CN103224995B

CN103224995B - 一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒强弱毒的纳米pcr检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103224995B
Application number: CN201310123092.8A
Authority: CN
Inventors: 崔尚金; 仇铮
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2033-04-10
Also published as: CN103224995A; HK1187379A1

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒强弱毒的纳米PCR检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括2×Nano PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，引物混合物，DNA聚合酶，无核酸ddH₂O。为了达到更好的检测效果，本发明的试剂盒还可以含有模板混合物以及稳定剂。本发明试剂盒解决了使用现有试剂盒检测耗时长，繁琐、敏感性低的缺点，提高了敏感性，做到早期快速检出病毒。本发明试剂盒具有特异性强、灵敏度高，适于早期快速诊断等特点，并且可以鉴别基因缺失株与野毒株感染。同时，本试剂盒能广泛应于基层兽医检测机构，对规模化养猪场PRV的检测、确诊及鉴别诊断有重要意义。

Description

一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒强弱毒的纳米PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测猪伪狂犬病病毒强弱毒的PCR检测试剂盒及其应用，特别涉及一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒强弱毒的纳米PCR检测试剂盒及其应用，本发明属于预防兽医学检验领域。

背景技术

伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)能引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的疾病。猪是PRV的贮存宿主和传染源，主要引起妊娠期母猪流产，死产和木乃伊胎；初生仔猪多为急性致死性型，具有明显的神经症状，死亡率几乎为100%；成年猪多呈潜伏感染。猪伪狂犬病几乎在世界所有主要养猪生产地区都有发现。在我国，二十多个省、市、自治区都有本病的感染，并导致了严重的经济损失。由于大部分猪场对该病有高度的认识，且采取了各种有效的综合防治措施，使得该病的大面积暴发流行得到了有效控制。但是，仍然有少部分猪场对该病的危害性认识不够，没有采取有效的预防措施，典型猪伪狂犬病仍然可见。2011年开始在我国广泛发生、流行的猪伪狂犬病，造成了大批仔猪因拉稀、消瘦、脱水而死亡。

在没有进行过猪伪狂犬病疫苗免疫的猪场，猪伪狂犬病野毒感染后，猪群在临床上表现典型的猪伪狂犬病症状：0-4周龄哺乳仔猪感染后发病最为严重，为最急性型，表现为体温升高、水样腹泻（黄色稀便）、呕吐、发抖、流涎、颈部肌肉僵硬、运动不协调、四肢划水样运动，最后昏迷死亡，初生仔猪发病率和死亡率为100%，4周龄仔猪的死亡率下降到40%-60%；断奶后仔猪的发病率和死亡率都比哺乳仔猪低，其临床症状主要表现为体温升高、腹泻和严重的呼吸困难；育肥猪感染后大多数伴有体温升高、呼吸困难，一般不发生死亡，耐过后呈长期隐性感染带毒或排毒；妊娠母猪感染后表现出严重的繁殖障碍综合征：母猪群中重新发情、复配的比例高，有相当一部分母猪发生流产，部分母猪产死胎或木乃伊胎，或者产出弱仔和死仔。

在进行过猪伪狂犬病疫苗免疫的猪场，由于所选择的疫苗不合适，免疫程序安排不恰当，以及其他诸多因素，还有相当一部分猪场的猪群在野毒感染后出现零星的猪伪狂犬病病例。哺乳仔猪有零星的病猪出现，经常可见严重水样腹泻，偶尔可见特征性神经症状病猪，断奶前仔猪的死亡率最高可达15%；断奶后仔猪主要表现体温升高、腹泻和呼吸困难；育肥猪仍然表现体温升高、呼吸困难，猪群整齐度比较差；母猪群中有一定比例的母猪重新发情、复配，有少数母猪发生流产、产死胎或木乃伊胎、或者产出弱仔和死仔。

PRV的抗原检测方法很多，如病毒分离、荧光定量PCR、胶体金抗原检测试纸条。但病毒分离耗时费力，荧光定量PCR检测成本高且需要借助一些特殊的试验仪器的辅助才能完成，胶体金抗原检测试纸条虽然快速但敏感性不高。为此，本发明运用纳米PCR技术，根据中国境内使用的各种猪用PRV基因工程弱毒疫苗株均缺失gE基因这一特征，成功建立了一种新型的纳米PRV强弱毒鉴别诊断试剂盒，为PRV感染的早期快速诊断提供了有力的检测工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测和鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）弱毒株和野毒株的新型纳米PCR检测试剂盒，以解决使用现有试剂盒进行检测时存在的耗时长、繁琐等缺点，且克服了因PRV存在潜伏感染性，有时会出现漏检的问题。

