CN104450967A - 检测水貂阿留申病毒的特异性引物及其在筛选健康水貂中的应用 - Google Patents

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程悦宁
程世鹏
陈立志
仝明薇
岳志刚
王建科
赵航
林鹏
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Abstract

检测水貂阿留申病毒的特异性引物及其在筛选健康水貂中的应用，本发明的目的是针对水貂的阿留申病毒设计高灵敏度特异性检测引物，并将该引物应用于筛选未患阿留申病的水貂，该方法通过快速准确的检测水貂粪便是否携带阿留申病毒，进而判定宿主水貂是否适合作为育种的种貂，避免了用繁琐的CIEP方法检测。这种筛选方法稳定、有效、适用几乎所有品种水貂并且与CIEP结果符合率高，在不伤害水貂的前提下，能迅速的检测出携带病毒的阳性水貂，几乎所有简易实验室均可应用。

Description

检测水貂阿留申病毒的特异性引物及其在筛选健康水貂中的应用
背景技术
水貂阿留申病(AMD)是由阿留申病毒引起的一种慢性进行性传染病，该病的特点是潜伏期长，呈慢性经过，可垂直感染，血液中丙种球蛋白异常增高以上，浆细胞增多，多发生动脉炎，血管球性肾炎和肝炎，急性流产(Best SM et al.，2005)。因此又称浆细胞增多症或丙种球蛋白增多症。AMDV在分类上属细小病毒科，细小病毒亚科，阿留申病毒属，为单股线状DNA病毒。
大量文献表明，阿留申病已成为广泛流行于世界各貂国家的一种重要传染病(Knuuttila et al.2009)；黑龙江1973年某场用碘反应对1300头貂检查，阳性率达22％。吉林农大在北京、大连和吉林等地貂场先后检查，12000只水貂，结果表明种兽群发病率为20-30％，皮兽群高达50％。
水貂患阿留申病后，可使病貂睾丸发育不良，健康貂平均为8.8克、患病貂为3.2克，无成活精子或精子甚少。母貂患病影响产仔及成活，如吉林农大调查表明，患病母貂仔兽平均成活为2.3只，而健康母貂平均仔兽成活为5.8只(Zhenjun Wang et al.2014)。
挑选健康优质的水貂是选育优良水貂品种的前提条件，阿留申病对水貂的健康构成严重威胁，患有阿留申病的水貂显然不宜作为育种种貂。目前国内外大多通过检疫淘汰病貂来实现对病原的净化，其中对流免疫电泳(CIEP)是现今世界公认的应用最为广泛的检测方法。即采集疑似患病水貂血液，分离血清后，利用对流免疫电泳(CIEP)中抗原抗体反应产生的沉淀线来判定该水貂是否患病。此外，也有将疑似AMDV的血液、尿液及脏器的DNA作为PCR反应的模板，来筛选未患病水貂种貂，该方法显得较为简单，显示出一定的优势。但是上述几种方法在不同程度上存在繁琐及取样不便的情况，也阻碍了水貂的育种工作，因此开发一种简单、实用、快速的筛选未患阿留申病水貂种貂的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测阿留申病毒的高灵敏度特异性引物；
本发明的另一目的在于将上述引物应用于筛选健康的水貂作为育种种貂，实现精确度高、操作简单、成本低廉的快速筛选。
本发明的技术方案是这样实现的：
根据GeneBank上已登录的阿留申病毒AMDV参考序列，设计AMDV特异性引物： 
A1:5’-GAAACCACGGTGGAGACA-3’
A2:5’-AAGAGTTGACCTGGAGGG-3’
该引物扩增片段长度为451bp。
利用干棉签，取水貂肛门部位的粪便，并迅速溶解与纯净水中，拭子液冻融一次后，利用DNA提取试剂盒提取该液体的总DNA。使用上述DNA作为模板，加入DNA扩增酶混合物和AMDV的特异性检测引物，通过PCR反应，PCR试验条件为：2×EasyTaq PCR SuperMix 25ul、上下游引物各1uL、模板3uL、ddH2O 20uL，PCR反应参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现大小约为451bp的条带，则可以确定样品中含有阿留申病毒(AMDV)核酸，该宿主不能作为种貂，反之则可作为候选种貂。
该PCR方法可检出最低病毒量为100ng AMDV DNA，用于确认粪便中是否存在阿留申病毒。
将同一水貂血样进行阿留申病毒PCR与血清阿留申病毒抗体对流免疫电(CIEP)符合率检测，检测结果符合率达到95％。
本发明提供的特异性检测引物及其在筛选健康水貂中的应用，对不同品种的水貂种群均适用，且实验稳定性高，3个月后重复试验结果不变，显示出该方法良好的应用性。
本发明的积极效果是不伤害水貂：仅仅采取肛门拭子就可以鉴别水貂是否携带阿留申病毒，有利于水貂育种工作中后备群体的建立。特异性引物在粪拭子中的应用效果稳定、有效、 适用几乎所有品种水貂并且与CIEP结果符合率高，能迅速的筛选出健康的水貂作为育种种貂，几乎所有简易实验室均可应用。
附图说明
图1是以水貂粪便总病毒DNA为模板，以阿留申病毒特异性引物进行PCR反应的产物电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一：特异性引物的应用
1、材料与方法 
1.1供体水貂及试剂
672份水貂肛门粪拭子分别采于大连、长春、哈尔滨、山东多家水貂养殖场，2×EasyTaq PCR SuperMix购于全式金生物技术有限公司(北京)，DNA Marker DL2000购于宝生物工程有限公司(大连)，咽拭子病毒DNA/RNA提取试剂盒购于康为试剂生物科技有限公司(北京)。
1.2水貂粪便总病毒DNA的提取
利用干棉签，采取水貂肛门部位的粪便，并迅速溶解于纯净水中，拭子液冻融一次后，参照咽拭子病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书操作(康为试剂生物科技有限公司)提取总DNA。
1.3水貂粪便阿留申病毒PCR检测
根据GeneBank上已登录的阿留申病毒参考序列，设计引物，扩增片段长度为451bp，
A1(上游引物):5’-GAAACCACGGTGGAGACA-3’
A2(上游引物):5’-AAGAGTTGACCTGGAGGG-3’
PCR试验条件为：2×EasyTaq PCR SuperMix 25ul、上下游引物各1uL、模板3uL、ddH2O20uL，PCR反应参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。
该PCR方法可检出最低病毒量为100ng AMDV DNA；根据PCR产物的电泳结果判定粪便中是否存在阿留申病毒。
2、水貂阿留申病毒PCR检测结果
提取672份水貂粪便总病毒DNA，经阿留申病毒特异性引物进行PCR反应，然后将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，其中408份样品可见大小约为451的条带(见说明书附图，图1)，序列经BLAST对比分析后确认为水貂阿留申病毒基因，其与阿留申病毒标准株(ADV-Utah 1strain)核酸相似度达到96-97％，确认为水貂阿留申病毒。
672份水貂肛门粪拭子分别提取病毒DNA，随机选取49份样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果49份样品均可见DNA条带。
实施例二：应用特异性引物筛选感染阿留申病水貂的结果一致性实验
为了辨别该PCR方法检测感染阿留申病毒的水貂检测结果的一致性和稳定性，我们采用不同时间段取同一水貂的样品，分别在8月份、9月份和10月份采集同一水貂的粪便，提取DNA后，进行特异性PCR扩增，在检测的11只水貂中实验证明这3次PCR结果完全一致，说明该方法能稳定的检测出水貂阿留申病毒，并且能暗示出阿留申病毒感染水貂是长期性的，该结果与文献报道一致。
表1应用特异性PCR扩增筛选在水貂不同生长期的一致性
实施例三：应用特异性引物筛选不同种类的水貂
目前在我国养殖的水貂主要有以下种类：美国短毛黑、银蓝色水貂、红眼白貂、珍珠色水貂、咖啡色水貂和米黄色水貂。利用本PCR检测方法对某个水貂养殖场的不同种群水貂感染阿留申病毒进行检测，每个种群取100只公貂，结果发现多数种群水貂的阿留申病毒感染率达到65％～80％，其中红眼白貂和美国短毛黑感染率为最高。
实施例四：利用该PCR方法与对流免疫电泳(CIEP)结果对比
水貂血清对流免疫电泳实验简述如下：使用特产研究所水貂ADV标准抗原和ADV阳性抗血清；对流免疫电泳实验参见《水貂阿留申病对流免疫电泳操作规程SN/T1314-2003》(中华人民共和国出入境检验检疫行业标准)。
结果判定：出现沉淀线为血清抗体阳性，没有出现沉淀线的判为血清抗体阴性。
水貂种群100只同时使用这两种方法进行检测，CIEP阳性值达到58％，粪拭子PCR阳性值达到62％，符合率达到95％。因此，CIEP方法检测的阳性结果与仅直接用PCR检测病毒阳性的貂群一致，因此PCR检测粪拭子可以应用于筛选健康的水貂。

