CN102181581B - 犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能同时检测水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒，其组成包括:DNA聚合酶，dNTPs，引物，PCR缓冲液，双蒸水；其特征在于：所述的引物由3对引物组成，其中，第1对引物的序列为5’-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3’和5’-CTTGAGCTTTCGACCTTC-3’，第2对引物的序列为5’-AACTGGGCGGAGCCTAAA-3’和5’-CAGAGCGAAGATAAGCAG-3’，第3对引物的序列为 5’-GAAACCACGGTGGAGACA-3’和5’-AAGAGTTGACCTGGAGGG-3’。采用本发明多重PCR试剂盒可在同一反应体系中同时检测出是否有水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的感染或多重感染，具有较高的特异性和敏感性，从而节省时间和试剂，可以为貂群的快速和早期诊断提供有效的工具。

Description

犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒

技术领域

本发明公开了一种能同时检测水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒，属于水貂烈性病毒的检测领域。

背景技术

犬瘟热病(Canine distemper，CD)是由副粘病毒科麻疹病毒属禽犬瘟热病毒(CDV)引起的犬科、鼬科及部分浣熊科动物的一种高度接触性、致死性传染病(文献1)。特征表现为病毒粒子有囊膜，直径大小约为150 nm，包括一个线性、负义单链RNA基因组，大小约为15.0 kb，病毒只有一个血清型。该病的传染性极强，死亡率可高达80％以上，病程早期双相体温热型，眼、鼻、消化道等粘膜炎症，随后以支气管炎、卡他性肺炎、胃肠炎为特征。病后期可见有神经症状出现如痉挛、抽搐，部分病例可出现鼻部和角垫高度角化，并可继发肺炎、肠炎等症状(文献2)。传染源主要是病犬、病兽和带毒动物，其中患犬瘟热的病犬是最危险的传染源。主要是通过患病动物的眼、鼻分泌物、唾液、尿和粪便排出病毒(文献3)。快速诊断该病对控制犬瘟热病的大规模流行有着积极的意义。

水貂肠炎细小病毒病（Mink enteritis）是由细小病毒科细小病毒属水貂肠炎细小病毒（MEV）引起的以剧烈腹泻为主要临床特症的急性、烈性和高度接触性传染病(文献4)。病毒颗粒无囊膜，直径约25 nm，整个病毒粒子呈20面体对称，基因组为单分子线状DNA，大小约为5.0 kb(文献5)，病毒只有一个血清型。病毒大量的存在于病貂的肝脏、脾脏及肠道，并从粪便大量排出。病貂、带毒貂是主要传染源，病毒主要通过病貂的粪便、尿液和各种分泌物散播。本病主要发生在夏季，近年来有推延到秋季的趋势。貂群一旦感染，如不采取措施，会引起地方性、周期性流行，通常会在翌年分窝前后的幼貂群中再次发生。快速诊断该病可有效地控制水貂细小病毒性肠炎的流行。

水貂阿留申病（Mink aleutian disease）是由水貂阿留申病毒(MADV)引起的水貂接触性、慢性、进行性传染病。主要侵害网状内皮细胞系统。以浆细胞增多，血丙种球蛋白增高，持续性病毒血症，免疫复合物造成的肾小球肾炎和肝炎，贫血及进行性衰竭为特征(文献6)。水貂的遗传类型与本病的易感性有密切关系，蓝宝石彩貂发病率较高。本病传入貂群，开始多呈隐形流行，随着时间的延长和病貂的积累，表现出地方性流行，造成严重损失(文献7)。建立定期检疫制度是净化貂群、消灭阿留申病的最好途径，阳性（感染）貂严格淘汰，如此检测数年，可达到基本净化的目的。

