CN111560471A - 用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字pcr方法 - Google Patents

用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字pcr方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111560471A
CN111560471A CN202010338406.6A CN202010338406A CN111560471A CN 111560471 A CN111560471 A CN 111560471A CN 202010338406 A CN202010338406 A CN 202010338406A CN 111560471 A CN111560471 A CN 111560471A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
nucleic acid
digital pcr
ddpcr
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010338406.6A
Other languages
English (en)
Inventor
高晓龙
程敏姮
李月
冯小宇
梅力
王英超
韦海涛
宋彦军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Original Assignee
Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing filed Critical Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Priority to CN202010338406.6A priority Critical patent/CN111560471A/zh
Publication of CN111560471A publication Critical patent/CN111560471A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字PCR方法，其核酸包括正向引物、反向引物和探针，正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，探针的序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的牛传染性鼻气管炎病毒检测微滴式数字PCR检测试剂盒的灵敏度为1copies/μL，并只能特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒。使用本发明的试剂盒检测牛传染病鼻气管炎病毒疑似样品，结果表明其准确率高于现有的qPCR，可以实现痕量病毒的检测，且无需标准曲线即可对核酸进行绝对定量。本发明的检测方法可实现对牛传染性鼻气管炎病毒的高特异性、高灵敏度、绝对定量检测。

Description

用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数 字PCR方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字PCR方法。
背景技术
微滴式数字PCR即Droplet Digital PCR(ddPCR)作为第三代核酸扩增技术，能够在扩增反应前，将反应体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴，核酸分子分布于每个微滴中，经过PCR扩增后，通过微滴检测器检测荧光信号，根据泊松分布原理和阳性微滴数即可计算出核酸初始拷贝数，可实现核酸高灵敏度精确定量。微滴式数字PCR已广泛应用于基因拷贝数变异研究、转基因检测、核酸绝对定量及病原微生物检测等领域。
牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是牛的一种急性、热性、接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类疫病，我国农业农村部列为二类动物疫病，其病原为牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitisvirus,IBRV)，又名牛疱疹病毒I型(BHV-I)，该病广泛分布于世界各地，最初于20世纪50年代在美国首次发现，并于1956年首次被Madin从患牛中分离出来。我国1980年首次从新西兰进口奶牛检测并分离到该病毒。IBRV是引起牛呼吸道疾病的重要病毒性病原之一，该病有多种临床表现型，如上呼吸道粘膜炎症、结膜炎、脓疱性外阴道炎、龟头炎、乳房炎、幼牛脑膜脑炎、流产等。此外，IBRV还可引起机体免疫抑制，进而继发细菌或支原体感染，导致牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)，给养牛业造成较大的经济损失。血清学调查显示，国内外IBRV感染情况普遍，OIE和我国均规定需对进出口牛、冻精和牛肉制品进行IBRV检疫，因此需要高灵敏度检测方法用于牛传染性鼻气管炎的精准检疫。
目前针对IBRV传统的检测方法包括病毒分离、免疫荧光检测、核酸扩增检测及ELISA等，OIE推荐荧光定量PCR方法(qPCR)检测IBRV，但上述常规方法耗时、费力且检测灵敏度低，容易出现假阴性结果，造成IBRV漏检。
Liu,Zhankui等(Development of a nanoparticle-assisted PCR assay fordetection of bovine respiratory syncytial virus.Liu,Z.,et al.BMC Vet Res.2019Apr 11；15(1):110.)建立了一种能够同时检测IBRV、BVDV、BPIV3的多重纳米PCR检测方法。该方法的缺点是灵敏性低，结果判定需借助核酸电泳，存在污染的可能性。同时，国内外多位学者基于SYBR Green和TaqMan 探针的建立了IBRV实时荧光定量PCR检测方法，但由于靶向基因的选择和引物设计存在一定难度，导致这些方法仍然存在着特异性相对较差或者无法检测痕量病毒的缺陷。
