CN104946769B - 肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒 - Google Patents

肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒，属于微生物检测技术领域，该试剂盒含有2对特异性引物对和2条与引物对配合使用的探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1‑6所示，采用双重荧光定量PCR方法实现对肺炎支原体快速检测和基因分型，检测灵敏度为3CFU，基因分型的准确度与常用的基因分型方法吻合率达到100％，分型的灵敏度远高于常用的培养依赖的分型技术，极大的缩短了分型时间，做到样本中肺炎支原体检测的同时还可进行基因分型，克服了目前肺炎支原体分型方法灵敏度低，耗费费力，成本较高的缺点，具有良好的实际标本检测及分型能力，适于推广应用。

Description

肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体的说涉及一种肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是引起人类呼吸道感染的重要病原菌之一，每年约有10％-40％的社区获得性肺炎是由其感染所引起的。荧光PCR检测技术凭借其快速、高灵敏度和特异度的优势，逐渐成为肺炎支原体感染检测的金标准，逐渐在临床检验及科研工作中广泛使用。在检测的基础上对肺炎支原体进行基因分型是深入了解其抗原变异，进行菌株流行暴发预警预测的重要监测手段。研究发现，肺炎支原体在基因水平上可分成1型和2型两种基因型菌株，目前所报道的几种变异型菌株(V1型，V2a-2d型变异菌株)均为两种型别菌株经同源重组造成p1基因序列上的部分碱基差异。从全基因组水平分析，变异型菌株仍然属于其对应的两种基因型菌株。目前最常用的肺炎支原体基因分型技术主要有PCR-RFLP方法(参考文献：Sasaki T,Kenri T,Okazaki N,etal.1996.Epidemiological study of Mycoplasma pneumoniae infections in japanbased on PCR-restriction fragment length polymorphism of the P1cytadhesingene.J Clin Microbiol.34:447-449.)，荧光PCR熔链曲线分析法(参考文献：SchwartzSB,Mitchell SL,Thurman KA,et al.2009.Identification of P1variants ofMycoplasma pneumoniae by use of high-resolution melt analysis.J ClinMicrobiol.47:4117-4120.)，p1基因多重PCR分型法(参考文献：Kenri T,Taniguchi R,Sasaki Y,et al.1999.Identification of a new variable sequence in theP1cytadhesin gene of Mycoplasma pneumoniae:evidence for the generation ofantigenic variation by DNA recombination between repetitive sequences.InfectImmun.67:4557-4562.)，p1基因测序分析法(参考文献：Zhao F,Cao B,Li J,etal.2011.Sequence analysis of the p1adhesin gene of Mycoplasma pneumoniae inclinical isolates collected in Beijing in 2008to 2009.J Clin Microbiol.49:3000-3003.)。几种方法均可将肺炎支原体分为1型和2型两种基因型，分型结果一致。基因分型是对于肺炎支原体感染进行流行病学溯源的重要技术手段，对于肺炎支原体感染的疫情控制有重要作用。同时，基因型别的检测与监测也是对肺炎支原体暴发流行预警预测的重要依据。
目前报道的上述常用肺炎支原体分型技术虽然已广泛使用，但是其存在着明显的缺陷：这些方法均依赖于肺炎支原体的分离培养，即均需要从标本中分离到肺炎支原体菌株后，再经纯培养提取的高浓度肺炎支原体基因组DNA后才可以进行基因分型，普通的临床标本中的肺炎支原体核酸量不足以支持用上述的分型方法来检测。这种情况造成了目前肺炎支原体的检测技术与分型技术严重脱节的现状：标本经过核酸提取通过荧光PCR技术进行肺炎支原体快速检测(1小时可获得检测结果)，但是其分型却首先需要对标本进行肺炎支原体菌株分离培养，培养阳性的标本再进行核酸提取后才能使用常用分型方法进行检测(平均2周才可获得分型结果)，且肺炎支原体标本培养十分困难，阳性率低，造成许多荧光PCR检测阳性标本由于无法分离培养出菌株不能进行分型检测，使得分型结果存在一定程度上偏倚。这种肺炎支原体检测与基因分型检测灵敏度不一致，检测时限不同步的现状严重制约了肺炎支原体研究的发展。
