CN104561277B - 用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒 - Google Patents

用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104561277B
CN104561277B CN201410802294.XA CN201410802294A CN104561277B CN 104561277 B CN104561277 B CN 104561277B CN 201410802294 A CN201410802294 A CN 201410802294A CN 104561277 B CN104561277 B CN 104561277B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma pneumoniae
detection
sequence
repmp23
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410802294.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104561277A (zh
Inventor
赵飞
张建中
何利华
孟凡亮
顾一心
陶晓霞
肖迪
张慧芳
胡源
刘立雍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Original Assignee
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention filed Critical National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority to CN201410802294.XA priority Critical patent/CN104561277B/zh
Publication of CN104561277A publication Critical patent/CN104561277A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104561277B publication Critical patent/CN104561277B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒。本发明首先通过对肺炎支原体基因测序和比对，筛选得到用于检测肺炎支原体的多拷贝重复序列基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，并设计了检测其的实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。本发明的检测试剂盒检测肺炎支原体灵敏度可低至0.2 CFU，对临床常见23种呼吸道病原体均无非特异扩增，显示出良好的特异度，具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。

Description

用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测肺炎支原体的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行肺炎支原体检测的方法和试剂盒。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)是引起人类呼吸道感染的重要致病菌之一，每年约有10％-40％的社区获得性肺炎是由其感染所引起的。由于缺少快速灵敏的检测技术及检测试剂盒，目前国内临床对于肺炎支原体的诊断能力有限，误诊和漏诊现象普遍存在，给医疗负担和医患关系带来负面效应。目前，荧光PCR检测技术凭借其快速、高灵敏度和特异度的优势，越来越广泛的应用于临床肺炎支原体感染检测。国内外已报道多种肺炎支原体荧光PCR检测体系，检测灵敏度和特异度均已经超过传统的血清学检测和普通PCR检测技术，荧光PCR检测技术逐渐成为临床肺炎支原体检测的“金标准”。目前报道的检测肺炎支原体的荧光PCR检测的基因主要有ATPase operon gene(参考文献：Daxboeck,F.,G.Khanakah,C.Bauer,M.Stadler,H.Hofmann,and G.Stanek.2005.Detection ofMycoplasma pneumoniae in serum specimens from patients with mycoplasmapneumonia by PCR.Int.J.Med.Microbiol.295:279-285.)，P1基因(参考文献：ZHAO Fei,CAO Bin,HE Li Hua,YIN Yu Dong,TAO Xiao Xia,SONG Shu Fan,MENG Fan Liang,andZHANG Jian Zhong.2012.Evaluation of a new real-time PCR assay for detectionof Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens.Biomed Environ Sci.25:77-81.)和CARDS toxin gene(参考文献：Winchell,J.M.,K.A.Thurman,S.L.Mitchell,W.L.Thacker,and B.S.Fields.2008.Evaluation of three real-time PCR assays fordetection of Mycoplasma pneumoniae in an outbreak investigation.J.Clin.Microbiol.46:3116-3118.)，上述现有技术报道的检测肺炎支原体的检测灵敏度在几十CFU到几个CFU之间。
目前报道的检测方法是通过对多株肺炎支原体相关目的基因进行序列比对，在上述目的基因的保守区域中设计引物探针的检测方法。由于上述ATPase operon、P1、CARDStoxin等基因在肺炎支原体基因组中均为单一拷贝，也就是说每个肺炎支原体菌中只含有1个靶序列作为检测的扩增模板。另一方面，研究发现肺炎支原体菌株中存在许多重复序列(包括RepMP1 a-n，RepMP23 a-j，RepMP4 a-h，RepMP5 a-j)，这些重复序列在肺炎支原体中都是多拷贝。理论上说，以多拷贝重复序列基因作为靶序列检测可将相同条件下荧光PCR检测灵敏度相应提高几倍至十几倍。但是目前由于肺炎支原体的这些重复序列并非完全一致，只是部分序列一致，且重复序列的稳定性也没有通过大量的测序数据进行验证。因此，对于重复序列中寻找保守且稳定的靶序列，并设计探针引物存在巨大困难。
对于检测病原的方法，灵敏度越高，则意味着该检测方法越准确、可靠、省时省力，因此如何提高检测灵敏度是技术人员一直致力于解决的问题，但目前还未见有检测肺炎支原体更高灵敏度方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测肺炎支原体的特异性靶序列；本发明的还在于提供一种检测肺炎支原体灵敏度达0.2CFU的检测试剂盒。
