CN110643744B

CN110643744B - 一种同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法及其引物探针组合

Info

Publication number: CN110643744B
Application number: CN201911134790.1A
Authority: CN
Inventors: 宋素泉; 闫丽萍; 张曦予
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: CN110643744A

Abstract

本发明公开了一种同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法及其引物探针组合，所述引物探针组合序列分别为FPV‑F、FPV‑R、FPV‑P、FHV‑1‑F、FHV‑1‑R、FHV‑1‑P、FCV‑F、FCV‑R、FCV‑P。本发明提供的多重荧光定量PCR方法同时检测FPV、FHV‑1、FCV三种猫病毒，检测特异性强、敏感性高、操作简便快速，能够在临床样本中快速鉴别诊断猫是否感染上述需检测的病毒，同时能定量监测猫的发病情况，为临床上猫FPV、FHV‑1、FCV病毒的监测、流行病学调查以及这些疾病的防控提供了一种有效的检测手段。

Description

一种同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法及其引物探针组合

技术领域

本发明属于猫易感病毒定量检测技术领域，具体涉及一种同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法及其引物探针组合。

背景技术

随着经济的增长，国民生活水平的提高，我国宠物豢养也日渐兴起，近年来已成为不少人的一种生活时尚。从中国养宠家里宠物拥有量来看，2018年宠物猫数量为6700万只，占宠物数量的30.7％，且还在逐年上升。同时，猫作为实验动物，在医学、生物学等研究领域的应用也越来越广泛，猫的健康也越来越得到重视。目前影响猫科动物健康最常见的三种病毒是猫细小病毒(FPV)、猫疱疹病毒I型(FHV-1)和猫杯状病毒(FCV)。这些病毒常发于幼猫，在临床上往往以混合感染的形式存在且症状难以区分，仅靠肉眼观察难以作出快速鉴别诊断，因此建立能够适用于这些病毒鉴别检测的方法十分重要。

目前检测猫病毒病的方法包括：病毒分离鉴定、血清学检测、ELISA、免疫电镜、常规PCR等。但由于临床上部分患病猫恢复健康会成为无临床症状的病毒携带者，并在机体免疫力下降或应激情况下会不定期向体外排毒，此时做血清学诊断会呈现假阳性结果。因此血清学诊断有一定的局限性。除此之外，病毒分离培养和电镜检查，也因价格昂贵和耗时过长也没能在临床诊断上广泛运用。因此建立一种省时、省力、灵敏、高效的检测的方法迫在眉睫。

基于分子生物技术建立的常规PCR诊断方法自上世纪九十年代开始映入大众视野，因其有着快速、敏感、特异性好的特点，被广泛应用于各种疾病的诊断。虽然其特异性好，检测灵敏度较高，但测定的只是终产物而不是起始模板拷贝数，两者之间没有线性关系。因此不易于定量检测。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明提供一种同时检测三种猫易感病毒的引物探针组合。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种同时检测三种猫易感病毒的引物探针组合，其中：所述引物探针组合序列分别为FPV-F、FPV-R、FPV-P、FHV-1-F、FHV-1-R、FHV-1-P、

FCV-F、FCV-R、FCV-P；所述引物探针组合从5’端至3’端的序列分别为：

FPV-F：cgggggtggtggtggtt；

FPV-R：gcttgagtttgctgtgatttcc；

FPV-P：ctgggggtgtggggatttctacg；

FHV-1-F：gatttgccgcaccatacct；

FHV-1-R：gagtgggaaacagaccagagag；

FHV-1-P：tcttttacattccagactatccacaataacagg；

FCV-F：cgccctacactgtgatgtg；

FCV-R：gagttctgggtagcaacacat；

FCV-P：tgctcaacctgcgctaacgtgcttaaata。

作为本发明的一个方面，本发明提供所述的引物探针组合同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述的引物探针组合同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法，其包括，利用所述的引物探针组合进行荧光定量PCR扩增。

作为本发明所述的引物探针组合同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法的一种优选方案：所述荧光定量PCR扩增，其反应体系包括1x taq buffer、DNA Polymerase、dNTP mix、Mgcl₂。

作为本发明所述的引物探针组合同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法的一种优选方案：所述荧光定量PCR扩增反应体系为1x taq buffer、0.05U/μl DNAPolymerase、0.25mM dNTP mix、4.125mM Mgcl₂。

