CN111334583B - 一种基于pcr-ms质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于PCR‑MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，过程包括：建立伊蚊种类鉴定基因数据库(COI，COII，28s，CytB400)、建立伊蚊种类鉴定DNA二维码、多重PCR‑MS引物设计及多重PCR‑MS质谱扫描；从九种伊蚊种类的数千条基因序列中，分析得到每个伊蚊种类特异性SNP位点。根据这些位点，对每个种类选用2个以上基因的特异性SNP位点，同时参考其它种类的特异性和非特异性位点作为排它法处理，设计分析软件通过对多个位点的碱基识别，确认其所属种类，提高了对伊蚊种类鉴别的准确度，避免了漏检。

Description

一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说是涉及一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法。
背景技术
蚊类能携带和传播多种病原微生物，精准鉴定蚊类对预防和控制蚊媒传染病有重要意义。白纹伊蚊和埃及伊蚊等伊蚊都是重要的蚊媒传染病传播媒介。白纹伊蚊在我国分布的范围较广，但随着环境条件变化及各地交通贸易的频繁，埃及伊蚊的分布范围也在逐渐扩大。准确鉴别白纹伊蚊和埃及伊蚊等伊蚊有利于更好地预防和控制蚊媒传染病。
目前，形态学鉴定是蚊类鉴定的主要手段，但对于不完整个体、幼虫等样本鉴定困难。DNA条形码技术，可以有效鉴定蚊类属种，不但费时、费力，而且严重依赖DNA测序。因此，需要发展新的蚊类鉴定方法。
PCR-MS质谱扫描技术，具有两大独特优势：不仅具有超高灵敏度，检测限≤10拷贝/反应；还同时具有超宽动态范围≥9个数量级。在单反应中确保几十个生物靶标，不论载量高低，从单个到千亿个分子，均可一次检出，由于检测通量高，采用双基因探针，能够有效避免漏检。目前，基于PCR-质谱扫描病原体技术已经成功用于人乳头瘤病毒双基因分型、冠状病毒、人肠道病毒等病原体分型检测。如能开发出伊蚊种类分型检测方法，对后续开展的蚊媒病原体检测，提供了同步检测的理想平台。
因此，如何提供一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明利用PCR-MS质谱扫描方法，从九种伊蚊种类的数千条基因序列中，分析得到每个伊蚊种类特异性SNP位点。根据这些位点，对每个种类选用2个以上基因的特异性SNP位点，同时参考其它种类的特异性和非特异性位点作为排它法处理，设计分析软件通过对多个位点的碱基识别，确认其所属种类，提高了对伊蚊种类鉴别的准确度，避免了漏检。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)建立伊蚊基因数据库：通过BOLDSYSTEMSDNA条形码数据库和 NCBI DNA数据库，获得伊蚊基因序列，包括COI、COⅡ、28s、CytB400基因；2)建立伊蚊DNA二维码：通过Sequencher5.3软件聚类分析伊蚊基因序列，选取种类特异性的单核苷酸多态性(SNP)为靶标，建立伊蚊DNA二维码分形图；3)多重PCR-MS引物设计：基于伊蚊DNA二维码分形图，使用
Figure BDA0002373146440000022
MassARRAY Assay Designer4.0软件，设计多重PCR特异性引物和探针；4)多重PCR-MS质谱扫描：提取待测伊蚊的基因组，并依次进行前 PCR反应、SAP酶处理、单碱基延伸和质谱分析，得出待检测伊蚊的具体种类。/>
以上技术方案达到的技术效果是：先从九种伊蚊种类的数千条基因序列中，分析得到每个伊蚊种类特异性SNP位点，然后针对每个靶点SNP设计一条延伸引物，在以ddNTPs为底物的体系中进行单碱基延伸，每个SNP的等位基因延伸产物仅为末端一个碱基的差异，以分子量为标记精确检测单点碱基，由此鉴别出四种不同种类的伊蚊；该方法相对于常规的测序方法，准确性高，且耗时短，
作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，以Complete PCR Reagent试剂盒进行前PCR扩增，PCR扩增的体系为：H2O HPLC grade 1.3μL、10×PCR Buffer含20mMMgCl2 0.5μL、25mM MgCl20.4μL、25mM dNTP mix 0.1μL、1μM Primer mix(所有的引物混合)0.5μL、5U/μLhot star Taq polymerase 0.2μL、总体积3.0μL；
Figure BDA0002373146440000021
Figure BDA0002373146440000031
作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，以Complete PCR Reagent试剂盒进行SAP酶消化，SAP酶处理的过程包括：
步骤一取出PCR反应产物，4000rpm离心l min；
步骤二取出SAP反应试剂，试剂融化后，涡漩振荡20秒后掌式离心机离心l min；
步骤三配制SAP反应MIX：H2O(autoclaved)1.53μL、10×SAP Buffer 0.17μL、1.7U/μLSAP enzyme 0.30μL，总体积2μL；
步骤四在384孔微量滴定板的每孔中加入2μL的SAP混合物，封口，混匀，并在4000rpm下离心1min；
步骤五将离心后的滴定板在37℃40min；85℃5min下孵育，然后4℃保存。
作为本发明优选的技术方案，以iPLEX Pro Reagent试剂盒进行延伸反应， iPLEX延伸反应过程如下：
步骤一取SAP反应产物，并在4000rpm下离心l min；