Claims (3)

1.一种检测水貂阿留申病毒的高灵敏特异性引物，用于检测水貂肛门拭子液是否携带阿留申病毒，其特征在于，所述引物序列为：
A1:5’-GAAACCACGGTGGAGACA-3’
A2:5’-AAGAGTTGACCTGGAGGG-3’ 。
2.权利要求1所述的检测水貂阿留申病毒的高灵敏特异性引物在筛选健康水貂中的应用，其特征在于，所述应用是通过以下步骤实现的：
(1)对后备留种群的水貂逐一编号，利用干棉签取水貂肛门部位的粪便，并迅速溶解与纯净水中，拭子液冻融一次后，利用DNA提取试剂盒提取该液体的总DNA；
(2)使用上述DNA作为模板，加入DNA扩增酶混合物和阿留申病毒(AMDV)的特异性检测引物，进行RCR反应，所述PCR试验条件为：2×EasyTaq PCR SuperMix 25ul、上下游引物各1uL、模板3uL、ddH2O 20uL，PCR反应参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；
(3)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现大小约为451bp的条带，则可以确定样品中含有阿留申病毒(AMDV)核酸，该宿主不能作为种貂，反之则可以留种。
3.根据权利要求2所述的高灵敏特异性引物在筛选健康水貂中的应用，其特征在于，应用此方法可检出感染阿留申病的各品种的水貂，在3个月内的进行重复检测结果一致，与对流免疫方法检测结果对比，其结果一致率达到95％。
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