发明内容
本发明目的在于提供一种能够对肺炎支原体快速检测、快速进行基因分型的试剂盒。
本发明通过对28株肺炎支原体全基因测序株序列比对分析(其中8株NCBI数据库中菌株；20株为临床分离株)，寻找到肺炎支原体1型菌株和2型菌株特异的核苷酸序列，其中1型菌株基因组中一段长约3kbp的序列特异核苷酸片段，对应M129(GenBank:U00089.2)测序菌株(1型菌株)基因mpn457-459；以及2型菌株基因组中一段长约5kbp的序列特异核苷酸片段，对应309(GenBank:AP012303.1)测序菌株(2型菌株)基因mpna5861-5865。具体地，该2条特异的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、8所示。
据此，本发明首先提供了一组用于肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)检测和基因分型的靶序列，分别为肺炎支原体基因1型、2型的特异性核酸片段，所述特异性靶序列分别如SEQ ID NO.7、8所示的序列或其特异性片段。
本发明提供了SEQ ID NO.7、8所示的序列或其特异性片段在肺炎支原体检测和基因分型中的应用。选择上述特异核苷酸片段中高度保守的区域可以作为PCR、荧光定量PCR检测的靶序列使用。
在本发明的实施例中选择的用于肺炎支原体检测和基因分型的肺炎支原体基因1型、2型的特异性核酸片段的保守序列分别为SEQ ID NO.9、10。其中，SEQ ID NO.9位于SEQID NO.7的第2596-2708位，SEQ ID NO.10位于SEQ ID NO.8的第3177-3323位。
进一步地，本发明提供了SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的序列或它们的特异性片段在肺炎支原体检测和基因分型中的应用。
进一步，本发明分别以上述2条序列为基础设计了2对特异性引物对以及与引物对配合使用的荧光探针，并以此建立了一种具有更高灵敏度和特异度的肺炎支原体检测和基因分型的双重荧光PCR方法。
本发明提供了用于肺炎支原体快速检测和基因分型的引物探针组合，包括以下4条引物和2条探针：
MP 1-F:CCAGATTCACGTTTAATTTC(SEQ ID NO.1)
MP 1-R:GCATCTAACATGAAGACTG(SEQ ID NO.2)
MP1-P:AACCAACAACTTCTCATTCATCCTCAG(SEQ ID NO.3)
MP 2-F:TTGGGTAAACCTAATTTGC(SEQ ID NO.4)
MP 2-R:ACACGTATTAGCATCACTA(SEQ ID NO.5)
MP 2-P:AAGACTATTCGCCTTACAACCAACC(SEQ ID NO.6)。
在本发明的实施例中，2条探针类型均为TaqMan探针，检测1型菌株的探针5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1，检测2型菌株的探针5’标记荧光基团VIC，3’标记淬灭基团BHQ1。
本发明提供了上述引物探针组合在制备肺炎支原体快速检测和基因分型试剂盒中的应用。
含有上述引物探针组合的试剂盒属于本发明的保护范围。
本发明的试剂盒基于双重荧光定量PCR方法，对待测样本提取基因组DNA后，采用上述SEQ ID NO.1-6所示的引物探针组合进行双重荧光定量PCR检测待测样本中的肺炎支原体并进行基因分型。
优选地，本发明试剂盒25μL检测体系的具体配置为：
优选地，本发明试剂盒工作条件为：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性15s，55-57℃退火15s，45个循环。
每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板的阴性对照)和两种POS对照(阳性对照)，POS1和POS2(POS1为1型菌株阳性对照，POS2为2型菌株阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NTC(-)、POS1(+)和POS2(+)
无效扩增：NTC(+)、POS1(+)或POS2(+)提示体系污染
无效扩增：NTC(-)、POS(-)或POS2(-)提示体系错误或者试剂失效
只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。
在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
CT值小于等于38的标本为阳性结果；
CT值大于40的标本为阴性性结果；
CT值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如CT值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
