CN105483124B - 蚊虫快速鉴定dna芯片及其鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种蚊虫快速鉴定DNA芯片及其鉴定方法，其特征在于所述方法采用ND2、COI和ITS2三个基因，设计专一性探针，通过DNA芯片上一系列的显色反应，肉眼即可对供试九种重要蚊虫进行种类鉴定。本发明提供的蚊虫快速鉴定芯片，可同时快速、准确地鉴定九种重要蚊虫，操作简单，在检验检疫和疾病预防控制等领域具有较好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及九种重要蚊虫的分子鉴定方法。
背景技术
蚊虫（mosquitoes）是“四害”之首，可传播黄热病、登革热等多种虫媒传染病。据报道，2014年因蚊传疾病而死亡的人数约有72.5万人之多。蚊虫属昆虫纲（Insecta）双翅目（Diptera）蚊科（Culicidae），目前全世界记录约3500多种。据世界健康组织统计，一只蚊虫可感染100多人。随着交通的日益便利化，蚊虫通过飞机、船舶等交通工具扩散至不同国家或地区并引起虫媒传染病暴发流行的风险日益增大。因此，如何正确、快速鉴定蚊虫种类成为疾病预防控制的重要工作。
传统上，可依靠蚊虫的形态学特征对其进行种类鉴定，但对于近缘种或姐妹种或虫体受损或特征脱落的蚊虫等，都可能导致无法正确判别种类或者消耗过多时间而影响疾病控制，因此一种可以准确、快速的蚊虫种类鉴别技术，将大大有助于防疫工作。
分子鉴定技术是以遗传物质DNA序列分析为依据来阐明物种间的差别，从分子水平上快速而准确地鉴别物种。它是分子生物学、计算机科学与传统分类学相结合的产物，作为一种崭新的分类学技术，极大弥补了传统形态学鉴定的缺陷，已引起越来越多生物学家们的重视。近年来，随着以PCR基础的DNA序列测定方法的建立和广泛使用，核糖体DNA（rDNA）的内转录间隔区（ITS）和线粒体DNA（mtDNA）的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）和NADHdehydrogenase II (ND2)等基因逐渐受到重视，并在蚊种的分子鉴定中得到广泛应用。
DNA芯片是在分子生物学基础上发展起来的一种分子鉴定的技术，它综合了其他分子鉴定方法，如随机扩增多态DNA（RAPD），限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）等的优势。利用专一性的探针和PCR产物结合，通过一系列的显色反应快速的达到鉴定物种。目前，对蚊种的鉴定大都集中在传统鉴定方法，分子鉴定方法也主要集中在少数几种姐妹种的鉴定或者比较费时间，主要采用单一基因（如仅采用COI或仅采用ITS2等），将三种不同基因结合通过设计专一性的探针和PCR产物反应来鉴定的方法至今未见报道，本发明提供了一种蚊虫快速鉴定DNA芯片及其鉴定方法，可用于同时鉴定九种重要蚊虫，操作简单，应用前景良好。
发明内容
本发明的目的在于提供九种蚊虫的三对简并引物序列和九种蚊虫专一性探针序列及其分子鉴定方法-DNA芯片技术。通过分子生物学方法获取九种蚊虫的三个特异基因：ND2、COI和ITS2，并通过对九种蚊虫针对这三段基因设计出该蚊种专一性的探针与多重PCR反应的产物结合，可实现对未知蚊种的快速鉴定。
为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
本发明所述的一种针对9种蚊虫三个特定基因(ND2、COI、ITS2)的PCR引物，其特征在于所述PCR引物序列分别为：
ND2-F：5’-GGRGCWTGAATAGGWTTAGAAATTAAT-3’
ND2-R: 5’-AAAWGGYGGTAATCCTCCTAAWGA-3’
COI-F: 5’-CAACAYTTATTYTGATTYTTTGG-3’
COI-R: 5’-YCCTAARAARTGTTGWGGRAA-3’
ITS2-5.8S: 5’-CGGYGGATCACTYGGCTC-3’
ITS2-28S: 5’-GTTRKTTTCTTTTCCTCCSC-3’。
九种重要蚊虫分别为：埃及伊蚊（Aedes aegypti）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）、骚扰阿蚊（Armigeressubalbatus）、致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）、骚扰库蚊（Culex molestus）、三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）、环带库蚊（Culex annulus）、中华按蚊（Anophelessinensis）和微小按蚊（Anopheles minimus）
本发明用于9种重要蚊虫快速鉴定芯片的专一性探针，其探针序列如下：
| 探针在芯片上位置 | 探针名称 | 探针序列 (5'-3') | 探针在芯片上位置 | 探针名称 | 探针序列 (5'-3') |
| A2 | Aae-ND2 | TTACTTTACAATTTTACTTTCAATA | D5 | Ctr-ND2 | CTATCCATATCAATTGTTTTATTG |
| A3 | Aae-COI | ATATAGTCCAGCCCTTC | D6 | Ctr-COI | AGGAGGACTAACTGGGGTTG |
| B2 | Aae-ITS2-1 | ATAGTCAGACGTGGTG | E5 | Ctr-ITS2-1 | GCCCACCACATGAACCGTAT |
| B3 | Aae-ITS2-2 | TGACACACCGCGGTTGATG | E6 | Ctr-ITS2-2 | GTCCGCCCACCACATGAAC |
| A4 | Aal-ND2 | TATAATTATTGGGGCATTTGGG | D7 | Can-ND2 | TAAACAATGAGTTGTTGTGAT |
| A5 | Aal-COI | CCCTGCACTTTTATGATCT | D8 | Can-COI | AGCCCACTTCCACTATGTGC |
| B4 | Aal-ITS2 | TGTGCCTCCCTCTCGGGGGTGT | E7 | Can-ITS2-1 | ACTCGTCATGAACCGTATCATA |
| B5 | Aal-ITS2 | TGGCCGGCGTGCCAGTCGTCGTC | E8 | Can-ITS2-2 | GTCCACTCGTCATGAAC |
| A6 | Asu-ND2 | CATTCAATAAATTATTCTATTAATTT | G2 | Asi-ITS2-3 | CAGTGATTGGTGCTGGTCACCA |
| A7 | Asu-COI | TACTTATAGACCAGCACTC | G3 | Asi-COI | ACAATAAATCCATCATGATTAAAGTA |
| B6 | Asu-ITS2-1 | AATCGCCACCACCCCC | H2 | Asi-ITS2-1 | GAAGTGGAAACGTGGACTTA |
| B7 | Asu-ITS2-2 | TCCATCATCCCAGATGTAG | H3 | Asi-ITS2-2 | TCGTCGACCCGCTTGCATTTAA |
| D1 | Cqu-ND2 | CTAGGAGGTCTTAATCAG | G4 | Ami-ITS2-3 | GTTTAAACCCGACCGATG |
| D2 | Cqu-ITS2-3 | TCTCTCACGCACGTCTCGTCACACG | G5 | Ami-COI | ACTATAAATCCAACTTGATTAAAAAT |
| E1 | Cqu-ITS2-1 | TGCGATCGATAGCGATA | H4 | Ami-ITS2-1 | CGTGAGCGCACTGTGCATCATTG |
| E2 | Cqu-ITS2-2 | TAGCGATAAGATAAACCCCCCCCC | H5 | Ami-ITS2-2 | GCGCACTGTGCATCATTGCGTGCA |
| D3 | Cmo-ND2 | GAGGTCTTAATCAGACTTC | A8 | ND2-Inc | ATAACTTGACAAAAAATTGCHCC |
| D4 | Cmo-ITS2-3 | TCTCTCACGCCGTCACGTCGTCGTC | H1 | COI-Inc | TATCWATAGGAGCTGTATTYGCTATTATAG |