作为本发明所述的引物探针组合同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法的一种优选方案：所述引物，其终浓度为0.2μM。

作为本发明所述的引物探针组合同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法的一种优选方案：所述探针，其终浓度为0.1μM。

作为本发明所述的引物探针组合同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法的一种优选方案：所述荧光定量PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性10s，57℃退火及延伸30s，进行40个循环。

作为本发明所述的引物探针组合同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法的一种优选方案：所述三种猫易感病毒的定量检测，其检测限为1x10¹ copies/μl。

作为本发明所述的引物探针组合同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法的一种优选方案：还包括，病毒核酸的提取。

本发明的有益效果：本发明提供的多重荧光定量PCR方法同时检测FPV、FHV-1、FCV三种猫病毒，检测特异性强、敏感性高、操作简便快速，能够在临床样本中快速鉴别诊断猫是否感染上述需检测的病毒，同时能定量监测猫的发病情况，为临床上猫FPV、FHV-1、FCV病毒的监测、流行病学调查以及这些疾病的防控提供了一种有效的检测手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明A：FPV；B：FHV-1；C：FCV三种病毒引物的融解曲线。

图2为本发明A：FPV；B：FHV-1；C：FCV三种病毒引物探针的特异性试验。

图3为本发明A：FPV、B：FHV-1、C：FCV的标准曲线。

图4为本发明引物及探针和对照引物及探针扩增产物的电泳鉴定图。

图5为采用表6中FPV-F1、FPV-R1、FPV-P1、FHV-F1、FHV-R1、FHV-P1、FCV-F1、FCV-R1、FCV-P1引物探针组合的三重方法试验结果。

图6为采用表6中FPV-F2、FPV-R2、FPV-P2、FHV-F1、FHV-R1、FHV-P1、FCV-F2、FCV-R2、FCV-P2引物探针组合的三重方法试验结果。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明同时定量检测FPV、FHV-1、FCV三种猫病毒的步骤为：

(1)基因组准备：

按照Viral RNA Extraction Kit试剂盒说明书分别提取3种病毒已有毒株基因组，按照说明书反转录为cDNA，所有cDNA置于-80℃保存备用。

(2)引物设计与合成：

分别比对FPV、FHV-1、FCV这三种病毒在Genebank中已公布的基因序列，设计特异性引物及探针(表1)和构建标准质粒引物(表2)所示，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

(3)标准质粒构建：

利用上述设计的用于构建质粒的引物，PCR扩增出目的片段，构建到pMD18-T载体上，然后将重组质粒转化到DH5α大肠杆菌感受态中，扩大培养后用TIAN prep MiniPlasmid Kit试剂盒提取各个病毒的质粒，用于后续实验或于-80℃保存备用。

(4)引物特异性验证：

分别以三种病毒已有毒株的质粒为模板，利用上述设计的特异性引物，扩增相应的目的片段。反应体系为20μl，包括2x SYBR Green 10.0μl，上下游引物各0.5μl，单一病毒质粒模板1μl，去离子水补足20μl；反应程序为：95℃2min，95℃10s，57℃30s，40个循环之后，增加一个融解曲线程序：95℃10s，60℃30s，97℃1s，用来判定产物是否单一。

(5)多重荧光定量PCR体系建立：

反应体系为20μl，包括10x taq buffer(无Mg²⁺)2μl，Taq DNA Polymerase(5U/ul)0.2μl，dNTP mix(10mM each)0.5μl，Mgcl₂(25mM)3.3μl，各病毒的上下游引物各0.4μl，探针各0.2μl，单一病毒质粒模板1μl，去离子水补足20μl；反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性10s，57℃退火30s，40个循环，在57℃结束后收集荧光信号。

(6)多重荧光定量PCR特异性检测：

根据已建立的多重荧光定量PCR方法，分别以这3种病毒质粒以及其他常见猫病毒的核酸作为模板，进行扩增，反应体系为20μl，包括10x taq buffer(无Mg²⁺)2μl，Taq DNAPolymerase(5U/ul)0.2μl，dNTP mix(10mM each)0.5μl，Mgcl₂(25mM)3.3μl，各病毒的上下游引物各0.4μl，探针各0.2μl，单一病原模板1μl，去离子水补足20μl；反应程序同上，同时设置去离子水的空白对照组。