FAM荧光检测阳性为1型菌株，VIC荧光检测阳性为2型菌株。
本发明还提供了该试剂盒在肺炎支原体基因分型中的应用。
本发明提供了SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列在检测肺炎支原体基因1型中的应用。
优选地，本发明提供了SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列在检测肺炎支原体基因1型中的应用。
本发明提供了SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列在检测肺炎支原体基因2型中的应用。
优选地，本发明提供了SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列在检测肺炎支原体基因2型中的应用。
本发明的试剂盒具有以下优点：
1、实现了肺炎支原体检测与基因分型同时进行的目的，在样品中肺炎支原体检测的同时还可进行分型判断，且基因分型所耗时间不超过1小时，与现有技术的肺炎支原体基因分型方法相比，大大缩短了操作时间，提高了效率。
2、检测特异性好、灵敏度高，特异性和灵敏度均达到100％，最低检测限为3CFU。
3、本发明试剂盒对肺炎支原体基因分型的准确度高，分型结果与传统的基因分型方法结果吻合度达100％。
4、本发明试剂盒对肺炎支原体基因分型的灵敏度高，分型能力远高于传统的培养依赖的基因分型方法。
5、本发明试剂盒成本低，操作简单，操作条件要求不苛刻，大大节省了人力、物力和时间，降低了实际样品中肺炎支原体检测和分型的成本，适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1A为双重荧光PCR体系对不同浓度(3×100-3×105CFU)1型肺炎支原体标准品模板扩增标准曲线图，图1B为双重荧光PCR体系对不同浓度1型肺炎支原体标准品模板扩增的对数值线性关系图，R2＝0.996。
图2A为双重荧光PCR体系对不同浓度(3×100-3×105CFU)2型肺炎支原体标准品模板扩增标准曲线图，图2B为双重荧光PCR体系对不同浓度2型肺炎支原体标准品模板扩增的对数值线性关系图，R2＝0.997。
图3为本发明试剂盒的特异度评价结果，其中1为肺炎支原体1型菌株，2为肺炎支原体2型菌株，其他物种的核酸扩增结果均为阴性。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 用于肺炎支原体检测和基因分型的靶序列的确定
选取20株不同型别的国内肺炎支原体临床分离株进行增菌培养，并提取全菌DNA，浓度测定后，使用Illumina Hiseq 2000测序仪进行全基因组测序。将测序菌株和NCBI数据库中已知的8株肺炎支原体全基因组序列【M129(GenBank:U00089.2)；FH(GenBank:CP002077.1)；309(GenBank:AP012303.1)；M29(GenBank:CP008895.1)；M129-B7(GenBank:CP003913.2)；PO1(GenBank:ANAA00000000.1)；19294(GenBank:ANIQ00000000.1)；PI1428(GenBank:ANAB00000000.1)】使用Mauve软件进行全基因组序列比对，寻找出1型菌株和2型菌株特异的核酸序列区域：1型菌株基因组中存在一段长约3kbp的序列特异核苷酸片段，对应基因mpn457-459(对应1型M129测序菌株)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；以及2型菌株基因组中存在一段长约5kbp的序列特异核苷酸片段，对应基因mpna5861-5865(对应2型309测序菌株)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例2 针对靶序列的引物和探针的设计
分析实施例1获得的肺炎支原体1型菌株和2型菌株的靶序列，选取其中的高度保守区域，使用Primer Express Version 3软件设计适用于双重荧光PCR的探针和引物。该探针类型为TaqMan探针，检测1型菌株的探针5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1，检测2型菌株的探针5’标记荧光基团VIC，3’标记淬灭基团BHQ1。
引物和探针序列分别如下：
MP 1-F:CCAGATTCACGTTTAATTTC
MP 1-R:GCATCTAACATGAAGACTG
MP 1-P:FAM-AACCAACAACTTCTCATTCATCCTCAG-BHQ1
MP 2-F:TTGGGTAAACCTAATTTGC
MP 2-R:ACACGTATTAGCATCACTA
MP 2-P:VIC-AAGACTATTCGCCTTACAACCAACC-BHQ1。
实施例3 肺炎支原体检测和基因分型的双重荧光PCR条件参数的优化与方法建立
(1)体系镁离子浓度优化：将体系中MgCl2从0.5μl依次递增为4μl，每次增幅0.5μl，每个浓度梯度做3个平行样。结果MgCl2添加量为1.5μl(MgCl2终浓度为4mM)时体系扩增效果最好。
(2)体系退火温度优化：体系退火温度从55℃-65℃改变，结果显示退火温度为55-57℃体系扩增效果最好。
(3)肺炎支原体检测和基因分型的双重实时荧光定量PCR方法的建立
上述引物和探针参考实施例2的引物探针序列。
扩增条件：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性15s，55-57℃退火15s，45个循环。
每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)：POS1和POS2(POS1为1型菌株阳性对照，POS2为2型菌株阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NTC(－)、POS1(+)和POS2(+)
无效扩增：NTC(+)、POS1(+)或POS2(+)提示体系污染
无效扩增：NTC(－)、POS1(－)或POS2(－)提示体系错误或者试剂失效。
在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
Ct值小于等于38的标本为阳性结果；
Ct值大于40的标本为阴性结果；
Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。FAM荧光检测阳性为1型菌株，VIC荧光检测阳性为2型菌株。
实施例4 双重荧光PCR体系标准曲线的制作
分别以标准浓度1型菌株(ATCC29342)和2型菌株(ATCC15531)模板的lg值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，参照实施例3的方法绘制双重荧光PCR体系的real-time PCR标准曲线，每个浓度重复3次。结果显示：阳性模板量在3CFU-3×105CFU这个范围内时，其两种荧光信号的对数值与Ct值具有非常好的相关性(1型R2＝0.996，2型R2＝0.997)。见图1A、图1B、图2A、图2B。
实施例5 双重荧光PCR检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价
1、灵敏度评价
用本发明实施例3优化了的肺炎支原体检测及分型双重荧光定量PCR方法检测9株ATCC标准株和实验室保存的56株肺炎支原体临床分离株DNA。结果除NTC对照外，所有65株肺炎支原体该体系检测结果呈阳性，灵敏度达100％。
2、特异度评价
用本发明实施例3优化了的肺炎支原体双重荧光定量PCR方法检测呼吸道常见菌株23种及人类染色体(表1)，以肺炎支原体为阳性对照。结果除阳性对照外，其余24种非肺炎支原体模板均为阴性(图3)。
表1用于检测肺炎支原体荧光PCR体系特异性模板
ATCC,美国模式培养物集存库
3、检测下限的评价
检测下限即以该优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性模板中检测，结果为阳性的能力。
分别以1型肺炎支原体标准菌株ATCC29342模板系列浓度梯度1.62ng/ul～0.162fg/ul为模板和2型肺炎支原体标准菌株ATCC15531模板系列浓度梯度1.83ng/ul～0.183fg/ul为模板和，每个浓度梯度取5μl检测，使用阳性模板量对应为0.3CFU～3×105CFU。按照优化的反应体系和反应条件进行real-time PCR，每个浓度梯度做3个平行样。当体系两种标准模板量为3CFU～3×105CFU时，每个浓度梯度的3个平行样均扩增阳性，所以，本发明建立的肺炎支原体检测及分型双重实时荧光定量PCR检测体系的检测下限为3CFU。
实施例6 双重荧光PCR检测体系分型能力验证
使用9株ATCC标准株和实验室保存的56株肺炎支原体临床分离株DNA进行：①常用的p1基因测序法(参考文献：Zhao F,Cao B,Li J,Song S,Tao X,Yin Y,He L,ZhangJ.2011.Sequence analysis of the p1adhesin gene of Mycoplasma pneumoniae inclinical isolates collected in Beijing in 2008to 2009.J Clin Microbiol.49:3000-3003.)、②最新报道的质谱分型(参考文献：Xiao D,Zhao F,Zhang H,Meng F,ZhangJ.2014.Novel strategy for typing Mycoplasma pneumoniae isolates by use ofmatrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometrycoupled with ClinProTools.J Clin Microbiol.52:3038-3043.)和③本申请的双重荧光PCR方法进行分型结果比对，3种方法均检测到44株1型菌株和21株2型菌株(包括变异2型菌株)，吻合率为100％(表2)。
表2 65株肺炎支原体纯菌DNA使用3种分型技术分型结果比较
V2a和V2c菌株均属于2型菌株
实施例7 本发明方法对临床标本的实际应用效果比较
使用实验室收集的1344份临床呼吸道感染咽拭子标本进行肺炎支原体检测与分型。分别使用：本发明的双重荧光定量PCR方法(参见实施例3)、常用的p1基因PCR-RFLP分型技术(参考文献：Sasaki T,Kenri T,Okazaki N,et al.1996.Epidemiological study ofMycoplasma pneumoniae infections in japan based on PCR-restriction fragmentlength polymorphism of the P1cytadhesin gene.J Clin Microbiol.34:447-449.)及中国专利CN102230013B中公开的MpP1荧光PCR检测方法，三种方法对临床标本的实际检测、分型能力进行比较。
三种方法(依次为传统的分离培养方法、CN102230012B公开的荧光定量PCR检测肺炎支原体的方法、本发明双重荧光定量PCR)检测标本肺炎支原体阳性率分别为26.9％(362/1344),34.4％(462/1344)和33.7％(453/1344)，经统计学检验，两种荧光PCR对肺炎支原体检测能力无差别，但均与分离培养方法检测阳性率存在显著性差异。可见，本发明方法检测肺炎支原体的准确率达到现有技术中，准确度较高的单重荧光定量PCR方法的准确率。
在基因分型结果方面：将培养阳性的362株肺炎支原体进行p1基因PCR-RFLP分型，其中1型309株，2型53株。本发明的双重荧光PCR检测的453份阳性结果中其中1型菌株382株，2型菌株71株。其中p1基因PCR-RFLP分型方法的362株菌株中，双重荧光PCR有其中6株没有检测到，不能分型；双重荧光PCR分型的453份标本中，97份分型的标本由于分离不到菌株无法使用p1基因PCR-RFLP方法进行分型，两种方法均可分型的356份标本的肺炎支原体分型结果100％一致。经统计学分析，两种方法的分型能力存在显著性差异，本发明的双重荧光定量PCR的分型能力显著优于传统的p1基因PCR-RFLP分型方法，且大大缩短了分型所需的时间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.用于肺炎支原体快速检测和基因分型的引物探针组合，其特征在于，包括以下4条引物和2条探针：
MP 1-F:CCAGATTCACGTTTAATTTC
MP 1-R:GCATCTAACATGAAGACTG
MP 1-P:AACCAACAACTTCTCATTCATCCTCAG
MP 2-F:TTGGGTAAACCTAATTTGC
MP 2-R:ACACGTATTAGCATCACTA
MP 2-P:AAGACTATTCGCCTTACAACCAACC。
2.权利要求1所述的引物探针组合在制备肺炎支原体快速检测和基因分型试剂盒中的应用。
3.含有权利要求1所述的引物探针组合的试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒基于双重荧光定量PCR方法，对待测样本提取基因组DNA后，采用权利要求2所述的引物探针组合进行双重荧光定量PCR检测待测样本中的肺炎支原体并进行基因分型。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒25μL检测体系的具体配置为：
6.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒工作条件为：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性15s，55-57℃退火15s，45个循环。
7.权利要求3-6任一所述的试剂盒在非诊断目的的肺炎支原体基因分型中的应用。
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Assignee: Beijing Jijian Medical Technology Co.,Ltd.

Assignor: National Institute for Communicable Disease Control and Provention, China CDC

Contract record no.: X2021980001310

Denomination of invention: Kit for rapid detection and genotyping of Mycoplasma pneumoniae

Granted publication date: 20171107

License type: Exclusive License

Record date: 20210225

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