步骤二取出iPLEX延伸反应试剂，试剂融化后，振荡20s后掌式离心机离心1min；
步骤三配制iPLEX延伸反应体系：
H2O(HPLC级)0.619μL、10×iPLEX Buffer Plus 0.2μL、5μMiPLEX Terminationmix 0.2μL、33U/μL iPLEX Extend Primer mix 0.94μL、iPLEX Pro enzyme 0.04μL、总体积2μL；
步骤四在微量滴定板的每孔中加入iPLEX延伸反应混合物，封口、混匀，并在4000rpm下离心1min；
步骤五延伸，程序为：
Figure BDA0002373146440000032
作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，以Spectro CHIP Arrays和Clean Resin试剂盒进行树脂纯化，过程如下：
步骤一准备用于树脂纯化的dimple板、刮刀、长匙、树脂和纯水；步骤二涂布树脂；步骤三取iPLEX延伸反应产物，4000rpm离心1min，然后在每孔加入16μL水，封口，4000rpm离心30s；步骤四将步骤三所得样品板轻轻地倒放于dimple板上，使得树脂倒入样品板，并轻拍dimple板确保所有树脂掉下来，旋转、离心iPLEX反应产物。
作为本发明优选的技术方案，步骤二中涂布树脂的过程为：
(1)将约树脂转移到384孔dimple板上；
(2)用刮刀来回刮动将树脂涂布于每个孔中；
(3)回收多余的树脂，在室温下放置至树脂干燥。
作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，质谱的分析过程如下：
步骤一以50％的乙醇清洗仪器；步骤二根据芯片使用情况和所编辑的反应板的位置，编辑mapping文件；步骤三选择384孔板点样条件点芯片；步骤四将编辑的反应板信息与质谱仪信息联系起来(质谱激光扫描联用多重 PCR技术，是将多重PCR技术、质谱技术、芯片技术以及生物信息学方法结合于一体的技术。反应板跟质谱仪的信息对应是在电脑屏幕上操作的，这属于仪器操作SOP)；步骤五质谱分析和输出检测报告。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，在单碱基延伸过程中用两个及以上的SNP位点来识别一个种或者一个型别，根据每种种类的SNP位点设计探针，即UEP引物，当SNP位点与探针能够特异性结合时，可以对SNP 位点的单碱基进行延伸；而且，本发明中设计的UEP引物序列长度均不同，每种伊蚊种类对应特定的引物序列及分子量，即便扩增出来的碱基相同，扩增出来的序列长度也不同，进而分子量不同，根据分子量对伊蚊种类进行区分。
本发明从九种伊蚊种类的数千条基因序列中，分析得到每个伊蚊种类特异性SNP位点。根据这些位点，对每个种类选用2个以上基因的特异性SNP 位点，同时参考其它种类的特异性和非特异性位点作为排它法处理，设计分析软件通过对多个位点的碱基识别，确认其所属种类，提高了对伊蚊种类鉴别的准确度，避免了漏检。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的伊蚊DNA二维码分形图；
图2附图为本发明提供的检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1建立基因数据库
建立伊蚊基因数据库：通过BOLDSYSTEMS DNA条形码数据库和 NCBI_DNA数据库，共收集相关基因序列14,158条，详见表1。
表1
Figure BDA0002373146440000051
/>
Figure BDA0002373146440000061
实施例2建立伊蚊DNA二维码
经用Sequencher5.3软件聚类分析，选取种类特异性的单核苷酸多态性 (SNP)为靶标，建立伊蚊DNA二维码分型图，详见图1。
实施例3多重PCR-MS引物设计序列
使用
Figure BDA0002373146440000071
MassARRAY Assay Designer4.0软件，设计多重PCR特异性引物和探针，详见表2；
表2
Figure BDA0002373146440000072
/>
Figure BDA0002373146440000081
Figure BDA0002373146440000091
实施例4 iPLEX前PCR扩增
用Complete PCR Reagent试剂盒进行前PCR扩增：
1.准备工作
(1)采用已灭菌的双蒸水作为阴性对照；
(2)取出前PCR反应试剂，试剂融化后，漩涡振荡20s后离心；
2.MIX配制按下表3顺序加入
表3
Figure BDA0002373146440000092
3.在384孔微量滴定板的每孔中加入3μL的PCR混合物，加到管底；
4.每个样品吸取2μL，直接加到384孔板底部：
5.全部加完后立即用封口膜封口；
6.涡旋混匀微量滴定板；
7.离心微量滴定板，1000rpm离心l min；
8.热循环如下表4：
表4
Figure BDA0002373146440000093
9.离心384孔微量滴定板，在进行下步实验前置于-20℃保存。
实施例5 SAP酶消化
用Complete PCR Reagent试剂盒进行SAP酶消化：
1.准备工作
(1)从-20℃冰箱中取出前PCR反应后384孔微量滴定板，4000rpm离心l min；
(2)取出SAP反应试剂，试剂融化后，涡漩振荡20秒后掌式离心机离心l min。
2.配制SAP反应MIX，按下表配制：
表5
Figure BDA0002373146440000101
3.在384孔微量滴定板的每孔中加入2μL的SAP混合物；
4.全部加完后用Axygen封口膜封口，涡旋混匀微量滴定板；
5.离心样品板，4000rpm，l min；
6.样品板的孵育条件如下：37℃40min；85℃5min；4℃保存；