| E3 | Cmo-ITS2-1 | GCGCATCGACAAGCGATA | H8 | ITS2-Inc | AATGTGAACTGCAGGACACATGAACACC |
| E4 | Cmo-ITS2-2 | CAAGCGATAAGATAAACCCCCATG |
所述Aae指埃及伊蚊，Aal指白纹伊蚊，Asu指骚扰阿蚊，Cqu指致倦库蚊，Cmo指骚扰库蚊，Ctr指三带喙库蚊，Can指环带库蚊，Asi指中华按蚊，Ami指微小按蚊，Inc指DR. ChipDIYTM 试剂盒的系统内部对照，ND2和COI为线粒体基因，ITS2为核基因。
本发明所述的蚊虫快速鉴定芯片，包括以上所述的九种蚊虫的专一性探针，其特征在于所述九种蚊虫的专一性探针固定在N3芯片上。
本发明所述的蚊虫快速鉴定芯片快速鉴定九种重要蚊虫的方法，包括如下：
1）从待测的蚊虫组织中分离提取DNA；
2）以该DNA为模板，将上述的三对基因（ND2、COI、ITS2）的PCR引物混合在一起进行多重PCR反应扩增出相应的基因片段，在5端都有生物素标记的三对基因的引物分别为：
ND2-F: 5’-GGRGCWTGAATAGGWTTAGAAATTAAT-3’
ND2-R: 5’-AAAWGGYGGTAATCCTCCTAAWGA-3’
COI-F: 5’-CAACAYTTATTYTGATTYTTTGG-3’
COI-R: 5’-YCCTAARAARTGTTGWGGRAA-3’
ITS2-5.8S: 5’-CGGYGGATCACTYGGCTC-3’
ITS2-28S: 5’-GTTRKTTTCTTTTCCTCCSC-3’；
3）将步骤2）制得的PCR产物加入到已固定有以上所述的九种蚊虫的专一性探针的由台湾晶宇生物科技实业股份有限公司生产的N3芯片；按DR.Chip DIYTM Kit试剂盒的方法进行反应，2 h后得到显色反应。若是九种蚊虫中的一种则芯片显色反应后会出现相应的矩阵探针点，若不是九种蚊虫中的一种则芯片显色反应不会全部出现该蚊种专一性的探针点。
所述芯片中的九种蚊虫的每一种均是由在N3芯片角落上的四个阳性对照探针点和自己专一性的四个探针点，ND2，COI探针各一个，两个ITS2探针。 其中，致倦库蚊和骚扰库蚊由于COI基因难以设计探针点，故其是由一个ND2探针点和三个ITS2探针点构成矩阵，而中华按蚊和微小按蚊由于ND2基因难以设计合适的探针点，故其是由一个COI探针点和三个ITS2探针点构成矩阵。矩阵中左上：ND2，右上：COI，左下：ITS2-1，右下：ITS2-2构成。
本发明所述的致倦库蚊和骚扰库蚊的专一性探针分别有7个，只有ITS2一个点可以区分两者。若出现E1这个探针点即为致倦库蚊，若出现E3这个探针点即为骚扰库蚊；当未知蚊虫不是所述九种蚊虫中的一种时，则A1这个点一定会出现，而完整矩阵的四个点不会出现。
本发明所述的三对基因的PCR引物按ND2-F：ND2-R：COI-F：COI-R：ITS2-5.8S：ITS2-28S体积比为1：1：1：1：0.5：0.5混合。
本发明上述九种重要蚊虫的专一性探针序列通过核酸固定仪固定在台湾晶宇生物科技实业股份有限公司生产的N3芯片上，具体步骤如下：
1）配制探针溶液，将合成后的九种重要蚊虫专一性探针与100μM 的2x探针溶液缓冲液以及双蒸水按体积比6:10:4配比混合，使探针的终浓度为30μM；
2）将配制好的探针溶液通过点片机（台湾晶宇生物科技实业股份有限公司）点在N3芯片上，当全部探针点完之后，通过核酸固定仪，用1.2J能量，将探针固定在芯片上；
3）用500μl的双蒸水清洗两次以及99.9%的无水乙醇清洗；将清洗好的芯片置于50℃的烘箱烘干待用；
4）将10μl PCR产物先置于PCR仪中在95℃下解链5 min后和200μl的杂合反应液（DR. Hyb Buffer）加入到N3芯片中，在46℃下，杂合反应器中以最大振速反应1 h；
5）将反应后的反应液倒掉，加入200μl DR.Chip DIYTM Kit试剂盒中提供的清洗缓冲液(wash buffer)清洗3次后，加入200μl 封闭缓冲液(blocking buffer)和0.2 μlStrep-AP反应30 min；