近年来随着毛皮动物（水貂等）养殖业的不断发展，以具备相当数量的产业化规模。同时作为水貂养殖业的3大疫病：犬瘟热病、肠炎细小病毒病、阿留申病已在主要养殖区域大规模流行与传播，严重影响毛皮动物养殖业发展，对农业经济发展、社会稳定和人类健康也带来不良影响。这3种疫病的常规诊断方法是病毒分离鉴定、血凝实验、琼脂扩散试验、对流免疫电泳和动物感染实验等(文献8-10)，这些方法都存在敏感性低，特异性不足，操作费时费力等局限性。因此，建立一种快速、敏感、特异、简便的同时检测这3种病毒的分子生物学方法有着重要的意义，并对病毒的复合感染诊断有着积极的帮助。

参考文献

1杨应丽.犬瘟热病毒研究进展.河北农业科学.2006.（4）：99-102.

2高大潮.犬瘟热病的诊治.现代农业科技.2009（9）：255.

3赵新龙.犬瘟热病流行特点和诊治.中国畜禽种业.2009（12）：92

4闫喜军，柴秀丽，吴威，等.水貂肠炎细小病毒分离鉴定.畜牧与兽医.2007(3):52-52

5张海玲，闫喜军，柴秀丽，等.水貂肠炎细小病毒PCR检测方法的建立和应用.特产研究.2007(2):1-3

6马建，华育平.水貂阿留申病发病机理的研究进展.动物医学进展.2005(1):39-42

7王克祥，刘永逵，孙宏磊.水貂阿留申病的研究进展.中国畜牧兽医.2010(12):223-225

8肖家美，程世鹏，赵艳.水貂阿留申病诊断方法的研究进展。特产研究.2007(2):70-72

9王好，张宇，钱爱东.犬瘟热诊断方法的研究进展.畜牧与饲料科学.2009（10）：67-69

10刘剑郁.犬细小病毒诊断研究进展.养犬.2007（2）：8-10

 发明内容

本发明的主要目的是提供一种能同时检测包括水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒；本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。

本发明的技术方案是这样实现的：检测犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒的三重PCR试剂盒包括3对特异性引物，CDV，MEV，ADV各自的扩增目标长度为335bp、553bp和451bp，引物序列为：

CDV 引物： 

CDV-P1 5’-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3’

CDV-P2 5’-CTTGAGCTTTCGACCTTC-3’

MEV 引物：

MEV-P1 5’-AACTGGGCGGAGCCTAAA-3’

MEV-P2 5’-CAGAGCGAAGATAAGCAG-3’

ADV  引物：

ADV-P1 5’-GAAACCACGGTGGAGACA-3’

ADV-P2 5’-AAGAGTTGACCTGGAGGG-3’

为了达到更好的检测效果，本发明试剂盒还带有3个阳性对照质粒，包括：CDV阳性对照质粒；MEV阳性对照质粒和ADV阳性对照质粒。并另外包含1个阴性对照。 

其中，所述的3个阳性对照质粒的制作方法为：（1）以犬瘟热CDV3株的cDNA为模板，以CDV-P1和CDV-P2为引物进行PCR扩增，得到335bp的扩增产物，回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到CDV阳性对照质粒；（2）以水貂肠炎细小病毒MEVB株的DNA为模板，以MEV-P1和MEV-P2为引物进行PCR扩增，得到553bp的扩增产物，回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到MEV阳性对照质粒；（3）以水貂阿留申病毒ADV-G株的DNA为模板，以ADV-P1和ADV-P2为引物进行PCR扩增，得到451bp的扩增产物，回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到ADV阳性对照质粒。

所述的阴性对照是蒸馏水。

所述的DNA聚合酶为rTaq DNA 聚合酶。

本发明试剂盒在检测犬瘟热病毒、肠炎细小病毒、水貂阿留申病毒中的应用：

25μL反应体系：rTaq DNA 聚合酶 2.0U；dNTPs (2.5mmol/) 2.0μL；引物CDV-P1以及CDV-P2，MEV-P1以及MEV-P2，ADV-P1以及ADV-P2各10pmol；10倍PCR Buffer2.5μL；待测模板2.0μL，其余的由蒸馏水补充至25μL。