为了达到以上目的本发明采用的技术措施为：

本发明的一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒的纳米PCR检测试剂盒，其特征在于其组成成分包括：2×Nano PCR缓冲液，DNA聚合酶，引物混合物，无核酸ddH₂O，其中所述的引物混合物由3对引物组成，第1对引物的序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，第2对引物的序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，第3对引物的序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

引物的设计是根据GenBank上已经发表的PRV参考毒株（GeBank序列号：NC_006151)gB，gE和gG基因的保守区序列，设计出纳米PCR特异性引物。

在本发明中，优选的，所述的引物混合物由3对引物按照等摩尔比组成。

为了达到更好的检测效果，所述的纳米PCR检测试剂盒，其特征在于还包括伪狂犬病病毒野毒的阳性对照质粒及PRV gE缺失疫苗株阳性对照质粒，统称为模板质粒。

优选的，所述的伪狂犬病病毒野毒的阳性对照质粒为含有PRV gE基因及/或含有PRV gB基因的质粒；所述的PRV gE缺失疫苗株阳性对照质粒为含有PRV gG基因及/或含有PRV gB基因的质粒。

在本发明的一个具体实施例中，本发明首先根据PRV参考毒株NC0061511株gE基因、gB基因和gG基因的保守区序列设计了引物，gE基因保守基因序列为PRV野毒所共有，而gE基因缺失疫苗株则没有。gB基因以及gG基因为gE缺失疫苗株与野毒株所共有。

在本发明的一个具体实施例中，含有PRV gE基因及含有PRV gB基因的质粒为分别为PRV-pMD18-T-gE质粒及PRV-pMD18-T-gB质粒；所述的PRV gE缺失疫苗株阳性对照质粒为PRV-pMD18-T-gG。其中PRV-pMD18-T-gE质粒以及PRV-pMD18-T-gG质粒按照公开号为CN101831506A，发明名称为“鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的试剂盒”的专利申请中记载的方法制备。

PRV-pMD18-T-gB质粒的构建方法如下：首先合成PRV-gB基因的引物，引物序列如下：

PRV-gB-上游:CTACAGGGCGTCGGGGTCC（SEQ ID NO:7）

PRV-gB-下游:ATGCCCGCTGGTGGCGGTC（SEQ ID NO:8）

以PRV野毒PRV-BJ株(也可以从市场上购买，例如:中国兽医微生物菌种保藏管理中心)DNA为模板，PCR扩增目的片段，然后分别胶回收目的片段，克隆到pMD18T载体上，然后转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落，摇菌扩增，质粒提取试剂盒提取目的质粒。构建的质粒易保存，不具有感染性，无散毒的危险性，可以替代全病毒的DNA作为阳性模板。

在本发明中，优选的，所述的纳米PCR检测试剂盒还含有稳定剂，更优选的，所述的稳定剂为二甲基亚砜（DMSO）。

进一步的，本发明还提出了所述的纳米PCR检测试剂盒在制备鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒株及PRV gE基因缺失疫苗株试剂中的应用。及

所述的纳米PCR检测试剂盒在制备诊断猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒株及PRVgE基因缺失疫苗株试剂中的应用。

优选的，本发明检测试剂盒的各组成成分的体积及保存条件如下:

一种利用本发明的试剂盒鉴别或诊断猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒的方法，包括以下步骤：

（1）提取待检组织样品的DNA；

（2）检测体系各组分配比如下：

纳米PCR反应液 10.8μL

模板混合物或待检病毒DNA 1.2μL

每次待检样品都需设阳性对照(模板混合物为阳性对照)和不加模板的无核酸ddH₂O作为阴性对照。

纳米PCR反应液是由2×Nano PCR buffer，10μmol/L的引物混合物，DNA聚合酶，二甲基亚砜（DMSO），无核酸ddH₂O组成。

纳米PCR反应在12μl反应体系中最佳扩增条件为：

94℃预变性5min，94℃变性30s56℃退火30s72℃延伸50s，72℃延伸10min，30cycle。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳在紫外检测仪上观察。

PRV纳米PCR敏感性试验：10倍倍比稀释初始浓度为1.0×10¹⁰拷贝/μL阳性模板，分别进行纳米PCR和普通PCR扩增，结果显示采用本发明的纳米PCR检测试剂盒进行检测比普通PCR敏感100-1000倍，其中gB，gE前者比后者敏感1000倍，而gG前者比后者敏感100倍；采用本发明的纳米PCR检测试剂盒和普通PCR试剂盒分别对gB，gE，gG进行单PCR扩增，结果显示用本发明的纳米PCR检测试剂盒gB，gE敏感性可达1.0×10¹拷贝，gG敏感性可达1.0×10²拷贝。而普通PCR试剂盒gB敏感性可达1.0×10⁴拷贝，gE敏感性可达1.0×10³拷贝，gG敏感性可达1.0×10⁴拷贝，结果表明本发明的纳米PCR检测试剂盒敏感性高。