6）将反应后得溶液倒掉，加入200 μl的wash buffer清洗三次，在用检测缓冲液（detection buffer）清洗一次后，加入196μl的检测缓冲液（detection buffer）和4μl的NBT/BCIP反应5 min后，即可清晰看到探针固定的结果。
本发明如何看鉴定结果（参照图2）：1、未知蚊虫属于这九种中的一种：该芯片中九种蚊虫的每一种均是由在N3芯片角落上的四个阳性对照探针点（必须同时都出现）和自己专一性的四个探针点，（矩阵中左上：ND2，右上：COI，左下：ITS2-1，右下：ITS2-2）构成，其中，致倦库蚊和骚扰库蚊由于COI基因难以设计探针点，故其是由一个ND2探针点和三个ITS2探针点构成矩阵，而中华按蚊和微小按蚊由于ND2基因难以设计合适的探针点，故其是由一个COI探针点和三个ITS2探针点构成矩阵。此外，(1) 由于致倦库蚊和骚扰库蚊同属尖音库蚊复合组，亲缘关系非常近，因此这两种蚊虫的专一性探针分别有7个，只有ITS2一个点可以区分两者（见图2）。假如出现E1这个探针点即为致倦库蚊，假如出现E3这个探针点即为骚扰库蚊；(2) 由于中华按蚊和微小按蚊的ND2基因难以设计专一性的探针，在经过大量的探针筛选后，均不合适，故采用ITS2-3来代替ND2的位置；2、未知蚊虫不是这九种中的一种：A1这个点（系统正常的阳性对照点）一定会出现，其他三个阳性对照点不一定全部出现，而专一性的探针点也不是以矩阵的形式出现，由于序列的同源性，可能会出现某几个点，但是不会出现完整的矩阵的四个点。
本发明的优点：1）本发明采用三段特异性基因相结合，通过专一性探针，可同时实现九种重要蚊虫的准确鉴定；2）与传统的形态学鉴定方法和其他分子生物学方法相比，本发明大大缩短了鉴定时间。
附图说明
图1为九种蚊虫的单个基因进行PCR反应（A）和多重PCR反应（B）结果电泳胶图。编号说明如下：M：GM100-LC的DNA marker，Aae: Aedes aegypti（埃及伊蚊）; Aal: Aedes albopictus（白纹伊蚊）; Asu: Armigeres subalbatus（骚扰阿蚊）; Cqu: Culex quinquefasciatus（致倦库蚊）; Cmo: Culex molestus（骚扰库蚊）; Ctr: Culex tritaeniorhynchus（三带喙库蚊）; Can: Culex annulus（环带库蚊）; Asi: Anopheles sinensis（中华按蚊）; Ami: Anopheles minimus（微小按蚊）。N：阴性对照（未加模板DNA）。
图2为DNA芯片上的探针和九种蚊虫多重PCR产物杂合的图解及结果图。图中A为芯片上的显示结果位置图； B为用九种蚊种测试结果图。与开始设计的图中A的图解结果一致 ，缩写词同图1，其中N：表示没有加入多重PCR产物。
图3为野外采集九种蚊虫中的几种进行随机测试的DNA芯片鉴定结果图。图中：DN:斗南 GD：关渡 HL：花莲 KS：高雄 PT：屏东 TT：台东 TC：台中 YL：宜兰，缩写词同图1。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，仅在于说明本发明而不是限制本发明的范围。
具体实验的操作步骤
1）标本的收集
其中五种蚊虫（埃及伊蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊、致倦库蚊、骚扰库蚊均来自台湾中兴大学医学昆虫与病媒研究室饲养的品系），其他四种（三带喙库蚊、环带库蚊、中华按蚊、微小按蚊）均采集于台湾各地，种类在试验前已经权威专家鉴定。
2）引物的设计与合成
根据双翅目中三十多种的三段基因（ND2、COI、ITS2）序列的下载且通过VectorNTI 10.0软件的对其序列比对，设计出三对简并引物，引物的序列如下：
ND2-F：5’-GGRGCWTGAATAGGWTTAGAAATTAAT-3’
ND2-R: 5’-AAAWGGYGGTAATCCTCCTAAWGA-3’
COI-F: 5’-CAACAYTTATTYTGATTYTTTGG-3’
COI-R: 5’-YCCTAARAARTGTTGWGGRAA-3’
ITS2-5.8S: 5’-CGGYGGATCACTYGGCTC-3’