PCR 反应程序为：95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。

判定结果： 如果从待检测的样品中扩增到了335bp片段，则该检测样品含有犬瘟热病毒；如果从待检测的样品中扩增到了553bp片段，则该检测样品含有肠炎细小病毒；从待检测的样品中扩增到了451bp片段，则该检测样品含有水貂阿留申病毒。如果同时检测到2个或者3个目标大小条带，则该检测样品同时含有该目标代表的病毒。

本发明的积极效果是

1 根据病毒基因组的保守基因序列设计引物，得到了检测包括犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒的三重PCR试剂盒。与常规的PCR方法相比采用本发明的试剂盒可以在同一反应体系中检测是否含有犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒核酸，具有较高的特异性和敏感性，具有同时检测和鉴别3种毛皮动物最常见的病毒性疾病等特点，可以对毛皮动物兽群中隐形感染或者持续带毒宿主和发病动物进行准确检测。

2 本项发明中的三重PCR试剂盒可对细胞培养物、组织、分泌液、血液等多种样品的CDV、MEV和ADV进行快速检测，样品适用范围广，试剂盒提供的试剂中，无感染性、无生物安全隐患成分，使用安全性很高。

3 本项发明中的试剂所组成的试剂盒可在收到样品6小时候进行定性诊断结果，为诊断毛皮动物（水貂等）的犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒感染提供有效工具。

附图说明

图1本发明三重PCR试剂盒的特异性检测;1-8：ADV检测结果；CDV检测结果；MEV检测结果；ADV与CDV混合后的检测结果；MEV和ADV混合后的检测结果；MEV和CDV混合后的检测结果；MEV、ADV、CDV混合后的检测结；阴性对照结果；M：DL2000 Marker

图2本发明三重PCR试剂盒的敏感性检测 CDV检测浓度分别为10ng/μL~1.0pg/μL；MEV检测浓度为10ng/μL~100 pg/μL；ADV检测浓度为10ng/μL~10 pg/μL。

图 3 本发明三重PCR试剂盒的病毒样品检测；1-3：CDV病毒检测结果；MEV病毒检测结果；ADV病毒检测结果；M：DL2000 Marker

图4 本发明三重PCR试剂盒的病毒样品检测；1：CDV病毒检测阳性结果；2：病毒临床检测CDV强阳性结果；3：病毒临床检测CDV弱阳性结果；4：病毒临床检测CDV阴性结果； M：DL2000 Marker

图5 本发明三重PCR试剂盒的病毒样品检测；1：ADV病毒检测阳性结果；2：CDV病毒检测阳性结果；3：CDV和ADV病毒混合的阳性结果；4，7：临床样品中CDV和ADV混合感染的阳性结果； 5，6：临床样品中的阴性结果；M：DL2000 Marker

 具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1 材料与方法

1.1 病毒株CDV3、MEVB和ADV-G均由中国农业科学院特产研究所提供；M-MLV反转录酶、 rTaq DNA聚合酶、dNTPS、 DNA Marker DL2000、pMD18-T载体等均购自宝生物工程(大连)有限公司，胶回收试剂盒均购自上海华舜生物技术有限公司，病毒RNA提取试剂购置Invitrogen公司。

1.2 阳性对照重组质粒的构建

根据CDV3病毒株N基因设计检测CDV病毒特异性引物CDV-P1 5’-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3’；CDV-P2 5’-CTTGAGCTTTCGACCTTC-3’，扩增片段长度为335bp。利用Vero细胞增殖CDV3种毒，培养3天后参照病毒RNA提取试剂（Invitrogen公司）提取总RNA，以反转录产物为模板扩增CDV 335片段。PCR 反应条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。将目的片段回收纯化后，利用pMD18-T载体构建重组质粒，命名为CDV阳性对照质粒。送Invitrogen公司进行测序。

