CN108192986B - 以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊nd5基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种物种鉴定领域，是一种以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊鉴别试剂盒，其特点是根据淡色库蚊和致倦库蚊ND5基因序列设计通用引物，利用优化的高分辨率熔解曲线反应体系鉴别淡色库蚊和致倦库蚊各种形态如成虫、卵、幼虫和蛹等。能对淡色库蚊和致倦库蚊进行鉴别，操作简单、速度快、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作。

Description

以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊ND5基因 鉴别试剂盒及其鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊鉴别试剂盒及其鉴别方法。属于生物医药技术领域。
背景技术
口岸蚊类种群鉴定主要手段为形态学鉴定，依靠有形态学鉴定经验和蚊类形态鉴定能力的口岸检验检疫人员，根据医学蚊类分类检索表进行鉴定。然而，形态学鉴定面临很多问题：蚊类专业鉴定人才少，人员培养周期长；鉴定人员的经验程度、专业水平、蚊类完整性与发育阶段等因素可导致鉴定周期长，效率低；一些复杂的种群如近缘种群和同形种群难以鉴定；对于蚊类卵、幼虫和蛹，为获取其可靠鉴定特征，经常需要蚊类人工培养后鉴定；口岸送检蚊类若数量较大，对口岸蚊类鉴定工作是非常大的考验；等等。因而，口岸蚊类鉴定除了提高检疫人员鉴定能力和研发鉴定辅助系统外，仍需要发展安全、快速、准确、灵敏的鉴定方法，以实现蚊类快速鉴定。
近年来，随着分子生物学技术的发展，常规PCR、限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、单链构象多态性（SSCP）、DNA条形码技术等分子手段已经应用于蚊类种群鉴定。然而，这些鉴定方法均有不足之处：常规检测特异PCR产物序列，依赖于较贵的分子探针或产物测序；RFLP鉴定蚊种不仅耗时，而且需要大量样本；RAPD鉴定蚊种快速，但结果不稳定，且有时不可重复；SSCP只能作为检测蚊类基因突变的方法，要确定突变的位置和类型，需进一步测序，且电泳条件要求比较严格；DNA条形码技术的后续测序工作耗时、耗经费。鉴于上述方法的不足，为了安全、快速、准确、灵敏的实现蚊类种群的分子鉴定，需要探寻新的分子鉴定手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊鉴别试剂盒和方法，可作为淡色库蚊和致倦库蚊新的鉴别手段。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明根据淡色库蚊和致倦库蚊ND5基因的序列，设计合成了一组通用引物，序列如下：
ND5-F：5’-GATCAAATTCAAAATTAGCTC-3’。
ND5-R：5’-CAAATTCCTTTTTCTTCATGATT-3’。
根据上述引物，本发明提供了一种以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊鉴别试剂盒，其特征是，它包括如下组分：
1）淡色库蚊和致倦库蚊ND5基因的通用引物
ND5-F：5’-GATCAAATTCAAAATTAGCTC-3’。
ND5-R：5’-CAAATTCCTTTTTCTTCATGATT-3’。
2）PCR混合液：FastStart Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料。
3）淡色库蚊和致倦库蚊基因组。
4）ddH2O。
5）25 mM MgCl2。
其中，所述的反应缓冲液为PCR buffer (10X) (PCR反应缓冲液)，为本领域常见的商品化缓冲液。
利用上述试剂盒，本发明还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊鉴别方法，其特征是，它包括如下步骤：
1）提取淡色库蚊和致倦库蚊基因组DNA
使用电动匀浆器低温研磨淡色库蚊和致倦库蚊组织。使用TaKaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒说明提取淡色库蚊和致倦库蚊基因组DNA。
2）高分辨率熔解曲线反应体系：
30μL反应体系包括：ND5-F 0.6 μL（10 μm工作浓度），ND5-R 0.6 μL（10 μm工作浓度），模板2 μL，反应缓冲液3 μL，FastStart Taq DNA聚合酶0.5 μL，dNTP混合液2 μL，MgCl2 3.6 μL，ResoLight饱和荧光染料 1μL，ddH2O 16.7 μL。
3）高分辨率熔解曲线反应程序：
94℃预变性5 min。94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。
PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用LightCycler® 480 GeneScanning Software 软件分析高分辨率熔解曲线。
本发明的一种以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊鉴别试剂盒及操作方法，根据淡色库蚊和致倦库蚊ND5基因序列设计通用引物，可对淡色库蚊和致倦库蚊的成虫、卵、幼虫和蛹进行鉴别，与现有鉴别手段相比，本发明的有益效果在于：
1）可对淡色库蚊和致倦库蚊的各种状态进行鉴别，如成虫、卵、幼虫和蛹等状态，不需要孵化后鉴别。
2）本发明设计的引物，灵敏度高，特异性强。
3）操作简单、速度快，当天即可出具结果。
4）PCR 产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1：致倦库蚊和淡色库蚊ND5的PCR结果图，其中，M：DL2000，1致倦库蚊，2淡色库蚊。
图2：致倦库蚊ND5基因相对于淡色库蚊ND5基因的高分辨率熔解曲线图。横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度，其中有波动的曲线为致倦库蚊，直线的为淡色库蚊。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明作进一步描述。
本发明的一种以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊鉴别试剂盒，包括如下体系：
1）淡色库蚊和致倦库蚊ND5基因的通用引物
ND5-F：5’-GATCAAATTCAAAATTAGCTC-3’。
ND5-R：5’-CAAATTCCTTTTTCTTCATGATT-3’。
2）PCR混合液：FastStart Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料。
3）淡色库蚊和致倦库蚊基因组
4）ddH2O
5）25 mM MgCl2。
本发明还提供了一种以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊鉴别方法，按如下的步骤进行：
实例1：利用高分辨率熔解曲线鉴别淡色库蚊和致倦库蚊：
1）使用电动匀浆器低温研磨淡色库蚊和致倦库蚊组织。使用TaKaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒说明提取淡色库蚊和致倦库蚊基因组DNA。
2）30μL高分辨率熔解曲线反应体系包括：ND5-F 0.6 μL（10 μm工作浓度），ND5-R0.6 μL（10 μm工作浓度），模板2 μL，反应缓冲液3 μL，FastStart Taq DNA聚合酶0.5 μL，dNTP混合液2 μL，MgCl2 3.6 μL，ResoLight饱和荧光染料 1μL，ddH2O 16.7 μL。
3）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性5 min。94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用LightCycler® 480 Gene Scanning Software 软件分析高分辨率熔解曲线。
4）结果：淡色库蚊和致倦库蚊ND5 PCR均扩增出条带，片段大小为214bp，基因测序并用NCBI Blast比对，比对结果为相对应的淡色库蚊和致倦库蚊。利用LightCycler® 480Gene Scanning Software 软件分析高分辨率熔解曲线，发现淡色库蚊和致倦库蚊的曲线差异明显，可有效区分。
5）结论：本发明首次利用高分辨熔解曲线鉴别淡色库蚊和致倦库蚊，拓展了蚊类鉴定的视角。本发明利用基于淡色库蚊和致倦库蚊ND5基因的高分辨熔解曲线也是蚊种鉴定的一个新方向。本试剂盒操作简单、速度快、PCR 产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作，可对淡色库蚊和致倦库蚊的各种状态进行鉴别，如成虫、卵、幼虫和蛹等状态，不需要孵化后鉴别。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东国际旅行卫生保健中心
<120> 以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊ND5基因鉴别试剂盒及其鉴别方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatcaaattc aaaattagct c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaattcctt tttcttcatg att 23