(7)多重荧光定量PCR敏感性评价：

利用PlasmidMiniprep Kit提取测序正确的重组质粒，利用Nanodrop2000定量重组质粒浓度,以无菌双蒸水将重组质粒按照1x10⁷ copies/μl-1x10⁰copies/μl 10倍梯度稀释制备质粒标准品。以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板，获得模板拷贝数与临界循环数(Cq)的标准曲线。单一病毒模板通过不同浓度标准品的Cq值，判定该方法所能检测的最小DNA拷贝数即为单重的敏感性；多重敏感性同理，将3种病毒同一浓度质粒标准品混合，得到一个新的标准曲线，从而判定多重敏感性。应用荧光定量分析软件,分析扩增结果。表1为三种病毒特异性引物及探针。表2为三种病毒构建标准质粒引物。表3为优化的多重荧光定量PCR的反应体系。表4为引物的优化(以FPV为例)。

实施例1：

引物的设计与筛选：

根据GenBank中各个病毒的基因，设计特异性探针，并在5’端标记FAM，VIC或TexasRed荧光发射基团，在3’端标记BHQ1或BHQ2荧光淬灭基团，同时针对探针位置，每种病毒设计多对引物进行筛选，选出特异好无交叉反应及扩增效率好的引物，各病毒特异性引物及探针见表1。

质粒标准品制备：

第一步：引物合成

本发明所设计的三对病毒质粒构建引物见表2。

第二步：病毒总核酸提取

按照Viral DNA Extraction Kit试剂盒说明书分别提取FPV、FHV-1的DNA。

按照Viral RNA Extraction Kit试剂盒说明书提取FCV的RNA并马上进行反转录步骤。

第三步：反转录PCR

在无RNase的PCR管中加入FCV的RNA 1μl，使用Thermo Scientific RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit进行RT-PCR反应，其中5x Buffer 4μl，10mM dNTP 2μl，Random Primers 1μl，20U/μl Ribolock RNase1μl，200U/μl ReverAid M-MuLV RTase 1μl，DEPC水10μl，总体系20μl，反应结束后得cDNA。

第四步：PCR扩增

50μl的PCR反应体系：10x taq buffer 5μl，5U/ul DNA Polymerase 0.5μl，10mMdNTP mix 2μl，25mM Mgcl₂ 8μl，以第一步中合成的各个病毒的引物1μl，第二步和第三步得到的DNA/cDNA为模板，加去离子水补足至50μl，分别进行PCR扩增。PCR仪的反应参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

第五步：质粒标准品制备

将第四步获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照DNA Gel Extraction Kit操作方法回收目的片段，将回收产物连接到pMD18-T载体上，通过DH5α大肠杆菌感受态转化，划平板过夜培养后挑取其中白色单菌落进行鉴定，重组质粒序列委托上海生工生物公司进行序列测定。利用PlasmidMiniprep Kit提取测序正确的重组质粒，利用Nanodrop 2000定量重组质粒浓度，以无菌双蒸水将重组质粒按照1x10⁷-1x10⁰ copies/μl 10倍梯度稀释制备质粒标准品。

引物特异性验证：

分别以三种病毒构建的标准质粒为模板，扩增相应的目的片段，每个反应体系为20μl，包括2x SYBR Green 10.0μl，上下游引物各0.4μl，单一病毒质粒模板1μl，去离子水补足20μl；反应程序为：95℃3min，95℃10s，57℃30s，40个循环之后，增加一个融解曲线程序：95℃10s，60℃30s，97℃1s，用来判定产物是否单一。

退火温度优化：

退火温度决定PCR特异性与产量：温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。三重荧光定量PCR反应中有3对引物和3种探针，各自引物的合适的退火温度不同，为此本发明研究了三重荧光定量PCR反应最佳的退火温度。

