CN107881259A - 一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的pcr扩增引物及其应用 - Google Patents
一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的pcr扩增引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增引物及其应用，属于动物细菌学及分子生物学领域。所述PCR扩增引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；上述引物用于制备检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增试剂盒。该试剂盒提供的PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，特异性检测出牛传染性鼻气管炎病毒，快速准确的获得检测结果，同时价格低廉、操作简便，适合基层使用，可作为牛传染性鼻气管炎病毒实验室快速鉴别和大规模流行病学调查的一种快速、准确、简便的检测工具。
Description
技术领域
本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体说是涉及一种快速、简便、低成本检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增引物及其应用。
背景技术
牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV）是由牛疱疹病毒1型引起的急性、热性、接触性传染病，患病牛的临床症状表现为奶牛流产、子宫炎、呼吸道感染、肠炎和肺炎等。牛感染该病毒后，对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌以及副流感病毒等病原的易感性增加。目前，该病原体在全球范围内均有分布，在中国的分布流行同样十分广泛，造成巨大的经济损失，成为威胁牛养殖业的重要病原之一。
迄今，国内外用于诊断牛传染性鼻气管炎病毒的方法较多，比如病理组织学诊断、病毒细胞培养分离鉴定、中和试验、间接血凝试验、ELISA、胶体金技术等手段，这些方法都存在以下缺点，比如费时费力，或不能确定病原，或有假阳性出现。而PCR方法不仅可以快速灵敏诊断出病原，而且对于潜伏期的病原感染，其特异性更强。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种低成本、快速、准确地检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增引物及其应用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：包括样品采集，病原基因组DNA的提取，特异性引物的设计和优化，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物和结果判定。
一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增引物，所述的PCR扩增引物是依据牛传染性鼻气管炎病毒的糖蛋白B基因进行设计，扩增的目的片段大小为401 bp，引物的序列分别为：
Forward primer：5’-CTGGCACACGACGGACGATG-3’ SEQ ID NO:1
Reverse primer：5’-TCTCGTCTCGCAGCATTTCGTC-3’ SEQ ID NO:2
使用前将引物浓度稀释至25 pmol。
优选的，将所述的PCR 扩增引物在制备检测牛传染性鼻气管炎病毒试剂盒的应用。
本发明还提供一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增试剂盒，包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。
优选的，PCR扩增试剂盒的反应模板是使用DNA/RNA提取试剂盒（CW0590S，北京康为世纪生物科技有限公司）提取细胞培养物或组织样品的病原基因组DNA。
优选的，利用快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增试剂盒建立PCR扩增方法，其反应体系建立以25 μL计，
10×PCR Buffer 5 μL
dNTPs（10mM each ） 2 μL
ES-Taq DNA聚合酶（5U/μL） 1 μL
Forward primer（25 pmol/L） 1 μL
Reverse primer（25 pmol/L） 1 μL
DNA模板 3 μL
RNase-Free water 补足25 μL。
优选的，所述的10×PCR Buffer包含KCL 20-30 mM、MgSO4 3-10 mM、10-20 mMTris-HCL。
优选的所述的PCR扩增试剂盒中PCR反应程序为95 ℃ 5 min；随后进行30个95 ℃35 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s的循环；最后72 ℃延伸10 min。
以上所述的一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增试剂盒，所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了401 bp的特异性条带，则说明该样品存在牛传染性鼻气管炎病毒；如果样品没有扩增出401 bp的特异性条带，则说明该样品不含有牛传染性鼻气管炎病毒。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
1）特异性强
本发明的牛传染性鼻气管炎病毒的PCR检测方法特异性检测出牛传染性鼻气管炎病毒，所检测的阴性对照病原如隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体、牛副流感病毒3型、肺炎克雷伯氏菌和水对照均无阳性结果。
2）灵敏度高
本发明的牛传染性鼻气管炎病毒的PCR检测方法灵敏度高，最小检测限为3.69×10-4 ng/μL。