本发明针对IBRV的gB基因，建立并评估了基于微滴式数字PCR检测试剂盒以实现精准检测IBRV的目的，目前，国内外尚无建立这样的试剂盒用于检测IBRV。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一组用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸，该核酸可用于快速、灵敏、特异地检测牛传染性鼻气管炎病毒。本发明的另一个目的是提供一种用于高灵敏度检测牛传染性鼻气管炎病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒及其检测方法。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一组用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸，其包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
如上所述的核酸，优选地，还包括阳性对照，所述阳性对照含如SEQ ID NO.4所示的第98-249位的bp。
一种用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的试剂盒，其包括如上所述的核酸，其中，探针的5′端标记有荧光基团，探针的3′端标记有淬灭基团。
一种用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒，其包括如上所述的核酸、ddPCR预混液、微滴生成油、微滴发生卡、微滴发生卡密封垫、96孔PCR反应板和热封箔膜，其中，探针的5′端标记有荧光基团，探针的3′端标记有淬灭基团。
进一步的，所述荧光基团为FAM、TET、JOE、NED、VIC、ROX或 TAMRA，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3或TAMRA。
一种用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的微滴式数字PCR方法，其包括如下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、将提取的DNA加入ddPCR反应液中，反应液中含有如上所述的核酸；
S3、进行微滴式数字PCR反应；
S4、扩增完成，进行荧光读取，自动计算目的核酸片段含量。
如上所述的微滴式数字PCR方法，优选地，在步骤S2中，所述反应液中，正向引物、反向引物的终浓度为700nM，探针的终浓度为300nM，探针的5′端标记有FAM荧光基团，探针3′端标记有BHQ1淬灭基团。
进一步地，所述反应液为20μL反应体系，包括18μL ddPCR预混液和2 μL DNA模板，其中ddPCR预混液包含2×ddPCR Supermix 10μL，10pmol/μL 的探针0.6μL，10pmol/μL的正向引物1.4μL，10pmol/μL的反向引物1.4μL， DNase-free water 4.6μL。
如上所述的微滴式数字PCR方法，优选地，在步骤S3中，所述微滴式数字PCR反应的条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火1min， 40个循环；98℃10min；4℃60min，升降温速率2℃/s。
如上所述的微滴式数字PCR方法，优选地，在步骤S4中，样品检测结果≥1copies/μL判断为阳性，样品检测结果<0copies/μL判断为阴性。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的核酸，其添加了探针，因此特异性强，本发明提供的微滴式数字PCR方法检测灵敏度高于现有的 qPCR方法，可检测到低至单个拷贝的目的核酸，且无需依赖标准曲线可对样品初始拷贝数进行定量，可实现牛传染性鼻气管炎病毒的精准检疫。本发明的方法添加了探针，因此特异性强，而现有技术中基于SYBR Green的 qPCR方法，因为没有探针，特异性较差，灵敏度不高。
本发明提供的微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒，用于检测时生成油包水微滴密闭性好，可避免PCR扩增产物引起的污染，因此也可有效避免 PCR扩增产物扩散而引起的污染，其灵敏度可达1copies/μL，并能特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒。使用本发明提供的试剂盒检测牛传染病鼻气管炎病毒疑似样品，结果表明该试剂盒准确率高于qPCR，可以实现痕量病毒的检测，且无需标准曲线即可对核酸进行绝对定量。因此本发明实现对牛传染性鼻气管炎病毒的高特异性、高灵敏度、绝对定量检测。
本发明提供的方法采用的是ddPCR，反应体系微滴化，通过泊松分布和阳性微滴数可直接计算出病毒含量，可实现绝对定量检测，本发明提供的检测方法摆脱了对标准品和Ct值的依赖，实现超高灵敏度，直接计算出起始的核酸靶标数量，而qPCR方法需建立标准曲线后才能计算拷贝数，且为相对定量。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的IBRV ddPCR引物探针筛选结果。
图2为本发明实施例1提供的IBRV qPCR扩增曲线。
图3为本发明实施例2提供的IBRV ddPCR退火温度优化结果。
图4为本发明实施例5提供的IBRV ddPCR特异性检验结果。
图5为本发明实施例6提供的IBRV ddPCR灵敏度检验结果。
图6为本发明实施例6中提供的IBRV qPCR线性关系分析结果。
图7为本发明实施例6中提供的ddPCR线性关系分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。
实施例1 IBRV ddPCR方法的建立
将GenBank公布的IBRV的gB基因序列(如有登录号： KU198480.1\JN787952.1\KY215944.1\MH751901.1\MG407790.1\KM258883.1\ KM258880.1\KM258881.1\JK898220.1等)进行序列比对，进一步确定了IBRV gB基因的保守区域(第1800-2100位DNA片段，其序列如SEQ ID NO.4所示序列)，并针对该保守区域的首部、中部和尾部设计引物和探针，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；探针的5′端标记有FAM荧光基团，探针3′端标记有BHQ1淬灭基团。设计引物和探针序列提供部分进行说明，具体序列如表1所示。