Claims (1)

1.以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊ND5基因鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）提取淡色库蚊和致倦库蚊基因组DNA；
2）高分辨率熔解曲线反应体系：
30μL反应体系包括：工作浓度为10 μm 的ND5-F 0.6 μL，工作浓度为10 μm 的ND5-R0.6 μL，模板2 μL，反应缓冲液3 μL，FastStart Taq DNA聚合酶0.5 μL，dNTP混合液2 μL，MgCl2 3.6 μL，ResoLight饱和荧光染料 1μL，ddH2O 16.7 μL；
ND5-F和ND5-R序列如下：
ND5-F：5’-GATCAAATTCAAAATTAGCTC-3’；
ND5-R：5’-CAAATTCCTTTTTCTTCATGATT-3’；
3）高分辨率熔解曲线反应程序：
94℃预变性5 min；94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；
PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线；95℃变性1min；40℃降温1min；65-95℃连续升温，每次升温1℃，收集25个荧光信号；40℃冷却10s；使用LightCycler® 480 GeneScanning Software 软件分析高分辨率熔解曲线；横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度，其中有波动的曲线为致倦库蚊，直线的为淡色库蚊。
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DNA条形码在媒介蚊类鉴定中的应用;方义亮；高博；王宇平；等;《中国人兽共患病学报》;20121231;第29卷(第10期);第1012页右栏第2段 *
Rapid and high throughput molecular identification of diverse mosquito species by high resolution melting analysis;Ajamma, Yvonne Ukamaka; Mararo, Enock; Omondi, David; 等.;《F1000Research》;20160811(第5期);摘要，第5页左栏第2段和右栏第1段，第6页左栏第1段 *
应用气相色谱法鉴别淡色库蚊与致倦库蚊;崔可伦；王木森；冼伟立；等;《动物分类学报》;19911231;第16卷(第4期);摘要 *

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