CN107502677A

CN107502677A - 一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物和探针

Info

Publication number: CN107502677A
Application number: CN201710985856.2A
Authority: CN
Inventors: 林裕胜; 胡奇林; 江锦秀
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2017-12-22

Abstract

本发明提供一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物和探针，所述引物序列为上游引物：5’‑GATGCAGTAGGAAGAGAA‑3’，下游引物：5’‑GTTCCATCATTTCATTGTTC‑3’，所述探针序列为：5’‑CACCAACAACATCATTACCACCACAT‑3’。本发明根据GenBank登录的AY529462.1的arcA基因序列，利用Beacon Designer 7.9设计特异性引物和探针，于国内外首先建立山羊支原体山羊肺炎亚种的TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。

Description

一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物和探针

技术领域

本发明涉及一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物和探针，属于分子生物学领域。

背景技术

山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripenumoniae,Mccp)是丝状支原体簇的成员之一，是引起山羊传染性胸膜肺炎(contagious capripleuropneumonia, CCPP)的病原。该病的发病率和死亡率高 (储岳峰,2009; 赵萍,2010)，发病率可达100%(Nichlas et al.,2012; Chu et al., 2011)，死亡率高达60%~70%（郑莹莹, 2014）。潜伏期为2~28d，平均10d，其临床特征主要表现为咳嗽、呼吸困难、发热和流鼻涕，病变主要变现为肺肝变、肺脏和胸膜粘连和胸腔积液。CCPP最早可追溯到1873年的阿尔及利亚，1976年由Macowan和Minette在肯尼亚成功分离到病原，命名为F38。现主要流行于非洲、亚洲和地中海沿岸各养羊国家和地区。我国最早可追溯到1958年山东、山西和新疆，随后宁夏、甘肃、贵州等省市均有该病发生的报道(赵萍, 2010,2016; 郭晗,2011)。该病每年给养羊业造成的经济损失较为严重。由于Mccp与Mmc和Mo导致疾病的临床症状及病理变化非常相似，通过临床剖检及病理变化难于区分，因此，该病的诊断依赖于实验室诊断。

当前国内外关于Mccp的诊断方法主要有病原的分离鉴定、病原学检测方法（间接免疫荧光抗体试验（IFAT Rosendal et al.,1972）、胶乳凝集试验（LAT Rurangirwa etal.,1987）和ELISA( Wamwayi et al.,1989 )）、血清学方法(补体结合试验(CFTHoushaymi et al.,2002 )、间接血凝试验(IHAT Muthomi et al.,1983)、胶乳凝集试验（LAT Rurangirwa et al.,1987）和ELISA (Sharew et al.,2005) )和分子生物学检测方法（特异性PCR (Manso-silván et al.,2007) 、PCR-限制性酶切分析法（PCR-REABascunana et al.,1994, Bölske et al.,1996)）和SYBR Green Ⅰ 实时荧光PCR方法(Lorenzon et al.,2008 ），但是Mccp对培养基营养要求高，培养非常困难，培养周期长，容易被其他支原体所抑制；而免疫学方法容易和同属支原体发生交叉反应，特异性和敏感性较差，因此，分子生物学方法是CCPP实验室检测的首选方法。但常规PCR灵敏度低、其需要凝胶电泳容易导致产物交叉污染而产生假阳性、且不能定量，这些方法均不能进行CCPP的准确、快速诊断。2008年Lorenzon S等建立了检测Mccp的SYBR Green Ⅰ qPCR方法，其方法特异、重复性好、可以检测80fg/反应的Mccp，灵敏度比常规PCR高2~3个数量级。TaqMan实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR 检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、适用性广等优点(万春和等,2010)。但当前国内外尚未有检测山羊支原体山羊肺炎亚种检测的TaqMan实时荧光定量PCR方法。本发明的建立可以填补该领域的空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物和探针。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’- GATGCAGTAGGAAGAGAA -3’，

下游引物：5’- GTTCCATCATTTCATTGTTC -3’。

所述探针序列为：5’- CACCAACAACATCATTACCACCACAT-3’。

所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。

利用本发明的引物和探针可用于对山羊支原体山羊肺炎亚种的相应基因进行检测，尤其适用于基于实时荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量PCR方法。

具体操作方法如下：

1、引物设计：根据GenBank上公布的山羊支原体山羊肺炎亚种AY529462.1基因序列，利用Beacon Designer 7.9 软件对arcA基因序列进行引物和探针设计，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。

2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为：Premix Ex Taq ^TM（ProbeqPCR）12.5μL、上、下游引物（20 μmol/L）各0.5μL、探针（20 μmol/L）0.5μL、模板2μL、水补足至25μL。最佳反应条件为：95℃，20s 预变性；95℃ 5s，57.5℃ 10s，72℃ 20s共40 个循环。

3、阳性标准品的制备：取1 mL山羊支原体山羊肺炎亚种培养液加入1.5 mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。

4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。

该方法可用于山羊支原体山羊肺炎亚种的病原诊断和流行病学调查，为疾病的早期预防奠定技术基础。

有益效果

本发明根据GenBank登录的AY529462.1的arcA基因序列，设计特异性引物和探针，首次建立山羊支原体山羊肺炎亚种的TaqMan实时荧光定量PCR方法，对山羊支原体山羊肺炎亚种的最低检测值为100 copies，说明该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。

附图说明

图1山羊支原体山羊肺炎亚种实时荧光定量PCR方法的扩增曲线。

图2 为山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量PCR的标准曲线。

图3 为山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量PCR的灵敏度检测。

具体实施方式

实施例1 山羊支原体山羊肺炎亚种的荧光定量PCR方法的建立

一、材料：

山羊支原体山羊肺炎亚种（F38株）由中国科学院兰州研究所馈赠，大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌等由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病实验室和猪病实验室馈赠；绵肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、莱氏无胆甾原体、牛支原体、羊口疮病毒为本科室分离、鉴定及保存。

二、步骤

1、仪器与试剂：荧光定量PCR 仪购自eppendorf公司；Premix Ex Taq ^TM（Probe qPCR）、DL2000 Marker 购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量PCR管购自Axygen。

2. 引物和探针的特异性

引物和探针的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。根据GenBank登录的AY529462.1的arcA基因序列，通过比对分析，利用Beacon Desingner 7.9软件设计引物和探针。

3、阳性标准品的制备

以提取的DNA为模板，取1 mL山羊支原体山羊肺炎亚种培养液加入1.5 mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。

4. 反应条件的优化

采用25μL反应体系Premix Ex Taq ^TM（Probe qPCR） 12.5μL，PCR上游引物（20μmol/L）0.5μL，PCR 下游引物（20μmol/L）0.5μL，探针（20μmol/L）0.5μL，倍比稀释后的阳性标准品2μL，补水至终体积25μL，以出现最高荧光值及最小的Ct 值以为指标，分别对退火温度（55～65℃）和引物浓度（0.2～1.0μmol/L）进行优化。

5、标准曲线的建立将阳性标准品进行倍比稀释成1.0×10² ～1.0×10⁷ copies/μL，以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct 值为纵坐标建立标准曲线。

对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，荧光定量PCR 方法对山羊支原体山羊肺炎亚种的Ct与拷贝数在1.0×10² copies/μL ～1.0×10⁷ copies/μL范围内有很好的线性关系，相关系数为0.998，扩增效率为211%。扩增曲线见图1，标准曲线见图2。

6 特异性检测

6.1 特异性检测

用优化的条件分别检测山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、莱氏无胆甾原体、牛支原体、绵肺炎支原体、羊口疮病毒核酸样品进行检测，对其特异性进行评价。除山羊支原体山羊肺炎亚种检测结果为阳性外，其余检测结果均为阴性。

6.2 可重复性及再现性评估

对同一阳性标准品设3个重复管，用TaqMan实时荧光定量PCR 进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将阳性标准品置于-20℃冰箱保存，分别于第7、14、21d 重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.84%～1.86%，组间变异系数为0.73%～1.52%，可重复性好。

6.3 敏感性检测

阳性标准品稀释成1.0×10⁷copies/μL~1.0×10¹copies/μL，用实时荧光定量PCR方法进行检测。结果显示，建立的实时荧光定量PCR的检测低限为100 copies/μL。见图3。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物和探针

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatgcagtag gaagagaa 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttccatcat ttcattgttc 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccaacaac atcattacca ccacat 26

Claims

1.一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物，其特征在于：引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’- GATGCAGTAGGAAGAGAA -3’，

下游引物：5’- GTTCCATCATTTCATTGTTC -3’。

2. 一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的探针，其特征在于，所述探针序列为：5’- CACCAACAACATCATTACCACCACAT -3’。

3.一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1和2所述的引物和探针。