MEV和ADV经处理提取病毒DNA后，其阳性对照质粒构建方法同CDV阳性对照质粒。

1.3 三重PCR反应条件的优化

25pL反应体系中，以CDV、MEV和ADV阳性对照质粒 (浓度均为100ng/μL)混合

物为模板，采用先固定引物对CDV-P1/CDV-P2的浓度，在1pmol/μL-10pmol/μL之间调整引物对MEV-P1/MEV-P2的摩尔量，同时将退火温度在48-62℃进行优化，每2℃递增。在此基础上进一步优化引物对ADV-P1/ADV-P2的摩尔量及退火温度，最终确定三重PCR的最佳引物浓度比和退火温度。

1.4 三重PCR的特异性实验

分别以CDV、MEV和ADV阳性对照质粒以及阴性对照水为模板，进行三重PCR的特异性实验；另外以CDV和MEV的阳性对照质粒混合物、CDV和ADV的阳性对照质粒混合物、MEV和ADV的阳性对照质粒混合物，CDV、MEV和ADV阳性对照质粒混合物为模板，进行三重PCR的特异性实验，对其混合模板进行三重PCR的特异性进行检验。

1.5 三重PCR的敏感性实验

以不同浓度的CDV、MEV和ADV阳性对照质粒为模板（100ng/μL-1.0pg/μL），进行三重PCR的敏感性实验。

2 实验结果

2.1 重组质粒的建立

CDV、MEV和ADV重组质粒经过测序后，进行核酸比对发现，相关基因的核酸同源性达到99%以上。表明所获得的重组质粒均为阳性质粒。

2.2 三重PCR最佳反应条件的确定

经过对反应浓度和退火温度的条件的优化，确定在25pL反应体系中，rTaq DNA 聚合酶 2.0U；dNTPs (2.5mmol/) 2.0μL；引物CDV-P1以及CDV-P2，MEV-P1以及MEV-P2，ADV-P1以及ADV-P2各10pmol；10倍PCR Buffer2.5μL；待测模板2.0μL，其余的由蒸馏水补充至25μL。PCR 反应程序为：95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。

2.3 三重PCR特异性实验

CDV、MEV和ADV阳性对照质粒分别出现其对应的335bp、553bp、451bp条带，混合后的样品也能出现相对应的多个条带，阴性对照蒸馏水未扩增出任何条带。如图1所示。

2.4三重PCR敏感性实验

实验结果如图2所示，CDV 最低检测浓度为1.0pg/μL；MEV最低检测结果为100 pg/μL；ADV检测结果为10 pg/μL。

实施例2 

利用犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒的三重PCR方法对病毒样品检测

1 材料与方法

1.1 病毒株CDV3、MEVB和ADV-G均由中国农业科学院特产研究所提供；M-MLV反转录酶、 rTaq DNA聚合酶、dNTPS、 DNA Marker DL2000、等均购自宝生物工程(大连)有限公司，病毒RNA提取试剂购置Invitrogen公司。

1.2 病毒核酸模板制备（RNA及DNA的提取）

参照病毒RNA提取试剂（Invitrogen公司）提取病毒株CDV3的总RNA，并利用M-MLV反转录酶进行反转录，提取其cDNA作为犬瘟热病毒PCR模板使用。MEVB和ADV-G毒株的DNA直接使用沸水裂解法，即将其放入水浴中5min，冷却后可直接作为肠炎细小病毒和阿留申病毒模板。

1.3 三重PCR反应

将CDV、MEV和ADV病毒提取的核酸为模板，分别加入到包含混合引物的三重PCR体系中，使用三重PCR最佳反应条件对病毒模板进行检测。

2 试验结果

2.1 三重PCR对病毒模板的检测结果

CDV、MEV和ADV病毒分别出现其对应的335bp、553bp、451bp条带，如图3所示。

实施例3 

利用犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒的三重PCR方法对犬瘟热病毒临床样品检测

1 材料与方法

1.1 病毒株CDV3由中国农业科学院特产研究所提供；M-MLV反转录酶、 rTaq DNA聚合酶、dNTPS、 DNA Marker DL2000等购自宝生物工程(大连)有限公司，病毒RNA提取试剂购置Invitrogen公司。