引物及探针的优化：

不同的引物及探针和模板的结合效率不同，在荧光定量PCR反应中则体现在最终的Cq值会有较大的差异。比如，同样浓度的模板，三个不同的引物，会有不同的Cq值，Cq值小则说明这个引物与模板更易于结合，设计的相对较好，反之则差，见表4。多重荧光定量PCR反应结束后进行电泳验证，图4为本发明筛选出的引物及探针和对照引物及探针扩增产物的电泳鉴定图，对照引物及探针序列见表6。图4以检测FPV的引物及探针为例，从图4可以看出，采用对照引物及探针后，难以获得高灵敏度的检测结果。而本发明引物及探针能够检测出1x10¹ copies/μl的病毒。FHV和FCV的检测呈现出同样的结果，多重荧光定量PCR检测发现，采用本发明引物及探针，不产生交叉反应，因此灵敏度更高，特异性更优。而采用表6中的引物探针组合，则扩增特异性很差，无法实现同时三重荧光定量检测。图5和图6中引物及探针组合已验证能够分别进行单重检测，图5为采用表6中FPV-F1、FPV-R1、FPV-P1、FHV-F1、FHV-R1、FHV-P1、FCV-F1、FCV-R1、FCV-P1引物探针组合的特异性试验。图6为采用表6中FPV-F2、FPV-R2、FPV-P2、FHV-F1、FHV-R1、FHV-P1、FCV-F2、FCV-R2、FCV-P2引物探针组合的特异性试验。可见，采用对照引物及探针组合即使分别能够进行单重检测，但是无法实现同时进行多重定量检测。

反应体系的优化：

使用购买的Premix反应体系，实验结果发现采用该体系进行三重检测的灵敏度很低。因此，本发明优化mix的成分配比，成功建立了更高灵敏度的多重荧光定量PCR反应体系(表3)。Mix成分主要为Taq DNA Polymerase，dNTP mix，Mgcl₂和buffer。不同的酶有不同的扩增特性，为此我们优化了聚合酶的种类和用量。dNTP是在PCR延伸步骤提供原料，在PCR反应中，使用低dNTP浓度，可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入，为此我们摸索了最佳的dNTP浓度。镁离子的作用主要是dNTP-Mg²⁺与核酸骨架相互作用并能影响酶的活性，镁离子浓度高，扩增效率就高，但是特异性会下降；镁离子浓度低，扩增效率会下降，但是特异性会提高，为此我们优选了针对本发明三种病毒检测最佳的镁离子浓度，见表3。

荧光阈值的设定：

阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品及阴性样本的扩增曲线无规则的噪音线的最高点，不出现值并且与阳性对照的指数期相交为准。点击分析界面，取3-10或3-15个循环的荧光信号确定基线。

结果判定：检测样本Cq值≤36，且曲线有明显的指数增长期，测定结果有效，可直接报告样本阳性；检测样本Cq值＞36或检测不到样本Cq值时，报告样本阴性。

多重荧光定量PCR体系建立：

经过以上优化最终建立了多重荧光定量PCR反应体系，反应体系为20μl，三种病毒的重组质粒为模板，分别加入三种病毒的特异性引物和探针，每个引物终浓度为0.2μM，探针终浓度为0.1μM；经优化后的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性10s，57℃退火及延伸30s，进行40个循环后，多重荧光信号的采集在每次延伸结束后进行。标准质粒作为阳性对照，灭菌双蒸水作为阴性对照，每个反应做3个重复。

多重荧光定量PCR特异性检测：

根据已建立的多重荧光定量PCR方法，验证单一引物的特异性。分别以各病毒的质粒为模板作为阳性对照，并加入其它病原如猫冠状病毒、猫免疫缺陷病毒、犬疱疹病毒、猪伪狂犬病毒等病原的核酸，每个反应体系为20μl，包括以上病毒模板1μl，每种病毒引物探针混合物共1μl，10x taq buffer(无Mg²⁺)2μl，Taq DNA Polymerase(5U/ul)0.2μl，dNTPmix(10mM each)0.5μl，Mgcl2(25mM)3.3μl，去离子水补足20μl；反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性10s，57℃退火及延伸30s，进行40个循环后，多重荧光信号的采集在每次延伸结束后进行。标准质粒作为阳性对照，灭菌双蒸水作为阴性对照，每个反应做3个重复。

多重荧光定量PCR敏感性评价：

利用PlasmidMiniprep Kit提取测序正确的重组质粒，利用Nanodrop2000定量重组质粒浓度，以无菌双蒸水将重组质粒按照1x10⁷ copies/μl-1x10⁰copies/μl10倍梯度稀释制备质粒标准品。将三个单一模板等浓度混合为多重模板，从1x10⁷ copies/μl-1x10⁰copies/μl做8个梯度的多重荧光定量PCR，测定多重荧光定量PCR方法的敏感性。表5为本发明三重荧光定量PCR的Cq值，实验结果表明，本发明方法检测限为1x10¹ copies/μl，比传统PCR方法灵敏100倍。根据1x10⁷ copies/μl-1x10²copies/μl质粒浓度和Cq值得关系作出标准曲线，以便实现病毒的定量检测(见图3)。