表1 IBRV ddPCR检测引物和探针的序列
Figure BDA0002467457800000051
*表示在gB基因中位置。
2.毒株和临床样品
本发明中使用的牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型由北京市动物疫病预防控制中心实验室保存，口蹄疫病毒(O型)标准毒购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(菌种保藏编号：CVCC AV1538)。110份临床样品包括：100份鼻拭子样品、淋巴结5份、肺脏5 份，收集于北京地区养牛场，160份牛传染性鼻气管炎病毒模拟临床样品(100 份血液样品、60份粪便样品)。
3.病毒基因组的提取
使用TGuide S32磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技 (北京)有限公司，货号DP604)操作说明书进行病毒DNA或RNA提取，提取的DNA或RNA存放在-80℃冰箱中备用。
4.IBRV gB基因DNA质粒模板的合成
根据GenBank公布的IBRV gB基因序列(登录号： KU198480.1\JN787952.1\KY215944.1\MH751901.1\MG407790.1\KM258883.1\ KM258880.1\KM258881.1\JK898220.1)进行序列比对，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成序列如SEQ ID NO.4所示的质粒；其中，SEQ ID NO.4： GGACGCCATGGCCGTGACGTACTGCCACGAGCTGGGCGAGGGGCGCGTGTTCATCGAGAACTCGATGCGCGCGCCCGGCGGCGTTTGCTACAGCC GCCCGCCGGTCTCCTTTGCCTTCGGCAACGAGAGCGAGCCGGTGGAGG GCCAGCTCGGCGAGGACAACGAGCTGCTGCCGGGCCGCGAGCTCGTG GAGCCCTGCACCGCCAACCACAAGCGCTACTTCCGCTTTGGCGCGGAC TACGTGTACTACGAGAACTACGCGTACGTGCGGCGGGTCCCGCTCGCG GAGCTGGAGGTGATC，并克隆到pUC57载体，命名为pIBRV/ddPCR-0质粒。用质粒提取试剂盒(Promega，USA)提取质粒。用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计(ThermoFisher Scientific)定量纯化后的DNA稀释成1.0×105copies/μL，随后进行10倍倍比稀释至1.0×100copies/μL，置于-80℃冰箱保存备用。
5引物筛选
以步骤4制备的1.0×104copies/μL浓度的pIBRV/ddPCR-0质粒为模板，采用微滴式数字PCR方法对步骤1设计合成的A、B、C 3组引物探针进行扩增，根据拷贝数的高低选择最佳引物探针。
筛选引物所用数字PCR反应体系组分为：2×ddPCR Supermix 10μL，DNA 模板2μL，正向引物(10pmol/μL)1.8μL，反向引物(10pmol/μL)1.8μL，探针(10pmol/μL)0.5μL，DNase-free water 3.9μL，总体积为20μL。
筛选引物所用数字PCR反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s， 56℃退火30s，40个循环；98℃10min；4℃∞，升降温速率2℃/s。
通过比较A、B、C 3组引物探针对1.0×104copies/μL浓度的 pIBRV/ddPCR-0质粒进行数字PCR扩增拷贝数的高低，选择最佳引物探针组合。结果如图1所示，B组引物扩增拷贝数最高，为515copies/μL，因此选B组为牛传染性鼻气管炎病毒微滴式数字PCR最佳引物探针组合。
6.IBRV-qPCR方法的建立
采用步骤5筛选的引物和探针建立实时qPCR方法，qPCR反应体系如下：
Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)12.5μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，探针(10μM)0.6μL，无核酸酶水μL，DNA模板(浓度为)2μL。
反应条件预变性95℃30s；变性95℃5s，退火58℃30s，40cycles。
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成序列如SEQ ID NO.4所示的第98-249位的bp作为IBRV-gB基因保守区域的DNA片段，并克隆到pUC57 载体，命名为pIBRV/ddPCR质粒。将该质粒进行10倍倍比稀释，以1.0×105copies/μL-1.0×10copies/μL为模板做qPCR，每个稀释度重复3次，进行qPCR，获得qPCR扩增曲线如图2所示，从左往右模板的浓度依次为1.0×105copies/μL、1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL、1.0×102copies/μL、 1.0×10copies/μL，均可检测出来，且具有良好的扩增曲线和线性关系，说明本发明所设计的引物、探针较好。
实施例2IBRV ddPCR退火温度的优化
将实施例1中合成的IBRV gB基因DNA质粒(pIBRV/ddPCR质粒)稀释至1.0×105copies/μL后为模板在进行ddPCR检测，ddPCR反应体系包括 2×ddPCR Supermix 10μL，DNA模板2μL，正向引物(SEQ ID NO.1) (10pmol/μL)1.8μL，反向引物(SEQ ID NO.2)(10pmol/μL)1.8μL，探针 (SEQ ID NO.3)(10pmol/μL)0.5μL，DNase-free water 3.9μL，总体积为 20μL。
