CN112080590A

CN112080590A - 一种用于检测b型牛鼻病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN112080590A
Application number: CN202011049496.3A
Authority: CN
Inventors: 翟少伦; 谢逸伦; 翟颀; 吕殿红; 魏文康; 温肖会; 贾春玲; 周秀蓉
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2020-12-15
Also published as: AU2021102364A4

Abstract

本发明公开了一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒。本发明所研制的B型牛鼻病毒荧光PCR检测试剂盒，包括SEQ ID NO.1‑2的引物和荧光PCR探针，具有特异性强、敏感性高、省时省力的优点。本试剂盒为B型牛鼻病毒的检测、流行病学调查、监测净化等方面提供了相应的技术支持与帮助。

Description

一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒。

背景技术

B型牛鼻病毒(Bovine rhinitis B virus，BRBV)是一种新的小RNA病毒，临床上常与牛的呼吸道疫病有关。该病毒流行于美国、瑞典、墨西哥等国家。近年也流行于中国广东省某些奶牛场。

B型牛鼻病毒基因组存在遗传多样性，受到外界环境影响大，而且现有的检测方法难以获知真实特异的实验数据，因此有必要研发一种用于检测B型牛鼻病毒的快速PCR试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别B型牛鼻病毒荧光PCR引物。

本发明的目的在于提供一种鉴别B型牛鼻病毒荧光PCR检测方法。

本发明的目的在于提供一种鉴别B型牛鼻病毒荧光PCR试剂盒。

文献报道中，记载的B型牛鼻病毒遗传序列较少，相对完整的遗传序列只有9条，但相互间相似性不高，这些序列对于引物设计的广谱性要求很高，设计难度大。如图1所示，9条完整的B型牛鼻病毒编码蛋白序列的相似性比对结果显示，相似性中位数为81.35％，平均数83.21％。

根据现有报道的缺陷，申请人针对全长序列设计了两组引物，事后通过比对发现其引物结合位点对应的B型牛鼻病毒的序列一致性较低，如图2所示，变异位点过于密集，无法设置简并碱基。再经过重新筛选，最终选出本发明相对保守的序列进行引物设计，并遵循简并碱基尽可能少、尽可能分散，且保证单条引物或探针与上述9条序列中任意序列错配不超过2个碱基的原则，适当设置简并碱基。图3为本方法筛选出来的引物、探针与9条序列的匹配度。

本发明提供了一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR扩增引物，所述引物的核苷酸序列为：

BRBV-F:CGTGGCACACTTCAGGAG；

BRBV-R:GTGTACCCAYCTCARACGAAG。

本发明的又一方面，提供了一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR探针，所述探针的核苷酸序列为：BRBV-probe：TRGCRGGTCTCGCTTTYCACAGT。

根据本发明的实施例，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，探针序列3’端的淬灭基团为BHQ1。

本发明的又一方面，提供了一种检测B型牛鼻病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的引物和荧光PCR探针。

根据本发明的实施例，还包括One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix、阳性对照和阴性对照。

本发明的又一方面，提供了一种检测B型牛鼻病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的RNA；

(2)以提取的RNA为模板，用前面所述引物组、荧光PCR探针进行荧光PCR扩增，获得扩增曲线；

(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，判断样品中是否有B型牛鼻病毒；

该检测方法不适用于疾病的诊断与治疗。

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述的扩增体系为：

引物BRBV-F 2.0μL，引物BRBV-R 2.0μL，探针BRBV-probe 1.5μL，One StepPrimeScript III RT-qPCR Mix(2×)12.5μL，ddH₂O 5.0μL，核酸2.0μL。

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述的扩增程序为：52℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性5s，58℃退火延伸30s，循环45次。

根据本发明的实施例，步骤(3)中所述的结果判定：样品出现S曲线且Ct值≦36，判定为B型牛鼻病毒核酸阳性；36<Ct值≦40判定为可疑；Ct值>40或是无Ct值则判定为B型牛鼻病毒核酸阴性。

本发明的又一方面，提供了前面所述的引物、前面所述探针在制备检测B型牛鼻病毒试剂中的应用。

根据本发明的实施例，所述检测步骤如下：

(1)提取待检样品的RNA；

(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，判断样品中是否有B型牛鼻病毒。

本发明的有益效果是：

本发明的检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒，可用于B型牛鼻病毒的检测。具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。能够为B型牛鼻病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。而且有助于B型牛鼻病毒精准检测，便于养牛场开展B型牛鼻病毒的监测净化，进而促进养牛业健康发展，为B型牛鼻病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

附图说明

图1是九条公开的B型牛鼻病毒基因间的相似性比对。

图2是九条公开的B型牛鼻病毒基因的相似性分析结果。

图3是本发明的B型牛鼻病毒荧光PCR检测引物与探针的匹配性。

图4是B型牛鼻病毒荧光PCR检测试剂盒临床样品检测结果；曲线①：B型牛鼻病毒阳性对照；曲线②、③：临床阳性样品。

图5是B型牛鼻病毒荧光PCR检测试剂盒特异性试验结果；曲线①：B型牛鼻病毒阳性对照扩增曲线；曲线②：口蹄疫病毒、塞内卡病毒、边界病毒、牛病毒性腹泻病毒、D型流感病毒的扩增曲线。

图6是B型牛鼻病毒荧光PCR检测试剂盒敏感性试验结果；曲线①-

分别为阳性质粒的10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍、10¹⁰倍、10¹¹倍的倍比稀释结果。