PRV纳米PCR特异性试验：采用优化后的多重纳米PCR扩增条件，以PRV-gB，PRV-gE和PRV-gG重组质粒为模板进行多重PCR扩增，扩增出了与试验设计相符的431bp、316bp和202bp的3条特异性电泳条带；以PRV gE基因缺失毒DNA为模板进行多重PCR扩增，结果仅扩增出431和202bp的2条特异性条带；以猪捷申病毒、圆环病毒、蓝耳病病毒、猪细小病毒及非洲猪瘟病毒为模板进行PCR扩增，结果均未扩增出任何条带。结果表明建立的PCR具有良好的特异性。

PRV纳米PCR保存期试验：本试剂盒目前在-20℃下保存6个月，效果良好，没有任何变化。

初步应用结果：应用本试剂盒对我国境内使用最多的PRV gE缺失疫苗株Bartha株和Plus株、以及两株现地分离的野毒株进行了检测：结果表明，本试验所建立的检测PRV纳米PCR检测方法对两株野毒株的检测结果为阳性（三条条带），PRV gE-缺失疫苗株Bartha株检测结果为两条条带（缺少中间的gE条带）。同时也应用本试剂盒对我国部分2011年来疑似本病的病料，进行了检测，结果野毒检出率为85%，与病毒分离率相符为95%。

附图说明

图1为十倍倍比稀释阳性模板，分别进行纳米PCR（1a）和普通PCR（1b）扩增后的电泳结果，结果显示gB基因和gE基因纳米PCR比普通PCR敏感1000倍，而gG基因纳米PCR比普通PCR敏感100倍；

图2为纳米PCR与普通PCR分别检测PRV-gB，PRV-gE，PRV-gG单PCR扩增后的电泳结果，结果：纳米PCR中gB（2a），gE（2b）敏感性可达10¹拷贝，gG（2c）敏感性可达10²拷贝。而普通PCR中gB（2d）敏感性可达10⁴拷贝，gE（2e）敏感性可达10³拷贝，gG（2f）敏感性可达10⁴拷贝；

图3为采用优化后的多重纳米PCR扩增条件，以PRV-pMD18-T-gB，PRV-pMD18-T-gE以及PRV-pMD18-T-gG重组质粒为模板进行多重PCR扩增的电泳结果，扩增出了与试验设计相符的431bp、316bp和202bp的3条特异性电泳条带；以PRV gE基因缺失株DNA为模板进行多重PCR扩增，结果仅扩增出431bp和202bp的2条特异性条带；以猪捷申病毒、圆环病毒、蓝耳病病毒、猪细小病毒及非洲猪瘟病毒为模板进行PCR扩增，结果均未扩增出任何条带。证实该方法具有良好的特异性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒的新型纳米PCR检测试剂盒的制备

本发明试剂盒组成成分包括：2×Nano PCR缓冲液（购买自山东大正医疗器械股份有限公司），DNA聚合酶（购买自山东大正医疗器械股份有限公司），引物混合物（10×），阳性模板混合物（由PRV-pMD18-T-gB，PRV-pMD18-T-gE以及PRV-pMD18-T-gG三种质粒按照等摩尔比组成，其中，PRV-pMD18-T-gE作为野毒株阳性对照质粒，PRV-pMD18-T-gG作为gE-缺失疫苗株阳性对照质粒，PRV-pMD18-T-gB同时作为野毒株和gE-缺失疫苗株的阳性对照质粒），二甲基亚砜（DMSO），无核酸ddH₂O。

其中所述的引物混合物由3对引物按照等摩尔比组成，第1对引物的序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，第2对引物的序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，第3对引物的序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

所述的PRV-pMD18-T-gE质粒以及PRV-pMD18-T-gG质粒按照公开号为CN101831506A，发明名称为“鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的试剂盒”的专利申请中记载的方法制备。

PRV-gB-上游:CTACAGGGCGTCGGGGTCC（SEQ ID NO:7）

PRV-gB-下游:ATGCCCGCTGGTGGCGGTC（SEQ ID NO:8）

以PRV野毒PRV-BJ株(可以从市场上购买，例如:中国兽医微生物菌种保藏管理中心)DNA为模板，PCR扩增目的片段，然后分别胶回收目的片段，克隆到pMD18T载体上，然后转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落，摇菌扩增，质粒提取试剂盒提取目的质粒。

构建的质粒易保存，不具有感染性，无散毒的危险性，可以替代全病毒的DNA作为阳性模板。

本发明检测试剂盒的各组成成分的体积及保存条件如下:

实施例2、本发明的试剂盒在快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒中的应用

1、方法

（1）提取待检组织样品的DNA；

（2）检测体系各组分配比如下：

纳米PCR反应液 10.8μL

模板混合物或待检病毒DNA 1.2μL

10.8μL纳米PCR反应液包括：2×Nano PCR缓冲液6μL，Taq DNA聚合酶（10U/μL）0.5μL，引物混合物（10×，100μmol/L）1.2μL，二甲基亚砜（DMSO）0.5μL，无核酸ddH₂O2.6μL。

纳米PCR反应在12μl反应体系中最佳扩增条件为：

2、PRV纳米PCR敏感性试验：

10倍倍比稀释初始浓度为1.0×10¹⁰拷贝/μL的阳性模板混合物（PRV-pMD18-T-gB，PRV-pMD18-T-gE以及PRV-pMD18-T-gG等摩尔比混合），分别进行多重纳米PCR和多重普通PCR扩增，结果显示采用本发明的纳米PCR检测试剂盒进行检测比普通PCR敏感100-1000倍，其中对gB，gE基因的扩增前者比后者敏感1000倍，而对gG基因的扩增前者比后者敏感100倍，电泳结果如图1所示；采用本发明的纳米PCR检测试剂盒和普通PCR试剂盒分别对gB，gE，gG基因进行单PCR扩增，结果显示用本发明的纳米PCR检测试剂盒gB，gE敏感性可达1.0×10¹拷贝，gG敏感性可达1.0×10²拷贝。而普通PCR试剂盒gB敏感性可达1.0×10⁴拷贝，gE敏感性可达1.0×10³拷贝，gG敏感性可达1.0×10⁴拷贝，结果表明本发明的纳米PCR检测试剂盒敏感性高，电泳结果如图2所示。

3、PRV纳米PCR特异性试验：

采用优化后的多重纳米PCR扩增条件，以PRV-pMD18-T-gB，PRV-pMD18-T-gE以及PRV-pMD18-T-gG重组质粒为模板进行多重PCR扩增，扩增出了与试验设计相符的431bp、316bp和202bp的3条特异性电泳条带；以PRV gE基因缺失毒DNA为模板进行多重PCR扩增，结果仅扩增出431和202bp的2条特异性条带；以猪捷申病毒、圆环病毒、蓝耳病病毒、猪细小病毒及非洲猪瘟病毒为模板进行PCR扩增，结果均未扩增出任何条带。结果表明建立的PCR具有良好的特异性，电泳结果如图3所示。

4、PRV纳米PCR保存期试验：

本试剂盒目前在-20℃下保存6个月，效果良好，没有任何变化。

5、初步应用结果：

应用本试剂盒对我国境内使用最多的PRV gE缺失疫苗株Bartha株和Plus株、以及两株现地分离的野毒株进行了检测：结果表明，本发明所建立的检测PRV纳米PCR检测方法对两株野毒株的检测结果为阳性（三条条带），PRV gE基因缺失疫苗株Bartha株检测结果为两条条带（缺少中间的gE条带）。同时也应用本试剂盒对我国部分2011年来疑似本病的病料，进行了检测，结果野毒检出率为85%，与病毒分离率相符为95%。

Claims

1.一种快速鉴别和诊断猪伪狂犬病病毒强弱毒的纳米PCR检测试剂盒，其特征在于其组成成分包括：2×Nano PCR缓冲液，DNA聚合酶，引物混合物，无核酸ddH₂O，其中所述的引物混合物由3对引物组成，第1对引物的序列分别为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示，第2对引物的序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，第3对引物的序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

2.按照权利要求1所述的纳米PCR检测试剂盒，其特征在于所述的引物混合物由3对引物按照等摩尔比组成。

3.按照权利要求1或2所述的纳米PCR检测试剂盒，其特征在于还包括猪伪狂犬病病毒野毒的阳性对照质粒及猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株阳性对照质粒。

4.按照权利要求3所述的纳米PCR检测试剂盒，其特征在于所述的猪伪狂犬病病毒野毒的阳性对照质粒为含有猪伪狂犬病病毒gE基因及/或含有猪伪狂犬病病毒gB基因的质粒；所述的猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株阳性对照质粒为含有猪伪狂犬病病毒gG基因及/或含有猪伪狂犬病病毒gB基因的质粒。

5.按照权利要求1所述的纳米PCR检测试剂盒，其特征在于还含有稳定剂。

6.按照权利要求5所述的纳米PCR检测试剂盒，其特征在于所述的稳定剂为二甲基亚砜(DMSO)。

7.权利要求1-6任一项所述的纳米PCR检测试剂盒在制备鉴别猪伪狂犬病病毒野毒株及猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株试剂中的应用。

8.权利要求1-6任一项所述的纳米PCR检测试剂盒在制备诊断猪伪狂犬病病毒野毒株及猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株试剂中的应用。