CN108085403A - 一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针 - Google Patents

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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明提供一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针，所述引物序列为上游引物：5’‑GCCGTGGTTGATACTA‑3’，下游引物：5’‑CAAGGTCTGCTCGTAA‑3’，所述探针序列为：5’‑CCTTACGCCGCCTGCCATTAC‑3’。本发明根据GenBank登录的AF314503的lktD基因序列，利用Beacon Designer 7.9设计特异性引物和探针，于国内外首先建立溶血性曼氏杆菌lktD基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。

Description

一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针
技术领域
本发明涉及一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针，属于分子生物学领域。
背景技术
溶血性曼氏杆菌是一种可感染多种家畜和野生动物的条件致病菌，主要感染牛、羊等反刍动物。该菌是牛、羊肺炎及新生羔羊败血症的主要病原，已经严重危害养羊业的健康发展，全球每年约有30%的病死牛与该菌有直接或间接关系，仅北美国家导致的经济损失超过10亿美元。
目前对溶血性曼氏杆菌的病原学诊断技术方面，国内外已有细菌分离鉴定法和普通PCR方法的报道，虽有关于曼氏杆菌属特异性和溶血性曼氏杆菌TaqMan的荧光定量PCR方法，然报道的主要是以16S rRNA为主，未见有关于其它基因荧光定量PCR检测方法的报道。溶血性曼氏杆菌的lktD基因是一个毒力因子，主要作用于反刍动物白细胞。由于细菌分离鉴定法存在耗时较长，且感染早期经抗生素治疗后分离更加困难，并且动物体内多种细菌如多杀性巴氏杆菌、海藻巴氏杆菌等均能抑制该菌的生长，使其分利率远低于实际感染率。普通PCR存在敏感性和特异性较低等缺点，使其在实际应用中受到一定的限制。TaqMan实时荧光定量PCR具有特异性强、定量准确、灵敏度高等优点，尤其适合临床样品的大量检测。本发明的建立可为该菌的病原学检测和流行病学调查提供一种新的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测溶血性曼氏杆菌的实时荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’- GCCGTGGTTGATACTA -3’，
下游引物：5’- CAAGGTCTGCTCGTAA -3’。
一种用于检测溶血性曼氏杆菌的探针，所述探针序列为：5’-CCTTACGCCGCCTGCCATTAC-3’。
所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。
利用本发明的引物和探针可用于检测溶血性曼氏杆菌的相应基因进行检测，尤其适用于基于实时荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测溶血性曼氏杆菌的实时荧光定量PCR方法。具体操作方法如下：
1、引物设计：根据GenBank上公布的溶血性曼氏杆菌AF314503基因序列，利用BeaconDesigner 7.9 软件对lktD基因序列进行引物和探针设计，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。
2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为：Premix Ex Taq TM （ProbeqPCR）12.5μL、上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL、探针（10 μmol/L）1.0μL、模板2μL、水补足至25μL。最佳反应条件为：95℃，20s 预变性；95℃ 5s，52.5 ℃ 10s，72℃ 20s 共40 个循环。
3、阳性标准品的制备：取1 mL溶血性曼氏杆菌培养液加入1.5 mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。
4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线，判断阳性的标准。
该方法可用于溶血性曼氏杆菌的病原诊断和流行病学调查，为疾病的早期预防奠定技术基础。
有益效果
本发明根据GenBank登录的AF314503的lktD基因序列，设计特异性引物和探针，首次建立溶血性曼氏杆菌lktD基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高(3.16 copies/μL)、重复性好。
附图说明
图1溶血性曼氏杆菌的实时荧光定量PCR方法的扩增曲线。
图2 为溶血性曼氏杆菌的实时荧光定量PCR的标准曲线。
具体实施方式
实施例1 溶血性曼氏杆菌的荧光定量PCR方法的建立
一、材料：
溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、莱氏无胆甾原体、牛支原体、羊口疮病毒为本科室分离、鉴定及保存。
二、步骤
1、仪器与试剂：荧光定量PCR 仪购自eppendorf公司；Premix Ex Taq TM （Probe qPCR）、DL2000 Marker 购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量PCR管购自Axygen。
2. 引物和探针的特异性
引物和探针的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。根据GenBank登录的AF314503的lktD基因序列，通过比对分析，设计引物和探针。
引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’- GCCGTGGTTGATACTA -3’，
下游引物：5’- CAAGGTCTGCTCGTAA -3’。
所述探针序列为：5’- CCTTACGCCGCCTGCCATTAC-3’。
3、阳性标准品的制备
以提取的DNA为模板，取1 mL溶血性曼氏杆菌培养液加入1.5 mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。
4. 反应条件的优化
采用25μL反应体系Premix Ex Taq TM （Probe qPCR） 12.5μL，PCR上游引物（10μmol/L）0.5μL，PCR 下游引物（10μmol/L）0.5μL，探针（20μmol/L）1.0μL，倍比稀释后的阳性标准品2μL，补水至终体积25μL，以出现最高荧光值及最小的Ct 值以为指标，分别对退火温度（50～60℃）和引物浓度（0.2～1.0μmol/L）进行优化。
将阳性标准品进行连续10倍系列稀释（10-1～10-8），以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct 值为纵坐标建立标准曲线。
对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，荧光定量PCR 方法对溶血性曼氏杆菌的Ct与拷贝数在3.16×102～3.16×108 拷贝/ 反应范围内有很好的线性关系，相关系数为1.0，扩增效率为100%。扩增曲线见图1，标准曲线见图2。
6 特异性检测
6.1 特异性检测
用优化的条件分别检测丝状支原体山羊亚种，大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、莱氏无胆甾原体、牛支原体、绵肺炎支原体、羊口疮病毒核酸样品进行检测，对其特异性进行评价。检测结果均为阴性。
6.2 可重复性及再现性评估
对同一阳性标准品设3个重复管，用TaqMan实时荧光定量PCR 进行检测，评价其重复性。
计算组内变异系数；将阳性标准品置于-20℃冰箱保存，分别于第7、14、21d 重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.64%～0.94%，组间变异系数为0.73%～0.97%，可重复性好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 林裕胜
<120> 一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccgtggttg atacta 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caaggtctgc tcgtaa 16
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccttacgccg cctgccatta c 21

Claims (2)

1.一种用于检测溶血性曼氏杆菌的引物和探针，其特征在于：引物的核苷酸序列为：上游引物：5’- GCCGTGGTTGATACTA -3’，下游引物：5’- CAAGGTCTGCTCGTAA -3’；所述探针序列为：5’- CCTTACGCCGCCTGCCATTAC -3’。
2.包含权利要求1所述引物和探针的检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒。
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