ITS2-28S: 5’-GTTRKTTTCTTTTCCTCCSC-3’
其中R=A/G ，Y=C/T(U)， K=G/T(U)，S=C/G，W=A/T(U)，
3）获得九种蚊虫特定基因的序列及专一性探针的设计
以步骤1）中提取的DNA为模板DNA，分别以三对简并引物进行PCR反应，其反应体系如下：
表1 九种蚊虫（ND2、COI、ITS2）基因的PCR反应体系（25μl）
表2 九种蚊虫三段基因PCR反应程序
获得九种蚊虫的三段基因序列后，通过Vector NTI 10.0软件对九种蚊种相同基因的序列进行比对，找到专一性探针片段，合成后通过DNA的芯片测试再筛选出可用专一性探针，经过大量的探针筛选后，确定可以使用的探针序列，见表4所述的九种重要蚊虫的专一性探针。
4）PCR扩增产物电泳检测。
取5μL PCR扩增产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳（电压100 V，电泳35 min）。溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱见附图1。图1为九种蚊虫的单个基因进行PCR反应（A）和多重PCR反应（B）结果的电泳胶图，编号说明如下：M：GM100-LC的DNA marker，Aae: Aedes aegypti（埃及伊蚊）; Aal: Aedes albopictus（白纹伊蚊）; Asu: Armigeres subalbatus（骚扰阿蚊）; Cqu: Culex quinquefasciatus（致倦库蚊）; Cmo: Culex molestus（骚扰库蚊）; Ctr: Culex tritaeniorhynchus（三带喙库蚊）; Can: Culex annulus（环带库蚊）;Asi: Anopheles sinensis（中华按蚊）; Ami: Anopheles minimus（微小按蚊）. N：阴性对照（没有加模板DNA）。
5）九种已知目标蚊虫和野外标本的测试
将筛选出来的探针序列通过核酸固定仪固定在DNA芯片（如：台湾晶宇生物科技實業（即实业）股份有限公司生产的N3芯片）上以备用（可保存一年以上），将九种已知目标蚊虫和野外采集获得并经形态鉴定的九种蚊虫中的任意几种分别进行多重PCR反应，其反应体系如下：
表3 九种蚊虫多重PCR反应体系（25μl）
其扩增程序和表2一样。获得多重PCR反应的产物后与固定在DNA芯片上的专一性探针进行杂合，通过显色反应出现点的位置。
（a）九种已知目标蚊虫的显色反应出现点的位置见图2。图2为DNA芯片上的探针和九种蚊虫多重PCR产物杂合的图解及结果图，图中A为芯片上的显示结果位置图； B为用九种蚊种测试的结果图，与开始设计的图中A的图解结果一致 ，缩写词同图1，其中N：表示没有加入多重PCR产物；从图2可以判断未知蚊虫的种类与形态学鉴定结果一致；如何看鉴定结果（参照图2）：1、未知蚊虫属于这九种中的一种：该芯片中的九种蚊虫的每一种均是由在N3芯片角落上的四个阳性对照探针点（必须同时都出现）和自己专一性的四个探针点，（矩阵中左上：ND2，右上：COI，左下：ITS2-1，右下：ITS2-2）构成。其中，致倦库蚊和骚扰库蚊由于COI基因难以设计探针点，故其是由一个ND2探针点和三个ITS2探针点构成矩阵，而中华按蚊和微小按蚊由于ND2基因难以设计合适的探针点，故其是由一个COI探针点和三个ITS2探针点构成矩阵。此外，(1) 由于致倦库蚊和骚扰库蚊同属尖音库蚊复合组，亲缘关系非常近，因此这两种蚊虫专一性探针分别有7个，只有ITS2一个点可以区分两者，见图2。假如出现E1这个探针点即为致倦库蚊，假如出现E3这个探针点即为骚扰库蚊；(2) 由于中华按蚊和微小按蚊的ND2基因难以设计专一性探针，在经过大量的探针筛选后，均不合适，故采用ITS2-3来代替ND2的位置；2、未知蚊虫不是九种中的一种：A1这个点（系统正常的阳性对照点）一定会出现，其他三个阳性对照点不一定全部出现，而专一性探针点也不是以矩阵形式出现，由于序列的同源性，可能会出现某几个点，但不会出现完整的矩阵的四个点。