临床样品检测：

临床样品检测和病毒分离。初步应用建立的方法检测临床样品23份：对2018年9月到2019年10月采自江苏地区的样品，利用多重荧光定量PCR方法检测分析这些病毒的流行情况。

将23份病料研磨液提取病毒核酸并反转录，按照上述方法进行检测。多重荧光定量PCR检测结果显示，在23份病料中，鉴定到FPV阳性病毒5株，FHV-1病毒14株，FCV病毒8株；FHV-1+FCV共感染4株，FPV+FHV-1共感染2株。与商业化单重检测试剂盒POCKIT FPVDetection Kit、POCKIT FHV Detection Kit、POCKIT FCV Detection Kit分别进行检测后的结果完全一致。

病毒的多重荧光定量PCR检测方法与病毒分别检测方法相比具有用时短、敏感性高的特点，病毒分离的阳性结果在多重PCR检测均为阳性。通过本实验初步证实了该方法在病毒的检测方面具有可行性。同时在同一反应孔中实行多种病毒的同时检测，省时省力，节约成本。但传统的多重PCR往往由于多种引物对的干扰，导致方法的灵敏度降低。在本发明中，对引物探针以及体系进行了筛选和优化，使得多重PCR方法仍然有一个很高的灵敏性，检测限为1x10¹ copies/μl。本发明设计得到的FPV、FHV-1、FCV病毒特异性引物探针组合具有较强的特异性，对检测除FPV、FHV-1、FCV病毒以外的病毒都为阴性；批间批内实验表明构建的多重PCR检测方法具有良好的稳定性。

表1

表2

Name	Sequence(5’-3’)	Targeted gene	Length
				FPV-F	cggtggtcaacctgctgtc	VP2	840bp
FPV-R	ggtggtaagcccaatgctctat
				FHV-1-F	gatttgccgcaccatacc	TK	395bp
FHV-1-R	ccacccatcacgccaac
				FCV-F	accgccctacactgtgatg	ORF2	560bp
FCV-R	gctggtgtgaaaggagaagaa

表3

表4

	FPV-F1/R1	FPV-F2/R2	FPV-F3/R3
				Cq值	16.93	17.93	17.41
Cq值	16.73	17.13	17.90
				Cq值	16.84	17.46	17.70
平均Cq值	16.83	17.51	17.60

表5

表6

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法及其引物探针组合

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgggggtggt ggtggtt 17

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcttgagttt gctgtgattt cc 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgggggtgt ggggatttct acg 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttgccgc accatacct 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagtgggaaa cagaccagag ag 22

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcttttacat tccagactat ccacaataac agg 33

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgccctacac tgtgatgtg 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagttctggg tagcaacaca t 21

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgctcaacct gcgctaacgt gcttaaata 29

Claims

1.一种同时检测三种猫易感病毒的引物探针组合，其特征在于：所述引物探针组合由FPV-F、FPV-R、FPV-P、FHV-1-F、FHV-1-R、FHV-1-P、FCV-F、FCV-R和FCV-P引物探针组成；所述FPV-F、FPV-R、FPV-P、FHV-1-F、FHV-1-R、FHV-1-P、FCV-F、FCV-R和FCV-P引物探针从5’端至3’端的序列分别为：

FPV-F：cgggggtggtggtggtt；

FPV-R：gcttgagtttgctgtgatttcc；

FPV-P：ctgggggtgtggggatttctacg；

FHV-1-F：gatttgccgcaccatacct；

FHV-1-R：gagtgggaaacagaccagagag；

FHV-1-P：tcttttacattccagactatccacaataacagg；

FCV-F：cgccctacactgtgatgtg；

FCV-R：gagttctgggtagcaacacat；

FCV-P：tgctcaacctgcgctaacgtgcttaaata；

其中，所述三种猫易感病毒为猫细小病毒、猫疱疹病毒I型和猫杯状病毒。