7.离心384孔微量滴定板，在进行下步实验前置于-20℃保存。
实施例6 iPLEX延伸反应
用iPLEX Pro Reagent试剂盒进行延伸反应：
1.准备工作
(1)从-20℃冰箱中取出SAP反应后384孔微量滴定板，4000rpm离心l min；
(2)取出iPLEX延伸反应试剂，试剂融化后，涡漩振荡20s后掌式离心机离心1min；
2.配制iPLEX延伸反应，按下表6配制:
表6
Figure BDA0002373146440000102
Figure BDA0002373146440000111
3.在384孔微量滴定板的每孔中加入iPLEX延伸反应混合物；
4.全部加完后立即用封口膜封口，涡旋混匀微量滴定板；
5. 4000rpm离心样品板lmin。
6.反应程序如表7所示；
表7
Figure BDA0002373146440000112
实施例7树脂纯化
用Spectro CHIP Arrays和Clean Resin试剂盒进行树脂纯化：
1.准备工作
(1)从-20℃冰箱中取出iPLEX延伸反应后384孔微量滴定板，4000rpm离心1min。
(2)准备用于树脂纯化的384孔dimple板、刮刀、长匙、树脂和纯水；
2.涂布树脂
(1)用长匙将约6mg树脂转移到384孔dimple板上；
(2)用刮刀来回刮动将树脂涂布于每个孔中；
(3)回收多余的树脂，在室温下放置约10min待树脂干燥；
3.加水到384孔样品板
(1)撕开封口膜，在每孔加入16μL水，水加在管壁中间
(2)用封板膜封上样品板，离心样品板，4000rpm，30s；
4.添加树脂到样品板
(1)撕去封口膜；
(2)将样品板轻轻地倒放于dimple板上，固定在一起，轻轻地颠倒，使得树脂倒入样品板；
(3)轻拍dimple板确保所有树脂掉下来；
5.旋转、离心iPLEX反应产物
(1)室温下，在混旋仪上旋转样品板60min，沿着长轴旋转360°；
(2)3200rpm离心样品板5min。
实施例8质谱上机
1.准备工作
(1)检查质谱仪状态和芯片使用情况；
(2)编辑分析程序：将质谱前PCR反应和延伸反应的引物序列信息按 Sequenom公司软件要求录入；
(3)编辑反应板：录入每个反应孔对应的样本。
2.点芯片
(1)50％的乙醇清洗仪器；
(2)根据芯片使用情况和所编辑的反应板的位置，编辑mapping文件；
(3)选择合适的点样条件点芯片；
3.将编辑的反应板信息与质谱仪信息联系起来；
4.质谱分析和输出检测报告；
结果
每种伊蚊种类采用两个以上基因的种类特异性SNP位点检测，通过2-3 个位点的碱基不同，双重确认其所属种类。详见图2。
本次收到四种伊蚊种类(埃及、白蚊、刺扰和背点)，总共400例，每种各100例。每个种类选取48例，共192例样本作首轮检测。其中埃及和白纹伊蚊为实验室已定性标本，刺扰和背点伊蚊为新采集未定性标本。首轮检测伊蚊阳性质控28s探针阳性率达98.95％(190/192)，在未定性标本中有2 例(刺扰CR28,29)未检出。四种伊蚊分型的阳性率分别为：埃及伊蚊97.9％ (47/48)，其中4例鉴定为白纹，不一致的鉴定结果以测序为金标准，经测序鉴定亦为白纹伊蚊；未检出1例(AJ19)，测序为埃及伊蚊,序列与设计相同无须改动。建议重做，注意加样量。白纹100％(48/48)，原分析软件辨识不确定的5例，经测序核实后，修改了判别指标，使之全部正确归类。刺扰伊蚊79.2％(38/48)，10例未分型。COⅠ的测序结果，有一半无法拼接或无结果。COⅡ测序序列98％相似，与但CR28,29两者测序不一致，且伊蚊质控28s探针未检出，上述相悖结果原因待查。背点伊蚊22.9％(11/48)，37 例未分型。以测序验证COⅠ序列，对PCR引物作了改进。对于COⅡ序列,原参考编辑序列仅1例，故对探针作了修改，详见表8。
表8
Figure BDA0002373146440000131
/>
Figure BDA0002373146440000141
/>
Figure BDA0002373146440000151
/>
Figure BDA0002373146440000161
/>
Figure BDA0002373146440000171
/>
Figure BDA0002373146440000181
/>
Figure BDA0002373146440000191
/>
Figure BDA0002373146440000201
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctttttttct ttacatttag ctggag 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggtatttga tctgyaatag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agtcagtttc craaycctcc 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttgatcatt tccaataaat attc 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agtcagtttc craaycctcc 20
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggtatttga tctgyaatag 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
taacatgggc tgttacaa 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggatcaggra caggrtgaac 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