具体实施方式

材料：B型牛鼻病毒阳性重组质粒取自广东省农业科学院动物卫生研究所。口蹄疫病毒、塞内卡病毒、D型流感病毒取自广东省农业科学院动物卫生研究所。此外，边界病毒毒株、牛病毒性腹泻阳性毒株由江苏省农业科学院兽医研究所毛立博士馈赠。

试剂：One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix(2×)试剂等购自宝日医生物技术(北京)有限公司、双蒸水等购自天根生化科技(北京)有限公司。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

根据B型牛鼻病毒基因序列，经过大量筛选设计出，能够扩增B型牛鼻病毒基因序列的引物对BRBV-F和BRBV-R，以及TaqMan探针，其碱基序列如下所示

BRBV-F:CGTGGCACACTTCAGGAG(SEQ ID NO:1)；

BRBV-R:GTGTACCCAYCTCARACGAAG(SEQ ID NO:2)。

BRBV-probe:FAM-TRGCRGGTCTCGCTTTYCACAGT-BHQ1(SEQ ID NO:3)。

BRBV-probe的5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为BHQ1。

实施例2

(1)人工合成B型牛鼻病毒靶基因序列，连接至载体上，将重组的载体DNA作为阳性质粒，进行PCR扩增。同时以ddH₂O作为阴性对照。

(2)以制备的阳性质粒，用实施例1引物组BRBV-F、BRBV-R和探针BRBV-probe在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行荧光PCR扩增，扩增体系为：

引物BRBV-F 2.0μL，引物BRBV-R 2.0μL，探针BRBV-probe 1.5μL，One StepPrimeScript III RT-qPCR Mix(2×)12.5μL，ddH₂O 5.0μL，核酸2.0μL，体系总体积为25μL。

扩增程序为：52℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性5s，58℃退火延伸30s，循环45次。

(3)结果判定方法为：阳性对照有标准S曲线产生，阴性对照无曲线产生的情况下，待检样品出现典型的S曲线且Ct值≦36，判定为B型牛鼻病毒核酸阳性；36<Ct值≦40判定为可疑；Ct值>40或是无Ct值则判定为B型牛鼻病毒核酸阴性。

实施例3

(1)以湖南、广东和海南等地区采集临床牛样本105份，提取鼻腔拭子以及肺脏组织中的病毒RNA，作为荧光PCR的模板。

(2)以模板进行荧光PCR检测，扩增体系、扩增程序均和实施例2相同。

(3)结果判定：经检测，105份临床样本中有2份B型牛鼻病毒阳性样本，进一步经核酸测序，确定该样本感染B型牛鼻病毒。如图4所示，曲线①：B型牛鼻病毒阳性对照；曲线②、③：临床阳性样品。

下面对本发明的方法进一步检测灵敏性和特异性。

特异性试验

提取口蹄疫病毒、塞内卡病毒、边界病毒、牛病毒性腹泻病毒、D型流感病毒、B型牛鼻病毒的核酸进行荧光PCR扩增，来检测该试剂盒的特异性，按试剂盒体系配制试剂和设置反应程序。

结果显示，图5所示，只有B型牛鼻病毒阳性对照出现S曲线并有Ct值，而口蹄疫病毒、塞内卡病毒、边界病毒、牛病毒性腹泻病毒、D型流感病毒等未呈现S曲线且无Ct值，表明本发明试剂盒具有良好的特异性。

灵敏性试验

选取B型牛鼻病毒阳性重组质粒为模板(浓度为69.37ng/μL)，进行倍比稀释(分别为10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍、10¹⁰倍、10¹¹倍11个梯度稀释)，来测定该方法的敏感性。

结果显示：图6的最右边曲线的结果为最高的稀释倍数10⁹，即优化后的试剂盒敏感性为6.937×10^﹣5pg/μL，换算为拷贝为22.3拷贝/μL，表明本试剂盒有较高的灵敏度。

综上所述，本发明的试剂盒灵敏性较高以及具有良好的特异性，因此本发明的试剂盒可以用于B型牛鼻病毒感染的检测和预防。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

cgtggcacac ttcaggag 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

gtgtacccay ctcaracgaa g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

trgcrggtct cgctttycac agt 23

Claims

1.一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR扩增引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

BRBV-F:CGTGGCACACTTCAGGAG；

BRBV-R:GTGTACCCAYCTCARACGAAG。

2.一种用于检测B型牛鼻病毒的荧光PCR探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：BRBV-probe：TRGCRGGTCTCGCTTTYCACAGT。

3.根据权利要求2所述的荧光PCR探针，其特征在于，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，探针序列3’端的淬灭基团为BHQ1。

4.一种检测B型牛鼻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1的引物和权利要求2或3的荧光PCR探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix、阳性对照和阴性对照。

6.一种检测B型牛鼻病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的核酸；

(2)以提取的核酸为模板，用权利要求1的引物组、权利要求2或3的荧光PCR探针进行荧光PCR扩增，获得扩增曲线；

该检测方法不适用于疾病的诊断与治疗。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述扩增的体系为：引物BRBV-F2.0μL，引物BRBV-R 2.0μL，探针BRBV-probe 1.5μL，One Step PrimeScript III RT-qPCRMix(2×)12.5μL，ddH₂O 5.0μL，核酸2.0μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述扩增的程序为：52℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性5s，58℃退火延伸30s，循环45次。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的结果判定：样品出现S曲线且Ct值≦36，判定为B型牛鼻病毒核酸阳性；36<Ct值≦40判定为可疑；Ct值>40或是无Ct值则判定为B型牛鼻病毒核酸阴性。

10.权利要求1所述的引物、权利要求2或3所述探针在制备检测B型牛鼻病毒试剂中的应用。