CN103276106A - 用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重pcr引物组 - Google Patents

用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重pcr引物组 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重PCR检测引物组，所述引物组由三对引物组成，其中，用于猫泛白细胞减少症病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；用于猫疱疹病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；用于猫杯状病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。应用本发明引物序列通过多重PCR方法可同时对猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型进行检测，结果均为阳性，而对其他常见猫源病毒检测结果均为阴性，说明本发明的引物组具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

Description

用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重PCR引物组
技术领域
本发明涉及一套检测病毒的引物，尤其涉及一套用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重PCR引物组，属于病毒检测领域。 
背景技术
猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)又名猫瘟热病毒、猫传染性肠炎病毒、猫细小病毒，属于细小病毒科细小病毒属成员，于1957年首次被Bilin成功分离到。FPV引起猫科动物以高热、呕吐、脱水、白细胞严重减少和出血性肠炎为主要特征的急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率很高，常呈地方性流行，且康复动物也可能长期带毒，给猫科动物带来严重危害。 
猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)属于杯状病毒科，疱疹病毒属成员，于1957年被Fastier等首次成功分离到。FCV可引起猫上呼吸道感染、口腔水疱性疾病及慢性胃炎，还可引起猫肠炎、肺炎和跛行综合征等，为猫的一种重要的病毒病，感染猫还可成为无症状的病原携带者。 
猫疱疹病毒1型(Feline herpesvirus type1,FHV1)属于疱疹病毒科，甲型疱疹病毒亚科，由Crandell和Maurer于1958年首次分离到，是猫传染性鼻气管炎的病原。FHV1可引起猫的急性、高度接触性的上呼吸道感染，发病率很高，可达100%。虽然成年猫感染后大多痊愈，病死率很低，但幼仔猫感染后症状严重，病死率可达50%，甚至终生带毒排毒，并可垂直传播，危害很大。 
猫的这几种主要疾病临床症状相似，并常有混合感染，给诊断造成困难。常用的单项PCR方法耗时长，有必要建立快速的早期诊断方法，以便尽快采取有效的防控措施，减少这些疾病对养犬业造成的危害。鉴于此，本试验建立了FPV、FCV和FHV1的多重PCR检测方法，为临床检测提供了保障。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一套可用于同时 检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重PCR检测引物组。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 
一套同时用于检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重PCR检测引物组，其特征在于：所述引物组由三对引物组成，其中，用于猫泛白细胞减少症病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；用于猫杯状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；用于猫疱疹病毒1型检测的引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。 
以本发明所设计的引物采用多重PCR检测方法对FPV、FCV和FHV1进行检测，检测结果均为阳性，而对其他常见猫源性病毒检测结果均为阴性。应用本发明引物序列采用多重PCR方法，可以同时检测FPV、FCV和FHV1，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。本发明所设计的引物序列在发病猫早期检测和快速诊断中具有重要意义。 
此外，本发明还提供了一种用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包含本发明所述的引物组。 
更进一步的，本发明还提供了所述的引物组在制备检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型试剂中应用。及 
所述的试剂盒在制备检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型试剂中应用。 
附图说明
图1多重PCR方法的建立结果； 
泳道从左至右依次为：Marker；FPV+FCV+FHV1；FPV；FCV；FHV1；阴性对照； 
图2多重PCR方法的特异性试验结果； 
泳道从左至右依次为：Marker；阴性对照；FPV；FCV；FHV1；FPV+FCV+FHV1；RV；健康猫核酸； 
图3多重PCR方法的敏感性试验结果。 
泳道从左至右依次为：阴性对照；10-1；10-2；10-3；10-4；10-5；10-6；Marker 
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 
实施例1 
1材料和方法 
1.1病毒株 
FPV株、FCV株、FHV1株及狂犬病RV株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。 
1.2主要试剂 
Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000DNA Marker、M-MLV酶和RNA酶抑制剂购自购自宝生物工程（大连）公司；DNA提取试剂盒购自Omega公司；RNA提取试剂盒购自Qiagen公司。 
1.3引物设计 
分别根据GenBank中FPV NS基因序列、FHV TK基因序列和FCV ORF2序列，设计3对特异引物，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列见表1。 
表1多重PCR引物序列 
Figure BDA00003138062500031
1.4RNA和DNA的提取 
按RNA提取试剂盒和DNA抽提试剂盒说明书分别提取病毒RNA和病毒DNA。 
1.5多重PCR方法建立 
以FCV的cDNA和FPV、FHV1的DNA混合物作为多重PCR的模板，建立PCR反应。采用25μL反应体系:10X Ex Buffer2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25μL、FPV-F（10pmol/L）和FPV-R（10pmol/L）各1μL、FCV-F（10pmol/L）和FCV-R（10pmol/L）各0.5μL、FHV1-F（10pmol/L）和FHV1-R（10pmol/L）各0.5μL、 FPV模板1μL、FCV模板1μL、FHV1模板1μL、灭菌ddH2O13.25μL。反应程序：94℃预变性5min;94℃变性30S,55℃退火30s,72℃延伸1min,共30个循环；72℃延伸10min。取5μL PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察结果。 
1.6多重PCR方法的特异性试验 
以优化的多重PCR条件对FPV、FCV、FHV1、RV以及健康猫的核酸提取物进行PCR扩增，以检测该方法的特异性。 
1.7多重PCR方法的敏感性试验 
分别测定FPV、FCV和FHV1的模板浓度后，10倍梯度稀释（10-1；10-2；10-3；10-4；10-5；10-6），测定该多重PCR方法的敏感性。 
2结果 
2.1多重PCR的扩增 
采用优化的PCR方法，对FPV、FCV和FHV1的核酸模板及混合模板进行PCR扩增，结果获得大小约为400bp、900bp、300bp的片段,与测序结果392bp、922bp和290bp一致（图1）。 
2.2多重PCR的特异性试验 
用建立的多重PCR方法，对FPV、FPV+FCV+FHV1、FHV1、FCV、RV和健康猫的核酸提取物进行扩增，结果显示,只有FPV、FPV+FCV+FHV1、FHV1、FCV有特异性的扩增产物，而RV和健康猫的核酸提取物未见扩增，表明该方法具良好特异性（图2）。 
2.3多重PCR的敏感性试验 
在优化的PCR反应条件下，FPV的最高检测敏感度为10-6(101.5TCID50)，FCV的最高检测敏感度为10-6(101.9TCID50)，FHV1的最高检测敏感度为10-6(101.2TCID50)（图3）。 
Figure IDA00003138063400021

Claims (4)

1.一套用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重PCR引物组，其特征在于：所述引物组由三对引物组成，其中，用于猫泛白细胞减少症病毒检测的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；用于猫杯状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；用于猫疱疹病毒1型检测的引物序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
2.一种用于同时检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物组。
3.权利要求1所述的引物组在制备检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型试剂中应用。
4.权利要求2所述的试剂盒在制备检测猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型试剂中应用。
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