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gtaataaaat ttactgcccc 20
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacagtttat ccccctc 17
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attaggagcc cctgatatag 20
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<212> DNA
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ccagttccag ayccrttttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
taatgaagga ggtaatattc aga 23
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctggaattac tttagaccg 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gctccagcta atacagggag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggaagagat aaaagtaata aaatag 26
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tagcaacagg atttttagg 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aactgcagcc cctcagaatg 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacaggattt ttaggatatg t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acaactcgat catgaagtgc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtggtaccgc cggataatac 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aacatccgaa aggatctgt 19
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tactaatcga tatttattac 20
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gcaggaagaa ttgttcaaa 19
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tatcgatatt tattacatgg acaaa 25
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ttcattcatg aactgttcc 19
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgctccacaa atttcrgaac 20
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccctggtcga ttaaatcaaa 20
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tactaatcga tattrattac 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaggaagaa ttgttcaaa 19
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatcgatatt tattacatgg acaa 24
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggtatttga tctgyaatag 20
<210> 44
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agtcagtttc craaycctcc 20
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<211> 19
<212> DNA
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aagcatgagc tgttacaat 19
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ggattccgtt tattagatg 19
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<211> 20
<212> DNA
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<212> DNA
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ggacatcaat gataytgaag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gtagcwgtwa ctaaayttcg 20
