
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