做6个复孔，转移至微滴发生卡上后，置于微滴生成仪上生成微滴。将生成的微滴转移至96孔反应板上后用PX1热封仪于180℃封膜5s。将封好膜的96孔反应板置于PCR仪上进行扩增。
反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，以52℃、54℃、56℃、 58℃、60℃、62℃为温度梯度进行退火30s，40个循环；98℃10min；4℃∞，升降温速率2℃/s。通过比较ddPCR的微滴荧光信号强度等来确定最终的退火温度。结果如图3所示，退火温度在58℃时荧光信号最强，且测得的阳性拷贝数最高，因此IBRV ddPCR退火温度选择58℃。
实施例3IBRV ddPCR引物浓度和探针浓度的确定
将实施例1中合成的IBRV gB基因DNA质粒(pIBRV/ddPCR质粒)稀释至1.0×105copies/μL后为模板在进行ddPCR扩增，ddPCR反应体系包括 2×ddPCR Supermix forProbes 10μL，DNA模板2μL；正向引物(SEQ ID NO.1) 和反向引物(SEQ ID NO.2)终浓度为500～900nM，探针(SEQ ID NO.3) 终浓度为100～300nM，引物终浓度以100nM递增，探针终浓度以50nM 递增进行正交试验；其余用DNase-free water补齐至20μL。
反应参数为：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火30s，40个循环；98℃10min；4℃∞，升降温速率2℃/s。
结果表明，正向引物和反向引物终浓度各为700nM，探针终浓度为300 nM时，阳性微滴信号和阴性微滴信号区分最为明显，因此IBRV ddPCR正向引物和反向引物终浓度为700nM，探针终浓度为300nM。
实施例4试剂盒组成
(1)ddPCR预混液：含有实施例1设计的引物(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示序列)、探针(SEQ ID NO.3)、2×ddPCR Supermix(可购自BIO-RAD，货号186-3026)以及RNase-free Water；
(2)阴性对照：RNase-free Water，可购自Takara，货号9012；
(3)阳性对照：pIBRV/ddPCR质粒，浓度为7.3×103copies/μL，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
(4)微滴生成油：可购自BIO-RAD，货号186-3005；
(5)微滴发生卡：可购自BIO-RAD，货号186-4008；
(6)微滴发生卡密封垫：可购自BIO-RAD，货号186-3009；
(7)
Figure BDA0002467457800000091
96real-time PCR板：可购自Eppendorf，货号 0030132530；
(8)热封箔膜，PCR洁净级：可购自Eppendorf，货号0030127854。
实施例5IBRV ddPCR特异性检验
对口蹄疫病毒(FMDA)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)等病毒的核酸进行实施例3确定的IBRV ddPCR检测，采用实施例4中的试剂盒，具体检测步骤如下：(1)配制ddPCR反应液：
采用20μL反应体系：包括18μL ddPCR预混液和2μL DNA模板，其中ddPCR预混液包含2×ddPCR Supermix 10μL，探针(10pmol/μL)0.6μL，正向引物(10pmol/μL)1.4μL，反向引物(10pmol/μL)1.4μL，DNase-free water 4.6μL。
(2)将步骤(1)配制的ddPCR反应液转入微滴生成卡中，利用微滴生成仪生成微滴；
(3)将步骤(2)制备的微滴转入PCR板中，置于PCR仪中进行扩增；扩增条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火1min，40个循环； 98℃10min；4℃60min，升降温速率2℃/s。
(4)将步骤(3)扩增完成的PCR板置于微滴分析中，进行荧光读取，自动计算目的核酸片段含量。
(5)根据步骤(4)中获得的目的核酸片段含量进行结果判定：阳性对照：7300±100copies/μL；(2)阴性对照：<0copies/μL；待测样本结果判定：(1)阳性：标本检测结果≥1copies/μL。(2)阴性：标本检测结果<0 copies/μL。
结果如图4所示，口蹄疫病毒(FMDA)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)的结果全为0 copies/μL；Negative为阴性对照(RNase-free Water)结果为0copies/μL；检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，结果为378copies/μL，阳性结果。结果表明本发明所建立的IBRV ddPCR与其他病毒无交叉反应，特异性良好。
实施例6IBRV ddPCR灵敏度检验
将实施例1中合成的IBRV gB基因DNA质粒进行10倍倍比稀释，以 1.0×105copies/μL-1.0copies/μL为模板进行实施例5中的ddPCR方法步骤和实施例1中实时qPCR方法进行检测，计算IBRV ddPCR方法的最低检出限和线性关系。ddPCR方法的扩增结果图如图5所示，具体结果如表2所示，IBRV ddPCR方法的最低检测出限为1copies/μL，优于qPCR的最检出限10 copies/μL，实时qPCR方法的线性关系如图6所示，IBRV ddPCR方法的线性关系如图7所示，其中，IBRV ddPCR方法的R2为0.9977，表明本发明方法线性关系良好。
表2 IBRV ddPCR和qPCR检测限比较
Figure BDA0002467457800000111
实施例7 IBRV ddPCR重复性检验
将实施例1中合成的IBRV gB基因DNA质粒稀释至1.0×104copies/μL，并以此浓度DNA质粒为模板进行ddPCR检测(按实施例5中的方法)，重复4次同时分不同时间段检测4次，计算拷贝数变异系数对IBRV ddPCR方法批内和批间重复性进行评估；结果如表3所示。
表3 IBRV ddPCR批内和批间重复性分析