为实现上述目的，发明人选取在国内分离的20株肺炎支原体临床株进行全基因组测序，获得了20株国内菌株的全基因组草图，通过此测序数据和目前NCBI数据库已报道的数据比对，发现了重复序列RepMP23中基本保守区域92bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在RepMP23-a序列中对应nt170-261，在RepMP23-b序列中对应nt161-252，在RepMP23-d序列中对应nt468-559，在RepMP23-e序列中对应nt177-268，在RepMP23-f序列中对应nt191-282，在RepMP23-h序列中对应nt211-302，在RepMP23-i序列中对应nt168-259，在RepMP23-j序列中对应nt188-279，RepMP23-c和RepMP23-g中没有发现上述保守区域(图1)。序列比对结果显示，每一株肺炎支原体的上述8个重复序列选定区域的核酸序列在不同菌株中均未发生任何突变，该区域是保守稳定的区域，可以作为荧光PCR检测靶序列使用。
根据上述保守的区域使用Primer Express Version 3软件设计探针和引物。该体系的探针和引物不但适用于已报道的国外肺炎支原体菌株扩增还适用国内肺炎支原体扩增教检测。该探针类型为MGB探针，5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ。
在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：
RepMp23-F1:5’-GTG(G/A)ATGATATAACCGCGCC-3’，(SEQ ID NO.2)
RepMp23-R1:5’-GAACGCGAACCACTTGTGTTC-3’(SEQ ID NO.3)。
探针序列为：FAM-TCGTCCAGCGGAAC-BHQ1(SEQ ID NO.4)。
本发明提供了上述引物和荧光探针在制备检测肺炎支原体试剂盒中的应用。
含有上述引物(SEQ ID NO.2、3)和荧光探针(SEQ ID NO.4)的试剂盒也属于本发明的保护范围。
本发明提供的试剂盒还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为肺炎支原体基因组DNA。
本发明的试剂盒是以样品总DNA为模板，以权利要求1所述的靶序列为目标，利用权利要求3或4所述的引物和权利要求5所述探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
本发明提供一种肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，以上述靶序列为目标，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。
本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为25μl反应体系时，其优选配置为：
实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性15s，56-59℃退火15s，45个循环。
本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NTC(－)和POS(+)
无效扩增：NTC(+)和POS(+) 提示体系污染
无效扩增：NTC(－)和POS(－) 提示体系错误或者试剂失效。
在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
Ct值小于等于38的标本为阳性结果；
Ct值大于40的标本为阴性结果；
Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
本发明通过对20株国内肺炎支原体临床分离株全基因组测序，同时比对数据库中已测序的肺炎支原体菌株，发现了2段保守的RepMP重复序列，设计了4套相应的特异性检测探针和引物，通过实验室条件优化和筛选，最终选定其中灵敏度最高的一套RepMP23体系(引物序列如SEQ ID NO2、3所示，探针序列如SEQ ID NO.4所示)。该体系针对8个重复序列保守区域作为靶序列扩增，相比以往荧光PCR针对单一拷贝模板作为靶序列扩增，更加灵敏，其检测灵敏度可低至0.2 CFU(目前肺炎支原体荧光PCR检测限一般在3-5CFU)，是目前已知最灵敏的荧光PCR检测方法。本发明的试剂盒含有上述RepMP23体系的引物对和探针序列，用本发明试剂盒对临床常见23种呼吸道病原体均无非特异扩增，显示出良好的特异度。经50份阳性和100份阴性临床咽拭子标本验证其灵敏度和特异度分别为100％和99％，检测灵敏度优于已报道的MpP1检测体系(82％)体系，具有良好的临床标本检测能力。
附图说明
图1为本发明确定的肺炎支原体RepMP23重复序列中保守且稳定的核酸区域，可作为检测肺炎支原体的靶序列。
图2A为RepMp23体系对不同浓度肺炎支原体标准品模板扩增标准曲线图，图2B为RepMp23体系对不同浓度肺炎支原体标准品模板扩增的对数值线性关系图，R2＝0.999。
图3为RepMP23体系real-time PCR的特异度检测结果图，除阳性模板对照外，其余模板均无扩增。
图4为两种体系的检测限能力比较，图4A为MpP1体系，检测限为2CFU(约5fg)；图4B为RepMP23体系，检测限为0.2CFU(约0.5fg)。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 用于检测肺炎支原体的特异性重复序列的筛选和确定
选取20株不同型别的国内肺炎支原体临床分离株进行增菌培养，并提取全菌DNA，浓度测定后，使用Illumina Hiseq 2000测序仪进行全基因组测序，并获得20株肺炎支原体全基因草图。将测序菌株和NCBI数据库中已知的RepMP重复序列使用Vector NTI Suite 6软件序列比对，寻找出保守区域。发现了在RepMP23重复序列中的核苷酸保守区域92bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在RepMP23-a序列中对应nt170-261，在RepMP23-b序列中对应nt161-252，在RepMP23-d序列中对应nt468-559，在RepMP23-e序列中对应nt177-268，在RepMP23-f序列中对应nt191-282，在RepMP23-h序列中对应nt211-302，在RepMP23-i序列中对应nt168-259，在RepMP23-j序列中对应nt188-279，RepMP23-c和RepMP23-g中没有发现上述保守区域(图1)。序列比对结果显示，每一株肺炎支原体的上述8个重复序列选定区域的核酸序列在不同菌株中均未发生任何突变，该区域是保守稳定的区域，因此，确定SEQ ID NO.1所述的序列可以作为荧光PCR检测靶序列使用。