（b）野外采集获得并经形态鉴定的九种蚊虫中的任意几种的显色反应出现点的位置见图3。图3是野外采集该九种蚊虫中的几种进行随机测试的DNA芯片鉴定结果图。图中：DN: 斗南；GD：关渡；HL：花莲；KS：高雄；PT：屏东；TT：台东；TC：台中；YL：宜兰，缩写词同图一注解。从图3可看出传统形态鉴定和芯片鉴定的结果一致。下方的标注是形态鉴定的结果，芯片上显示的结果和图下方的形态鉴定结果是一致的，其中有些芯片出现交叉（cross）的点，是由基因序列的同源性所引起。在自然界中物种的相似性，会导致设计的探针的片段是其他物种也会有反应的点，但不影响对结果的准确判读。
6）上述九种重要蚊虫的专一性探针序列通过核酸固定仪固定在DNA芯片（如：台湾晶宇生物科技實業（即实业）股份有限公司生产的N3芯片）上的具体操作方法如下：
1、配制探针溶液，将合成回来的探针序列与100μM 的2x探针溶液缓冲液（试剂盒中提供）以及双蒸水按重量比6:10:4配比混合，使探针的终浓度为30μM；
2、将配制好的探针溶液通过点片机（台湾晶宇生物科技實業（即实业）股份有限公司）点在N3芯片上，当全部探针点完之后，通过核酸固定仪（1.2J能量）将探针固定在芯片上；
3、用500μl的双蒸水清洗两次（停留5-6 min）以及99.9%的无水乙醇清洗（30 s）；将清洗好的芯片置于50℃的烘箱烘干待用；
4、将10μl PCR产物（先置于PCR仪中在95℃下解链5 min后）和200μl的杂合反应液加入到N3芯片中，在46℃下，杂合反应器中以最大振速反应1 h；
5、将反应后的反应液倒掉，加入200μl DR.Chip DIYTM Kit试剂盒中提供的washbuffer(清洗缓冲液)清洗3次后，加入200μl blocking buffer(封闭缓冲液)和0.2μlStrep-AP反应30 min；
6、将反应后得溶液倒掉，加入200μl的wash buffer清洗三次，在用detectionbuffer（检测缓冲液）清洗一次后，加入196μl的detection buffer和4μl的NBT/BCIP反应5min后，即可清晰看到固定的结果。
上述九种重要蚊虫的专一性探针，其序列见表4：
表4 九种蚊虫专一性探针的位置、名称及序列
| 探针在芯片上位置 | 探针名称 | 探针序列 (5'-3') | 探针在芯片上位置 | 探针名称 | 探针序列 (5'-3') |
| A2 | Aae-ND2 | TTACTTTACAATTTTACTTTCAATA | D5 | Ctr-ND2 | CTATCCATATCAATTGTTTTATTG |
| A3 | Aae-COI | ATATAGTCCAGCCCTTC | D6 | Ctr-COI | AGGAGGACTAACTGGGGTTG |
| B2 | Aae-ITS2-1 | ATAGTCAGACGTGGTG | E5 | Ctr-ITS2-1 | GCCCACCACATGAACCGTAT |
| B3 | Aae-ITS2-2 | TGACACACCGCGGTTGATG | E6 | Ctr-ITS2-2 | GTCCGCCCACCACATGAAC |
| A4 | Aal-ND2 | TATAATTATTGGGGCATTTGGG | D7 | Can-ND2 | TAAACAATGAGTTGTTGTGAT |
| A5 | Aal-COI | CCCTGCACTTTTATGATCT | D8 | Can-COI | AGCCCACTTCCACTATGTGC |
| B4 | Aal-ITS2 | TGTGCCTCCCTCTCGGGGGTGT | E7 | Can-ITS2-1 | ACTCGTCATGAACCGTATCATA |
| B5 | Aal-ITS2 | TGGCCGGCGTGCCAGTCGTCGTC | E8 | Can-ITS2-2 | GTCCACTCGTCATGAAC |
| A6 | Asu-ND2 | CATTCAATAAATTATTCTATTAATTT | G2 | Asi-ITS2-3 | CAGTGATTGGTGCTGGTCACCA |
| A7 | Asu-COI | TACTTATAGACCAGCACTC | G3 | Asi-COI | ACAATAAATCCATCATGATTAAAGTA |