Figure BDA0002467457800000112
结果表明批内重复性变异系数为1.93％、批间重复性变异系数为3.21％，均小于5％，表明IBRV ddPCR批内、批间重复性良好。
实施例8 IBRV ddPCR临床样品检测
使用本发明实施例4提供的IBRV ddPCR检测试剂盒检测110份IBRV 疑似样品和160份牛传染性鼻气管炎病毒模拟临床样品，并与qPCR检测结果进行比对。
qPCR检测采用牛疱疹病毒Ⅰ型实时荧光PCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)。
结果如表4所示，鼻拭子、淋巴结和肺脏等110份IBRV临床疑似样品和160份牛传染性鼻气管炎病毒模拟临床样品，IBRV ddPCR检测试剂盒检出阳性178份，而qPCR检出阳性172份，6份样品qPCR检测阴性而ddPCR 检测阳性，其中4份为牛传染性鼻气管炎病毒模拟临床样品，2份为临床采集鼻拭子样品。将上述2份临床采集鼻拭子样品进行核酸富集，即在核酸提取时分别从样品中各取5份提取液裂解后，采用同一离心柱进行离心富集，以提取核酸为模板进行qPCR第一次扩增，然后在以第一次扩增的反应液为模板进行qPCR第二次扩增，结果显示上述2份鼻拭子样品IBRV阳性。以上结果表明IBRV ddPCR检测试剂盒准确率高于qPCR，对低拷贝样品也能实现精准检测，而qPCR方法对痕量病毒无法做出精准检测。
表4临床样品检测
Figure BDA0002467457800000121
注：*为牛传染性鼻气管炎病毒模拟临床样本。
综上，本发明提供的一种用于高灵敏度检测牛传染性鼻气管炎病毒的微滴式数字PCR方法绝对定量检测试剂盒及其引物、探针和方法，特异性好、灵敏度高、无需标准曲线可直接定量，检测方便快捷、结果准确可靠，可应用于临床上牛传染性鼻气管病毒核酸感染的精准检测，同时还能对牛传染性鼻气管炎病毒进行直接绝对定量，有利于牛传染性鼻气管病的监测和防控。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京市动物疫病预防控制中心
<120> 用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字PCR方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgccggtct cctttgcctt 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagtacacgt agtccgcgcc aa 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccctccaccg gctcgctctc gtt 23
<210> 4
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggacgccatg gccgtgacgt actgccacga gctgggcgag gggcgcgtgt tcatcgagaa 60
ctcgatgcgc gcgcccggcg gcgtttgcta cagccgcccg ccggtctcct ttgccttcgg 120
caacgagagc gagccggtgg agggccagct cggcgaggac aacgagctgc tgccgggccg 180
cgagctcgtg gagccctgca ccgccaacca caagcgctac ttccgctttg gcgcggacta 240
cgtgtactac gagaactacg cgtacgtgcg gcgggtcccg ctcgcggagc tggaggtgat 300
c 301
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcgagaact cgatgcgcg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgccgcacg tacgcgtag 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacgagctg ctgccggg 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgccttcggc aacgagagcg ag 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgagcggga cccgccgcac g 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
actacgagaa ctacgcgta 19

Claims (10)

1.一组用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸，其特征在于，其包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照含如SEQID NO.4所示的第98-249位的bp。
3.一种用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的核酸，其中，探针的5′端标记有荧光基团，探针的3′端标记有淬灭基团。
4.一种用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒，其包括如权利要求1或2所述的核酸、ddPCR预混液、微滴生成油、微滴发生卡、微滴发生卡密封垫、96孔PCR反应板和热封箔膜，其中，探针的5′端标记有荧光基团，探针的3′端标记有淬灭基团。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM、TET、JOE、NED、VIC、ROX或TAMRA，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3或TAMRA。
6.一种用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的微滴式数字PCR方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、将提取的DNA加入ddPCR反应液中，反应液中含有如上所述的核酸；