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
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ctctaataat cgaaatccat ttatat 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcattcatg aactgttcc 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgctccacaa atttcrgaac 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cagaagcatc aatttttaca c 21

Claims (7)

1.一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1）建立伊蚊基因数据库：通过BOLDSYSTEMSDNA条形码数据库和NCBI DNA数据库，获得伊蚊基因序列；
2）建立伊蚊DNA二维码：通过Sequencher5.3软件聚类分析伊蚊基因序列，选取种类特异性的单核苷酸多态性SNP为靶标，建立伊蚊DNA二维码分形图；
3）多重PCR-MS引物设计：基于伊蚊DNA二维码分形图，使用MassARRAY AssayDesigner4.0软件，设计多重PCR特异性引物和探针；所述多重PCR特异性引物和探针如SEQID NO.1~SEQ ID NO.54所示；
4）多重PCR-MS质谱扫描：提取待测伊蚊的基因组，并依次进行前PCR反应、SAP酶处理、单碱基延伸和质谱分析，得出待检测伊蚊的具体种类。
2.根据权利要求1所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，步骤4）中，以Complete PCR Reagent试剂盒进行前PCR扩增，PCR扩增的体系为：
试剂 体积
H2O HPLC grade 1.3µL
10×PCR Buffer含20mMMgCl2 0.5µL
25mM MgCl2 0.4µL
25mM dNTP mix 0.1µL
1µM Primer mix 0.5µL
5U/µLhot star Taq polymerase 0.2µL
总体积 3.0µL；
反应程序为：
Figure 103405DEST_PATH_IMAGE001
3.根据权利要求2所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，步骤4）中，以Complete PCR Reagent试剂盒进行SAP酶消化，SAP酶处理的过程包括：
步骤一取出PCR反应产物，4000rpm离心l min；
步骤二取出SAP反应试剂，试剂融化后，涡漩振荡20秒后掌式离心机离心l min；
步骤三配制SAP反应MIX：
试剂 体积
H2O 1.53µL
10×SAP Buffer 0.17µL
1.7U/µLSAP enzyme 0.30µL
总体积 2µL；
步骤四在384孔微量滴定板的每孔中加入2µL的SAP混合物，封口，混匀，并在4000rpm下离心1 min；
步骤五将离心后的滴定板在37℃ 40min；85℃ 5min下孵育，然后4℃保存。
4.根据权利要求3所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，以iPLEX Pro Reagent试剂盒进行延伸反应，iPLEX延伸反应过程如下：
步骤一取SAP反应产物，并在4000rpm下离心l min；
步骤二取出iPLEX延伸反应试剂，试剂融化后，振荡20s后掌式离心机离心1min；
步骤三配制iPLEX延伸反应体系：
试剂 体积
H2O 0.619µL
10×iPLEX Buffer Plus 0.2µL
5µMiPLEX Termination mix 0.2µL
33U/µL iPLEX Extend Primer mix 0.94µL
iPLEX Pro enzyme 0.04µL
总体积 2µL
步骤四在微量滴定板的每孔中加入iPLEX延伸反应混合物，封口、混匀，并在4000rpm下离心1min；
步骤五延伸，程序为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
5.根据权利要求4所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，步骤4）中，以Spectro CHIP Arrays和Clean Resin试剂盒进行树脂纯化，过程如下：
步骤一准备用于树脂纯化的dimple板、刮刀、长匙、树脂和纯水；
步骤二涂布树脂；
步骤三取iPLEX延伸反应产物，4000rpm离心1min，然后在每孔加入16µL水，封口，4000rpm离心30s；
步骤四将步骤三所得样品板倒放于dimple板上，使树脂倒入样品板，离心。
6.根据权利要求5所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，步骤二中涂布树脂的过程为：
（1）将树脂转移到384孔dimple板上；
（2）用刮刀来回刮动将树脂涂布于每个孔中；
（3）回收多余的树脂，在室温下放置至树脂干燥。
7.根据权利要求6所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，步骤4）中，质谱的分析过程如下：
步骤一以50%的乙醇清洗仪器；
步骤二根据芯片使用情况和所编辑的反应板的位置，编辑mapping文件；
步骤三选择384孔板点样条件点芯片；
步骤四将编辑的反应板信息与质谱仪信息联系起来；
步骤五质谱分析和输出检测报告。
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