| B6 | Asu-ITS2-1 | AATCGCCACCACCCCC | H2 | Asi-ITS2-1 | GAAGTGGAAACGTGGACTTA |
| B7 | Asu-ITS2-2 | TCCATCATCCCAGATGTAG | H3 | Asi-ITS2-2 | TCGTCGACCCGCTTGCATTTAA |
| D1 | Cqu-ND2 | CTAGGAGGTCTTAATCAG | G4 | Ami-ITS2-3 | GTTTAAACCCGACCGATG |
| D2 | Cqu-ITS2-3 | TCTCTCACGCACGTCTCGTCACACG | G5 | Ami-COI | ACTATAAATCCAACTTGATTAAAAAT |
| E1 | Cqu-ITS2-1 | TGCGATCGATAGCGATA | H4 | Ami-ITS2-1 | CGTGAGCGCACTGTGCATCATTG |
| E2 | Cqu-ITS2-2 | TAGCGATAAGATAAACCCCCCCCC | H5 | Ami-ITS2-2 | GCGCACTGTGCATCATTGCGTGCA |
| D3 | Cmo-ND2 | GAGGTCTTAATCAGACTTC | A8 | ND2-Inc | ATAACTTGACAAAAAATTGCHCC |
| D4 | Cmo-ITS2-3 | TCTCTCACGCCGTCACGTCGTCGTC | H1 | COI-Inc | TATCWATAGGAGCTGTATTYGCTATTATAG |
| E3 | Cmo-ITS2-1 | GCGCATCGACAAGCGATA | H8 | ITS2-Inc | AATGTGAACTGCAGGACACATGAACACC |
| E4 | Cmo-ITS2-2 | CAAGCGATAAGATAAACCCCCATG |
备注：Aae:埃及伊蚊，Aal:白纹伊蚊，Asu：骚扰阿蚊，Cqu:致倦库蚊，Cmo:骚扰库蚊，Ctr:三带喙库蚊，Can:环带库蚊，Asi:中华按蚊，Ami：微小按蚊，Inc:内部对照。ND2、COI为线粒体基因，ITS2为核基因，根据它们的序列设计专一性的探针，故以此命名。
Claims (8)
1.一种针对9种蚊虫三个特定基因ND2、COI、ITS2的PCR引物，其特征在于所述PCR引物序列分别为：
ND2-F：5’-GGRGCWTGAATAGGWTTAGAAATTAAT-3’
ND2-R: 5’-AAAWGGYGGTAATCCTCCTAAWGA-3’
COI-F: 5’-CAACAYTTATTYTGATTYTTTGG-3’
COI-R: 5’-YCCTAARAARTGTTGWGGRAA-3’
ITS2-5.8S: 5’-CGGYGGATCACTYGGCTC-3’
ITS2-28S: 5’-GTTRKTTTCTTTTCCTCCSC-3’；
九种重要蚊虫分别为：埃及伊蚊（Aedes aegypti）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）、骚扰阿蚊（Armigeressubalbatus）、致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）、骚扰库蚊（Culex molestus）、三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）、环带库蚊（Culex annulus）、中华按蚊（Anophelessinensis）和微小按蚊（Anopheles minimus）。
2.一种用于9种重要蚊虫快速鉴定芯片的专一性探针，其探针序列如下：
所述Aae指埃及伊蚊，Aal指白纹伊蚊，Asu指骚扰阿蚊，Cqu指致倦库蚊，Cmo指骚扰库蚊，Ctr指三带喙库蚊，Can指环带库蚊，Asi指中华按蚊，Ami指微小按蚊，Inc指DR. ChipDIYTM 试剂盒的系统内部对照，ND2和COI为线粒体基因，ITS2为核基因。
3.一种蚊虫快速鉴定芯片，包括权利要求2所述的九种蚊虫的专一性探针，其特征在于所述九种蚊虫的专一性探针固定在N3芯片上。
4.一种蚊虫快速鉴定芯片快速鉴定九种重要蚊虫的方法，包括如下：
1）从待测的蚊虫组织中分离提取DNA；