1.2 病毒核酸模板制备（RNA的提取）

参照病毒RNA提取试剂（Invitrogen公司）提取病毒株CDV3以及犬瘟热临床样本的总RNA，并利用M-MLV反转录酶进行反转录，提取其cDNA作为犬瘟热病毒PCR模板使用。

1.3 三重PCR反应

将病毒株CDV3和犬瘟热临床样本提取的核酸为模板，分别加入到包含混合引物的三重PCR体系中，使用三重PCR最佳反应条件对病毒模板进行检测。

2 试验结果

2.1 三重PCR对病毒模板的检测结果

病毒株CDV3和疑似犬瘟热临床样本出现其对应的335bp条带，阴性则无任何条带，。

实施例4

 利用犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒的三重PCR方法对包含犬瘟热病毒和水貂阿留申病毒及其混合感染临床样本检测

1 材料与方法

1.1 病毒株MEVB和ADV-G均由中国农业科学院特产研究所提供；M-MLV反转录酶、 rTaq DNA聚合酶、dNTPS、 DNA Marker DL2000等均购自宝生物工程(大连)有限公司，病毒RNA提取试剂购置Invitrogen公司。

1.2 病毒核酸模板制备（RNA或者DNA的提取）

参照病毒RNA提取试剂（Invitrogen公司）提取病毒株CDV3的总RNA，并利用M-MLV反转录酶进行反转录，提取其cDNA作为犬瘟热病毒PCR模板使用。ADV-G毒株的DNA直接使用沸水裂解法，即将其放入水浴中5min，冷却后可直接作为犬瘟热病毒和水貂阿留申病毒模板。

1.3 三重PCR反应

将CDV和ADV病毒以及临床样本提取的核酸为模板，分别加入到包含混合引物的三重PCR体系中，使用三重PCR最佳反应条件对病毒模板进行检测。

2 试验结果

2.1 三重PCR对病毒模板的检测结果

MEV和ADV病毒分别出现其对应的335bp、451bp条带，混和后的两种病毒和混合感染的临床样本同时出现335bp和451bp两条带，阴性则无任何条带，如图5所示。 

Claims (1)

1.检测水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒，包括DNA聚合酶，dNTPs，引物，PCR缓冲液，双蒸水；其中引物由CDV，MEV，ADV  3对引物组成，引物序列为：

CDV 引物：

CDV-P1 5’-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3’

CDV-P2 5’-CTTGAGCTTTCGACCTTC-3’

MEV 引物：

MEV-P1 5’-AACTGGGCGGAGCCTAAA-3’

MEV-P2 5’-CAGAGCGAAGATAAGCAG-3’

ADV  引物：

ADV-P1 5’-GAAACCACGGTGGAGACA-3’

ADV-P2 5’-AAGAGTTGACCTGGAGGG-3’， 

CDV，MEV，ADV各自的扩增目标长度为335bp、555bp和451bp；

其特征在于所述的CDV引物的阳性对照质粒制备方法为：以水貂犬瘟热病毒的cDNA为模板，以5’-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3’和5’-CTTGAGCTTTCGACCTTC-3’为引物进行PCR扩增，得到335bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到CDV阳性对照质粒；

所述的MEV引物的阳性对照质粒制备方法为：以水貂肠炎细小病毒的DNA为模板，以5’-AACTGGGCGGAGCCTAAA-3’和5’-CAGAGCGAAGATAAGCAG-3’为引物进行PCR扩增，得到555bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到MEV阳性对照质粒；

所述的ADV引物的阳性对照质粒制备方法为：以水貂阿留申病毒DNA为模板，以5’-GAAACCACGGTGGAGACA-3’和5’-AAGAGTTGACCTGGAGGG-3’为引物进行PCR扩增，得到451bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到ADV阳性对照质粒。

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