S3、进行微滴式数字PCR反应；
S4、扩增完成，进行荧光读取，自动计算目的核酸片段含量。
7.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，在步骤S2中，所述反应液中，正向引物、反向引物的终浓度为700nM，探针的终浓度为300nM，探针的5′端标记有FAM荧光基团，探针3′端标记有BHQ1淬灭基团。
8.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，所述反应液为20μL反应体系，包括18μL ddPCR预混液和2μL DNA模板，其中ddPCR预混液包含2×ddPCR Supermix 10μL，10pmol/μL的探针0.6μL，10pmol/μL的正向引物1.4μL，10pmol/μL的反向引物1.4μL，DNase-free water4.6μL。
9.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，在步骤S3中，所述微滴式数字PCR反应的条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火1min，40个循环；98℃10min；4℃60min，升降温速率2℃/s。
10.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，在步骤S4中，样品检测结果≥1copies/μL判断为阳性，样品检测结果<0copies/μL判断为阴性。
CN202010338406.6A 2020-04-26 2020-04-26 用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字pcr方法 Pending CN111560471A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010338406.6A CN111560471A (zh) 2020-04-26 2020-04-26 用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字pcr方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010338406.6A CN111560471A (zh) 2020-04-26 2020-04-26 用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字pcr方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111560471A true CN111560471A (zh) 2020-08-21

Family

ID=72071788

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010338406.6A Pending CN111560471A (zh) 2020-04-26 2020-04-26 用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字pcr方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111560471A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080590A (zh) * 2020-09-29 2020-12-15 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种用于检测b型牛鼻病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒
CN112941236A (zh) * 2021-03-10 2021-06-11 广东海洋大学 一种检测牛精液中bvdv1型的组合物、试剂盒及应用
CN112961944A (zh) * 2021-05-07 2021-06-15 新疆农业大学 一种检测牛冠状病毒的检测方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101701265A (zh) * 2009-11-17 2010-05-05 新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法及应用
CN103160615A (zh) * 2013-03-06 2013-06-19 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重pcr引物及其设计方法
CN104862419A (zh) * 2015-06-01 2015-08-26 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物、探针及试剂盒
CN107686865A (zh) * 2017-10-17 2018-02-13 南京农业大学 检测i型牛疱疹病毒的引物对、探针、试剂盒及方法
CN107881259A (zh) * 2017-11-15 2018-04-06 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的pcr扩增引物及其应用
CN108048600A (zh) * 2017-01-13 2018-05-18 内蒙古农业大学 一种牛传染性鼻气管炎病毒的荧光定量pcr检测方法
CN108866164A (zh) * 2018-07-05 2018-11-23 南方医科大学 B族链球菌的检测方法及试剂盒
CN110157836A (zh) * 2018-04-04 2019-08-23 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101701265A (zh) * 2009-11-17 2010-05-05 新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法及应用
CN103160615A (zh) * 2013-03-06 2013-06-19 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重pcr引物及其设计方法