2）以该DNA为模板，将权利要求1所述的三对基因ND2、COI、ITS2的PCR引物混合在一起进行多重PCR反应扩增出相应的基因片段，在5’端都有生物素标记的三对基因的引物分别为：
ND2-F: 5’-GGRGCWTGAATAGGWTTAGAAATTAAT-3’
ND2-R: 5’-AAAWGGYGGTAATCCTCCTAAWGA-3’
COI-F: 5’-CAACAYTTATTYTGATTYTTTGG-3’
COI-R: 5’-YCCTAARAARTGTTGWGGRAA-3’
ITS2-5.8S: 5’-CGGYGGATCACTYGGCTC-3’
ITS2-28S: 5’-GTTRKTTTCTTTTCCTCCSC-3’；
3）将步骤2）制得的PCR产物加入到已固定有权利要求2所述的九种蚊虫的专一性探针的由台湾晶宇生物科技实业股份有限公司生产的N3芯片；按DR.Chip DIYTM Kit试剂盒的方法进行反应，2 h后得到显色反应；若是九种蚊虫中的一种则芯片显色反应后会出现在N3芯片角落上的四个阳性对照探针点和自己专一性的四个探针点，若不是九种蚊虫中的一种则芯片显色反应不会全部出现该蚊种专一性的探针点。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：芯片中的九种蚊虫的每一种均是由在N3芯片角落上的四个阳性对照探针点和自己专一性的四个探针点，ND2，COI探针各一个，两个ITS2探针；其中，致倦库蚊和骚扰库蚊由于COI基因难以设计探针点，故其是由一个ND2探针点和三个ITS2探针点构成矩阵，而中华按蚊和微小按蚊由于ND2基因难以设计合适的探针点，故其是由一个COI探针点和三个ITS2探针点构成矩阵；矩阵中左上：ND2，右上：COI，左下：ITS2-1，右下：ITS2-2构成。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：(1) 致倦库蚊和骚扰库蚊的专一性探针分别有7个，只有ITS2一个点可以区分两者；若出现E1这个探针点即为致倦库蚊，若出现E3这个探针点即为骚扰库蚊；(2) 当未知蚊虫不是所述九种蚊虫中的一种时，则A1这个点一定会出现，而完整矩阵的四个点不会出现。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述的三对基因的PCR引物按ND2-F：ND2-R：COI-F：COI-R：ITS2-5.8S：ITS2-28S体积比为1：1：1：1：0.5：0.5混合。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：上述九种重要蚊虫的专一性探针序列通过核酸固定仪固定在台湾晶宇生物科技实业股份有限公司生产的N3芯片上，具体步骤如下：
1）配制探针溶液，将合成后的九种重要蚊虫专一性探针分别与100μM 的2x探针溶液缓冲液以及双蒸水按体积比6:10:4配比混合，使探针的终浓度为30μM；
2）将配制好的探针溶液通过台湾晶宇生物科技实业股份有限公司生产的点片机点在N3芯片上，当全部探针点完之后，通过核酸固定仪，用1.2J能量，将探针固定在芯片上；
3）用500μl的双蒸水清洗两次以及99.9%的无水乙醇清洗；将清洗好的芯片置于50℃的烘箱烘干待用；
4）将10μl PCR产物先置于PCR仪中在95℃下解链5 min后和200μl的杂合反应液DR.Hyb Buffer加入到N3芯片中，在46℃下，杂合反应器中以最大振速反应1 h；
5）将反应后的反应液倒掉，加入200μl DR.Chip DIYTM Kit试剂盒中提供的清洗缓冲液wash buffer清洗3次后，加入200μl 封闭缓冲液blocking buffer和0.2 μl Strep-AP反应30 min；
6）将反应后得溶液倒掉，加入200 μl的wash buffer清洗三次，在用检测缓冲液detection buffer清洗一次后，加入196μl的检测缓冲液detection buffer和4μl的NBT/BCIP反应5 min后，即可清晰看到探针固定的结果。
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20180828 |