3）耗时少、成本低廉
与通过病原分离鉴定来检测相比，本发明的牛传染性鼻气管炎病毒的PCR检测方法，在时间成本、工作量等方面具有明显的优势，从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定，可在5小时内完成。
4）准确性高、稳定性好
用3.69×101 ng/μL、3.69×100 ng/μL、3.69×10-1 ng/μL、3.69×10-2 ng/μL、3.69×10-3、3.69×10-4 ng/μL和3.69×10-5 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR，分别重复3次检测。结果显示3次扩增的结果一致，表明建立的PCR检测方法的反应体系重复性好。
附图说明
图1是退火温度筛选试验结果：其中M：DNA marker 100 bp ladder 、1：50℃、2：52℃、
3：54℃、4：56℃、5：58℃、6：60℃、7：62℃、8：水对照。
图2特异性检测结果：其中M：DNA marker 100bp ladder、1：牛传染性鼻气管炎病毒、2：隐秘杆菌、3：溶血性曼氏杆菌、4：牛支原体、5：牛副流感病毒3型、6：肺炎克雷伯氏菌、7：水对照。
图3是敏感性检测结果：其中M：DNA marker 100bp ladder、1：3.69×101 ng/μL、2：3.69×100 ng/μL、3：3.69×10-1 ng/μL、4：3.69×10-2 ng/μL、5：3.69×10-3 ng/μL、6 3.69×10-4 ng/μL、7：3.69×10-5 ng/μL；8：水对照。
图4是临床样品检测电泳图：其中M：DNA marker 100bp ladder、泳道P：阳性对照、N：阴性对照泳道；泳道2、3、4、6、9、10、14、15、16、17、19为阴性结果；泳道1、5、7、8、11、12、13、18、20为阳性结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 建立快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR方法
1、材料的准备
牛传染性鼻气管炎病毒、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体、牛副流感病毒3型、肺炎克雷伯氏菌为广西兽医研究所分离鉴定保存，组织样品来自兽医临床。10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶、DNA/RNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。
2 、PCR引物的设计与合成
根据GenBank 中的牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列进行同源性比较分析，选择保守序列区作为扩增区域，利用Oligo 7.0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物，其中引物的序列分别为：
Forward primer：5’-CTGGCACACGACGGACGATG-3’ SEQ ID NO:1
Reverse primer：5’-TCTCGTCTCGCAGCATTTCGTC-3’ SEQ ID NO:2
扩增的目的基因片段大小为401 bp，
上、下游引物使用前稀释到25 pmol/L。
3、模板DNA的提取
样品处理：
（1）细胞培养物：取适量培养物至于灭菌离心管中；
（2）组织样品：首先进行研磨，反复冻融，离心后取上清。
再使用DNA/RNA提取试剂盒提取。
4、PCR反应体系建立
所述的快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR方法，其反应体系建立以25 μL计
10×PCR Buffer 5 μL
dNTPs（10mM each ） 2 μL
ES-Taq DNA聚合酶（5U/μL） 1 μL
Forward primer（25 pmol/L） 1 μL
Reverse primer（25 pmol/L） 1 μL
DNA模板 3 μL
RNase-Free water 补足25 μL。
5、PCR反应程序
所述的快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR方法的反应程序，首选进行最佳退火温度确定试验，确定退火温度后，使用的PCR反应程序为95 ℃ 5 min；随后进行30个95 ℃ 35s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s的循环；最后72 ℃延伸10 min。
6、结果判定
所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法： 将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了401 bp的特异性条带，则说明该样品存在牛传染性鼻气管炎病毒；如果样品没有扩增出401 bp的特异性条带，则说明该样品不含有牛传染性鼻气管炎病毒。
7、特异性检测
以提取的试验株和对照株的基因组DNA/RNA（RNA病毒先进行反转录为cDNA）进行PCR扩增，检验PCR方法的特异性。
8、敏感性检测
将牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经PCR鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，测定起始浓度后，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行PCR扩增，进行敏感性检测。
9、重复性检测
用3.69×101 ng/μL、3.69×100 ng/μL、3.69×10-1 ng/μL、3.69×10-2 ng/μL、3.69×10-3、3.69×10-4 ng/μL和3.69×10-5 ng/μL的重组质粒标准样品同时进行PCR，分别重复3次检测，检验本发明检测方法的准确性和稳定性。
10、临床样品检测
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组DNA，使用建立的PCR方法进行扩增。
实施例2快速检测牛传染性鼻气管炎病毒PCR方法的退火温度试验
分别对退火温度50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃进行PCR扩增，确定最佳的退火温度。结果显示，所设计的引物对退火温度的包容性大，在退火温度为50 ℃、52℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃的反应程序下，均能很好的扩增出单一的目的条带（图1）。为此，本PCR方法使用的反应程序为：95 ℃ 5 min；随后进行30个95 ℃ 35 s，58 ℃40 s，72 ℃ 45 s的循环；最后72℃ 10 min延伸。
实施例3 检测牛传染性鼻气管炎病毒PCR方法的特异性检测结果
提取牛传染性鼻气管炎病毒、隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体、牛副流感病毒3型、肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA/RNA（RNA病毒先进行反转录为cDNA），使用优化好的反应体系和反应程序进行PCR扩增，检测本发明检测方法的特异性，结果显示，只有牛传染性鼻气管炎病毒样品扩增出了目的片段条带，为阳性结果，5株对照株反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果（图2），表明本方法具有很好的特异性。
实施例4检测牛传染性鼻气管炎病毒PCR方法的的敏感性检测结果
将牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增的目的片段与PMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经PCR鉴定，重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序确定。纯化阳性重组质粒，测定起始浓度为3.69×101 ng/μL后，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释，采用优化的反应条件进行PCR扩增，进行敏感性检测，结果显示，建立的PCR检测方法最低检测限为3.69×10-4 ng/μL（图3）。
实施例5 牛传染性鼻气管炎病毒PCR方法的准确性和稳定性检测结果
用3.69×101 ng/μL、3.69×100 ng/μL、3.69×10-1 ng/μL、3.69×10-2 ng/μL、3.69×10-3、3.69×10-4 ng/μL和3.69×10-5 ng/μL的标准样品同时进行PCR扩增，分别重复3次检测。结果显示，重复结果良好，表明建立的PCR检测方法重复性好、稳定性高。
实施例6 牛传染性鼻气管炎病毒PCR方法的初步应用
将临床采集的50份组织样品分别研磨，反复冻融，使用试剂盒提取基因组DNA，分别PCR扩增。图4展示其中20份样品的检测结果，结果表明，有9份样品检测出牛传染性鼻气管炎病毒的特异性条带，为阳性结果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增引物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 1
ctggcacacg acggacgatg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 2
tctcgtctcg cagcatttcg tc 22
Claims (8)
1.一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增引物，其特征在于，由具有SEQ IDNO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成。
2.根据权利要求1所述快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增引物，其特征在于，所述的PCR扩增引物是是依据牛传染性鼻气管炎病毒的糖蛋白B基因进行设计，扩增的目的片段大小为401 bp。
3.根据权利要求1所述快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增引物，其特征在于，所述的PCR扩增引物在制备检测测牛传染性鼻气管炎病毒试剂盒的应用。
4.一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增试剂盒，其特征在于，包括具有SEQID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。
5.根据权利要求4所述快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增试剂盒，其特征在于，还包括10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶和RNase-Free water。
6.根据权利要求4所述快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述的10×PCR Buffer包含KCL 20-30 mM、MgSO4 3-10 mM、10-20 mM Tris-HCL。
7.根据权利要求4所述快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒的SEQ ID NO:1引物和SEQ ID NO:2引物使用浓度为25 pmol。
8.根据权利要求4所述快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂盒中PCR反应程序为95 ℃ 5 min；随后进行30个95 ℃ 35 s，58 ℃40 s，72 ℃ 45 s的循环；最后72 ℃延伸10 min。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180406 |