CN104862419A (zh) * 2015-06-01 2015-08-26 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物、探针及试剂盒
CN108048600A (zh) * 2017-01-13 2018-05-18 内蒙古农业大学 一种牛传染性鼻气管炎病毒的荧光定量pcr检测方法
CN107686865A (zh) * 2017-10-17 2018-02-13 南京农业大学 检测i型牛疱疹病毒的引物对、探针、试剂盒及方法
CN107881259A (zh) * 2017-11-15 2018-04-06 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的pcr扩增引物及其应用
CN110157836A (zh) * 2018-04-04 2019-08-23 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法
CN108866164A (zh) * 2018-07-05 2018-11-23 南方医科大学 B族链球菌的检测方法及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEENADEVI THONUR ET AL.: ""One-step multiplex real time RT-PCR for the detection of bovine respiratory syncytial virus,bovine herpesvirus 1 and bovine parainfluenza virus 3"", 《BMC VETERINARY RESEARCH》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080590A (zh) * 2020-09-29 2020-12-15 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种用于检测b型牛鼻病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒
CN112941236A (zh) * 2021-03-10 2021-06-11 广东海洋大学 一种检测牛精液中bvdv1型的组合物、试剂盒及应用
CN112961944A (zh) * 2021-05-07 2021-06-15 新疆农业大学 一种检测牛冠状病毒的检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112342319B (zh) 一种引物组合、探针组合及其在检测猪病毒中的应用、检测试剂、试剂盒及检测方法
Yu et al. Development of a real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN113502352B (zh) 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用
CN111560471A (zh) 用于牛传染性鼻气管炎病毒检测的核酸、试剂盒及微滴式数字pcr方法
CN105624330A (zh) 同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法
CN110004240B (zh) 基于rpa的鸡毒支原体的实时荧光检测试剂盒、试纸条检测试剂盒及其用途
CN111549184B (zh) 一种呼吸道腺病毒的pcr荧光检测试剂盒及其应用
CN106048094B (zh) 猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒及引物和探针
WO2020034317A1 (zh) 塞内卡病毒和口蹄疫病毒双重实时荧光定量pcr检测试剂及试剂盒
CN113913552B (zh) 小鼠肝炎病毒实时荧光rt-rpa检测的引物和探针、试剂盒及检测方法
CN107699635B (zh) 猪流行性腹泻病毒荧光rpa检测方法
CN113249517A (zh) 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒
CN111676278A (zh) 一种检测新型冠状病毒n基因的引物和探针及其试剂盒和方法
CN111394515B (zh) 一种用于检测犬细小病毒的lamp引物组、荧光可视化快速试剂盒及方法
CN113652505A (zh) 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒
CN105713993A (zh) 用于检测多种呼吸道病毒的pcr引物组、探针组及试剂盒
CN113186359B (zh) 猪星状病毒检测和分型富集多重pcr快速诊断试剂盒
Yang et al. A lateral flow dipstick combined with reverse transcription recombinase polymerase amplification for rapid and visual detection of the BVDV and BPIV3
CN110656163A (zh) 一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法
CN114958975A (zh) 重组酶介导的等温核酸扩增组合产品
JP2008529548A (ja) ウイルスを用いることによる試料中の生細胞を検出するための方法
CN111926109B (zh) 非洲猪瘟病毒荧光热对流pcr扩增引物对、探针引物、及制备的试剂盒
CN110724763A (zh) 人腺病毒和博卡病毒荧光定量pcr检测方法及其应用
CN115786587A (zh) 一种用于同时检测4种病原体的多重pcr的引物组及其检测方法、试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200821

RJ01 Rejection of invention patent application after publication