实施例2 检测肺炎支原体的特异性重复序列的引物和探针
针对实施例1确定的用于扩增肺炎支原体的靶序列，发明人设计了很多套引物与探针组合，通过实验对比，发现以下引物和探针组合荧光信号值超过11000，且退火温度在55℃-59℃之间的检测ct值最小，因此本发明确定该引物和探针组合为最佳用于荧光定量PCR检测肺炎支原体的组合。
RepMP23-F1:GTG(G/A)ATGATATAACCGCGCC(SEQ ID NO.2)
RepMP23-R1:GAACGCGAACCACTTGTGTTC(SEQ ID NO.3)
RepMP23-MGB-P1:FAM-TCGTCCAGCGGAAC-BHQ1(SEQ ID NO.4)
实施例3 实时荧光定量PCR检测肺炎支原体实验参数的优化与方法建立
(1)体系镁离子浓度优化：将体系中MgCl2从0.5μl依次递增为4μl，每次增幅0.5μl，每个浓度梯度做3个平行样。结果MgCl2添加量为1μl(MgCl2终浓度为3mM)时体系扩增效果最好。
(2)体系退火温度优化：体系退火温度从55℃-65℃改变，结果显示退火温度为56-59℃体系扩增效果最好。
(3)MpP1实时荧光定量PCR扩增体系及扩增条件的优化
扩增条件：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性15s，56-59℃退火15s，45个循环。
每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NTC(－)和POS(+)
无效扩增：NTC(+)和POS(+) 提示体系污染
无效扩增：NTC(－)和POS(－) 提示体系错误或者试剂失效。
在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
Ct值小于等于38的标本为阳性结果；
Ct值大于40的标本为阴性结果；
Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
实施例4 RepMP23体系标准曲线的制作
以标准浓度模板的lg值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制RepMP23体系的real-time PCR标准曲线。结果显示：阳性模板量在0.5 fg-5.0 ng这个范围内时，其的对数值与Ct值具有非常好的相关性(R2＝0.999)，且扩增效率E＝98％。见图2A、图2B。
实施例5 RepMP23荧光PCR检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价
1.灵敏度评价
用本发明实施例3优化了的肺炎支原体荧光定量PCR方法(RepMP23检测体系)检测8株ATCC标准株和实验室保存的50株肺炎支原体临床分离株DNA。结果，除NTC对照外，所有58株肺炎支原体RepMP23体系检测结果呈阳性，灵敏度达100％。
2.特异度评价
用本发明实施例3优化了的肺炎支原体荧光定量PCR方法检测呼吸道常见菌株23种及人类染色体(表1)，以肺炎支原体为阳性对照。结果除阳性对照外，其余24种非肺炎支原体模板均为阴性(图3)。
表1 用于检测肺炎支原体荧光PCR体系特异性模板
ATCC,美国模式培养物集存库
3.检测下限的评价
检测下限即以该优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性模板中检测，结果为阳性的能力。
以肺炎支原体标准菌株ATCC29342模板系列浓度梯度1.62ng/ul～0.162fg/ul为模板，每个浓度梯度取3μl检测，使用阳性模板量对应为5ng～0.5fg。按照优化的反应体系和反应条件进行real-time PCR，每个浓度梯度做3个平行样。
当体系标准模板量为5ng～0.5fg时，每个浓度梯度的3个平行样均扩增阳性，所以，本发明建立的肺炎支原体RepMP23体系实时荧光定量PCR检测体系的检测下限为0.5fg，约0.2CFU，结果见图4B。
实施例6 本发明的RepMP23体系实时荧光PCR方法对临床标本的实际检测能力评价
使用RepMP23体系(本发明实施例3建立的检测肺炎支原体的方法)与中国专利CN102230013B公开的MpP1体系分别检测50份肺炎支原体阳性临床标本(阳性标本定义为培养阳性标本)和100份肺炎支原体阴性临床标本(阴性标本定义为培养阴性且荧光PCR检测阴性的标本)。检测结果见表2，3。
表2 使用repMP23体系和MpP1体系对临床标本检测结果
表3 RepMP23方法和MpP1方法检测50例肺炎支原体阳性临床标本Ct值
N为阴性结果
结果显示，RepMP23体系对于阳性临床标本检测率为100％(50/50)，高于MpP1体系的82％(41/50)，经统计学计算存在显著性差异(P＜0.05,chi-square test)，说明本发明实施例3建立的RepMP23体系检测肺炎支原体的方法对于阳性标本的检测优于MpP1体系。RepMP23体系与MpP1体系对于阴性标本检测率均为99％(99/100)，两者无统计学差异。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种用于检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的特异性引物和探针组合，特异性引物的核苷酸序列为：
RepMp23-F1:5’-GTG(G/A)ATGATATAACCGCGCC-3’，
RepMp23-R1:5’-GAACGCGAACCACTTGTGTTC-3’；
所述探针的核苷酸序列为：5’-TCGTCCAGCGGAAC-3’。
2.权利要求1所述的特异性引物和探针组合在制备检测肺炎支原体试剂盒中的应用。
3.含有权利要求1所述的特异性引物和探针组合的试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和探针组合进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，实时荧光定量PCR的25μl反应体系为：
6.根据权利要求4-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性15s，56-59℃退火15s，45个循环。
CN201410802294.XA 2014-12-19 2014-12-19 用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒 Active CN104561277B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410802294.XA CN104561277B (zh) 2014-12-19 2014-12-19 用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410802294.XA CN104561277B (zh) 2014-12-19 2014-12-19 用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104561277A CN104561277A (zh) 2015-04-29
CN104561277B true CN104561277B (zh) 2019-05-14

Family

ID=53078351

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410802294.XA Active CN104561277B (zh) 2014-12-19 2014-12-19 用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104561277B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946769B (zh) * 2015-06-30 2017-11-07 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒
CN107513558A (zh) * 2016-06-17 2017-12-26 深圳康美生物科技股份有限公司 肺炎支原体荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒
CN109735640A (zh) * 2019-03-01 2019-05-10 苏州点晶生物科技有限公司 肺炎支原体快速检测引物组、试剂盒
CN109913564B (zh) * 2019-04-09 2024-01-09 深圳市儿童医院 一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物、试剂盒及方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6537773B1 (en) * 1995-06-07 2003-03-25 The Institute For Genomic Research Nucleotide sequence of the mycoplasma genitalium genome, fragments thereof, and uses thereof
CN101019123A (zh) * 2004-02-06 2007-08-15 科学与工业研究委员会 用于识别有治疗潜力的粘附素和粘附素样蛋白的计算方法
US20090092969A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-09 Michael Aye Detection of atypical pneumonia
CN101760519A (zh) * 2008-10-23 2010-06-30 上海复星医药（集团）股份有限公司 一种高灵敏度检测肺炎支原体的靶序列及试剂盒
CN102230013B (zh) * 2011-06-21 2013-02-20 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 检测肺炎支原体的靶序列、引物和探针及其试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN104561277A (zh) 2015-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104946762B (zh) 检测肺炎克雷伯氏菌的试剂盒
CN102230013B (zh) 检测肺炎支原体的靶序列、引物和探针及其试剂盒
CN104561277B (zh) 用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒
CN110904250B (zh) 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法
CN105779625B (zh) 一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量pcr引物、试剂盒及方法
CN104059975B (zh) 对普罗威登斯菌o3，o4，o8，o12，o13和o20特异的核苷酸及其应用
CN105385780A (zh) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测的试剂盒及其应用
CN108410957A (zh) 用于检测生殖支原体的荧光pcr引物、探针及检测试剂盒
CN109234419A (zh) 炭疽杆菌双重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN103333903A (zh) 检测幽门螺杆菌的靶序列、引物和探针及其试剂盒
CN107523619A (zh) 包含mcr基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用
CN106967839A (zh) B族链球菌荧光定量pcr检测的引物、探针、试剂盒和方法
CN109337995A (zh) 土拉杆菌及其亚种的pcr检测方法和试剂盒
CN109371148A (zh) 鉴别三种猪呼吸道细菌的荧光pcr试剂盒及定量检测方法
CN104946769B (zh) 肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒
CN105567874A (zh) 猪德尔塔冠状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及非诊断性检测方法
CN108411014A (zh) 鉴别a型和b型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量pcr的引物和探针以及检测方法
CN108085403A (zh) 一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针
CN106011154A (zh) 一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用
CN103740839B (zh) 荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法
CN105256041A (zh) 对亲水气单胞菌o44，o24，o25和o28特异的核苷酸及应用
CN109666750A (zh) 一种鉴别猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌的多重实时荧光pcr检测引物组合物及检测方法
CN105154439B (zh) 对蜂房哈夫尼亚菌g5902，g5903，g5904，g5906特异的核苷酸序列
CN104195238B (zh) 用于检测肠癌的标记物及其应用
CN107022643A (zh) miR‑31‑5p与miR‑99a‑5p区分活动性肺结核和结核潜伏感染中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant