CN105385683A - 一种猪流行性腹泻病毒的多重rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了而一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，包括引物组合物的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1～6所示，本发明建立的PEDV、PSV、SAV一步法多重RT-PCR检测方法，特异性强，敏感度高，将RT和PCR两步反应一步进行，既节省了时间和步骤，同时也大大减少了对RNA的污染和降解机率，可以在同一体系中同时检测3种引起猪腹泻的病毒，大大降低了检测成本，为临床上病原感染性调查研究提供了简便、快速和准确的检测方法，具有重要的实际应用价值。

Description

一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物监测技术领域，涉及一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，具体为针对PEDV、PSV和SaV一步法三重RT-PCR的检测方法。

背景技术

近年来仔猪腹泻病广泛流行于全国各地，患病仔猪发病率、死亡率均高达80％以上，给养猪业造成严重的经济损失。冠状病毒科猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)以及呼肠孤病毒科猪A群轮状病毒(GARV)是导致猪腹泻的三种主要病毒性病原。在腹泻病因的调查中常呈混合感染，关于这三种病毒的多重检测方法有很多文献报道。另据文献报道猪博卡病毒(PBoV)、猪萨佩罗病毒(PSV)和猪札幌病毒(SaV)可以引起猪的腹泻，但相对文献报道较少也没有引起足够的重视。PSV是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，《病毒分类-国际病毒分类委员会(ICTV)第八次报告》最终将其命名为萨佩罗病毒属，该属包括猪萨佩罗病毒、禽萨佩罗病毒和猿萨佩罗病毒。该病毒能引起中度或严重的神经系统紊乱、腹泻、繁殖障碍和肺炎。PSV能在猪肠道上皮细胞繁殖，并随着粪便排出体外，使该病毒在环境中大量存在，感染猪在康复后可继续排毒，因此在饲养猪群中感染率较高。该病毒若与其他病原如猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪细小病毒(PPV)等混合感染，将造成病猪严重的临床症状。猪肠道杯状病毒(Porcineentericcalicivirus，PECV)包括猪诺如病毒(norovirus，NoV)和猪札幌病毒(Porcinesapovirus，SaV)。猪NoV只感染成年猪，且无临床症状；而猪SaV感染各年龄的猪尤其断奶仔猪，并引起仔猪腹泻，给养殖业带来一定损失。SaV分为5个基因群(GI-GV)，其中GIII为猪SaV，其余为人SaV，世界首例猪SaV(Sw/SV/Cowden/80/US)于1980年在美国报道，英国、委内瑞拉和韩国等国家也陆续有暴发该病的报道，黄泽彬等于2009年首次报道该病也存在于我国的猪群中。

多重PCR是在同一反应体系中加入多对引物对多个目的基因同时进行扩增的试验方法。该项技术具有省时、省力、降低成本、减少产物污染等优点。多重PCR能够捕获更多的信息，使应用范围更加广泛，分析的基因更加复杂。因此建立一种能够同时检测PEDV、PSV和SaV多重RT-PCR方法有助于快速鉴别诊断疾病。

发明内容

本发明目的在于立一种快速、敏感的鉴别诊断PEDV、PSV和SaV多重RT-PCR检测方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，包括引物组合物：PEDV-P1：5’-CTGCCAATGTATTTGCCAC-3’、PEDV-P2：5’-GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3’；PSV-P1：5’-TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3’、PSV-P2：5’-GCCCTGCACAACTGCTTTC-3’；SAV-P1：5’-TACGGGGGAATAGGTTT-3’、SAV-P2：5’-CAGCCACATCTGGGTAGT-3’。

本发明所述的RT-PCR检测的反应体系为为：PrimeScript1stepEnzymeMix(内含PrimeScriptReverseTranscriptase、TaKaRaExTaqHotStart及RNaseInhibitor)2μl、2X1stepBuffer(内含反应Buffer和dNTPMixture(终浓度400μM))25μl、上游引物(10μM)各1μl、下游引物(10μM)各1μl、模板RNA5μl，加DEPC水至50μl。

针对上述反应体系，反应条件具体为：50℃30min；94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环；循环结束后再72℃10min。

本发明所述的引物组合物根据GenBank收录的PEDV序列(cv777)S1基因、PSV序列(YC2011)保守基因和SAV序列Cowden(AF182760)VP1基因设计得到。

本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

1)病料的处理：用10mmol·L^-1PBS缓冲液将粪样稀释10倍，在涡旋仪上振荡混匀5min后，12000r·min^-1离心5min，取上清液备用；

2)RNA的提取：将样品分别依次利用氯仿、异丙醇萃取离心，弃上清，在沉淀中加入冰乙醇混匀，室温下静置，沉淀即为总RNA；

3)RT-PCR反应体系的建立

反应体系为50μl：PrimeScript1stepEnzymeMix(内含PrimeScriptReverseTranscriptase、TaKaRaExTaqHotStart及RNaseInhibitor)2μl、2X1stepBuffer(内含反应Buffer和dNTPMixture(终浓度400μM))25μl、上游引物(10μM)1μl、下游引物(10μM)1μl、模板RNA5μl，加DEPC水至50μl；

反应参数为：50℃30min；94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环；循环结束后再72℃10min；

4)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳判定结果。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒的引物组合物，所述的引物组合物包括：PEDV-P1：5’-CTGCCAATGTATTTGCCAC-3’、PEDV-P2：5’-GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3’；PSV-P1：5’-TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3’、PSV-P2：5’-GCCCTGCACAACTGCTTTC-3’；SAV-P1：5’-TACGGGGGAATAGGTTT-3’、SAV-P2：5’-CAGCCACATCTGGGTAGT-3’。

本发明所述的猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒、猪萨佩罗病毒和猪札幌病毒。

本发明的有益效果为：本发明建立的PEDV、PSV、SAV一步法多重RT-PCR检测方法，特异性强，敏感度高，将RT和PCR两步反应一步进行，既节省了时间和步骤，同时也大大减少了对RNA的污染和降解机率，可以在同一体系中同时检测3种引起猪腹泻的病毒，大大降低了检测成本，为临床上病原感染性调查研究提供了简便、快速和准确的检测方法，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1是PEDV、PSV和SAV单项RT-PCR不同退火温度的电泳图；M.DNA标准DL2000；1～8、9～16和17～24的Tm值分别为51.0、51.5、52.4、53.8、55.5、56.8、57.6、58.0℃8个梯度；1～8为等量PEDVRNA模板；9～16：为等量PSVRNA模板；17～24：为等量SAVRNA模板；

图2是PEDV、PSV和SAV单项RT-PCR不同引物浓度的电泳图；M.DNA标准DL2000；1～8、9～16和17～24加入的引物量分别为1.5、1.35、1.2、1.0、0.75、0.5、0.35和0.2μl；1～8为等量SAVRNA模板；9～16：为等量PSVRNA模板；17～24：为等量PEDVRNA模板；

图3是多重RT-PCR不同退火温度的电泳图；M.DNA标准DL2000；1～8的Tm值分别为53.0、53.8、54.5、55.0、55.5、56.0、56.8、57.5℃8个梯度；

图4是不同混合模板的多重RT-PCR的电泳图；M.DNA标准DL2000；1.为PEDV、PSV和SAV混合RNA模板；2～6：为PEDV-TGEV-GARV三联弱毒疫苗RNA、PSV、SAV、CSFV、PRRSVRNA模板；7～10：PCV2、PRV、PPVDNA模板以及H₂O；

图5是PEDV、PSV和SAV混合RNA模板不同浓度的电泳图；M.DNA标准DL2000；1～7：PEDV、PSV和SAV混合RNA模板稀释度依次为10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实验材料

病毒：猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒II型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)弱毒疫苗和猪萨佩罗病毒(PSV)、猪札幌病毒(SaV)由作者实验室保存，猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性腹泻-猪传染性胃肠炎-猪A群轮状病毒三联弱毒株由浙江大学动物预防医学实验室提供。

主要试剂及仪器：RNAisoPlus(TotalRNAextractionreagent)(批号：v201301Da)、PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKitVer.2(批号：v201309Da、AK3402)、TaKaRaExTaqHotStart(批号：NA501CA)和DL2000DNAMarker购自大连宝生物工程有限公司；氯仿、异丙醇、冰乙醇购自上海化学试剂有限公司。S1000TMThermalCyclerPCR仪、Bio-RADGelDocTMXR+紫外凝胶成像分析系统和核酸电泳仪为美国Bio-RAD公司产品。

实施例1RT-PCR反应体系的建立

1)根据GenBank收录的PEDV序列(cv777)S1基因、PSV序列(YC2011)保守基因和SAV序列Cowden(AF182760)VP1基因设计3对引物(表1)。

表1多重RT-PCR引物设计结果

2)病料的处理

用10mmol·L^-1PBS缓冲液将粪样稀释10倍，在涡旋仪上振荡混匀5min后，12000r·min^-1离心5min，取上清液备用。

3)RNA的提取

取200μl样品加入1mlRNAisoPlus，剧烈振荡后，室温静置5min；加入200μl氯仿，剧烈振荡，冰上静置10min，4℃、12000r·min^-1离心15min；离心后取上清400μl加入等体积异丙醇，轻轻混匀后，冰块上静置10min，4℃、12000r·min^-1离心10min；弃上清，向沉淀中加入1000μl75％的冰乙醇(由无水乙醇与DEPC水配制)；轻轻混匀，室温下静置8min后于4℃、8000r·min^-1离心5min，弃上清，自然干燥，管底沉淀即为总RNA，加入10～20μlRNase-free水溶解沉淀，即为所提取RNA模板。

4)一步法反转录及PCR扩增反应

反应体系为50μl：PrimeScript1stepEnzymeMix(内含PrimeScriptReverseTranscriptase、TaKaRaExTaqHotStart及RNaseInhibitor)2μl、2X1stepBuffer(内含反应Buffer和dNTPMixture(终浓度400μM))25μl、上游引物(10μM)1μl、下游引物(10μM)1μl、模板RNA5μl，加DEPC水至50μl。

反应参数为：50℃30min；94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环；循环结束后再72℃10min。

5)多重RT-PCR反应条件优化

单项PCR最佳退火温度和引物浓度的确定，将退火温度设定为51.0、51.5、52.4、53.8、55.5、56.8、57.6、58.0℃8个梯度；将上下游引物分别稀释成浓度为10μM，分别加入0.2、0.35、0.5、0.75、1.0、1.2、1.35和1.5μl，模板都为RNA5μl不变。

采用不同的退火温度进行PCR扩增(图1)，退火温度确定为53.8～56.8℃；引物浓度范围为1.0～1.5μl(图2)。

根据确定的单项PCR反应引物浓度及退火温度，逐步筛选出多重PCR反应体系中3对引物的最佳浓度及退火温度。

3对引物的上、下游引物分别为1.0、1.2、1.35和1.5μl时进行不同组合和不同退火温度(53.0、53.8、54.5、55.0、55.5、56.0、56.8、57.5℃)条件下，逐步优化引物浓度，最终确定多重PCR引物最佳浓度：PEDV1.2μl、PSV0.75μl和SAV1.0μl，最佳退火温度为55.5℃(图3)。

实施例2多重PCR特异性试验

分别取PEDV、PSV和SAV混合RNA模板、PEDV-TGEV-GARV三联弱毒株RNA、PSV、SAV、CSFV、PRRSVRNA模板，PCV2、PRV、PPVDNA模板以及H2O进行多重PCR反应。模板DNA的反应体系为：TaKaRaExTaqHotStart(5units/μl)0.25μl、10×ExBuffer5μl、dNTPMix(2.5mMeach)4μl、上游引物和下游引物(10μM)各1μl、模板DNA5μl并补加DEPC水至50μl。反应参数为：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环；循环结束后再72℃10min。

用已确定的多重RT-PCR反应条件对PEDV、PSV和SAV混合RNA模板、PEDV-TGEV-GARV三联弱毒疫苗RNA、PSV、SAV、CSFV、PRRSVRNA模板，PCV2、PRV、PPVDNA模板以及H₂O进行多重PCR扩增，结果如图4所示，只有PEDV、PSV和SAV混合RNA模板和PEDV、PSV、SAVRNA模板扩增出与目的片断大小一致的条带，其它模板均无条带。

实施例3多重RT-PCR的敏感性

PEDV、PSV和SAV三种RNA浓度分别为86μg·mL^-1、41μg·mL^-1和0.72μg·mL^-1，在优化的RT-PCR反应条件下，对以上模板RNA分别作10倍倍比(10⁰～10⁷)稀释，结果如图5所示，PEDV的最高敏感度为43pg、PSV的最高敏感度为21pg、SAV的最高敏感度为36pg。

实施例4多重RT-PCR检测方法的初步临床应用

利用多重RT-PCR和常规RT-PCR检测了78份腹泻猪粪样，并对两种检测方法进行比较。

结果如表2所示，多重RT-PCR与常规单项RT-PCR整体临床样品检测符合率达98.2％，PEDV、PSV和SAV的单项符合率分别为100％、100％、80％，特异性为100％，表明建立的PEDV、PSV和SAV多重RT-PCR检测方法敏感性高、特异性强；PEDV、PSV和SAV的阳性率分别为56.4％、7.7％和6.4％。

表2多重RT-PCR与常规单项RT-PCR临床样品检测结果比较

实施例5多重RT-PCR产物测序及序列比对

将PEDV、PSV和SAV多重RT-PCR临床检测的阳性PCR产物送苏州金唯智生物技术有限公司测序，测序结果利用NCBI中的BLAST软件进行序列比对。

试验基于本发明3对引物，应用一步法多重RT-PCR技术在同一体系中扩增出659、428、246bp的特异性片断。应用本研究建立的方法对实施例4中78份临床病料进行检测，检出PEDV、PSV和SAV的阳性率分别为56.4％、7.7％和6.4％。将3份阳性样品的多重RT-PCR产物送苏州金唯智生物技术有限公司测序，测序结果利用NCBI中的BLAST软件进行序列比对，结果显示，3份样品的PEDV的S1基因序列与参考毒株(cv777)的同源性达88.2％～93.7％，PSV的相应保守基因序列与参考毒株(YC2011)的同源性达98.2％～99.1％，SAV的VP1基因序列与参考毒株(Cowden)的同源性达95.5％～98.3％。测序结果进一步证实建立的多重RT-PCR方法具有较好的特异性，可用于临床样品检测。

Claims (7)

1.一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：包括引物组合物：PEDV-P1：5’-CTGCCAATGTATTTGCCAC-3’、PEDV-P2：5’-GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3’；PSV-P1：5’-TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3’、PSV-P2：5’-GCCCTGCACAACTGCTTTC-3’；SAV-P1：5’-TACGGGGGAATAGGTTT-3’、SAV-P2：5’-CAGCCACATCTGGGTAGT-3’。

2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR检测的反应体系为为：PrimeScript1stepEnzymeMix2μl、2X1stepBuffer25μl、10μM上游引物各1μl、10μM下游引物各1μl、模板RNA5μl，加DEPC水至50μl。

3.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：反应条件具体为：50℃30min；94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环；循环结束后再72℃10min。

4.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的PrimeScript1stepEnzymeMix内含PrimeScriptReverseTranscriptase、TaKaRaExTaqHotStart及RNaseInhibitor。

5.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的Buffer内含反应Buffer和dNTPMixture，终浓度为400μM。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒、猪萨佩罗病毒和猪札幌病毒。

7.一种用于检测猪流行性腹泻病毒的引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物包括：PEDV-P1：5’-CTGCCAATGTATTTGCCAC-3’、PEDV-P2：5’-GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3’；PSV-P1：5’-TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3’、PSV-P2：5’-GCCCTGCACAACTGCTTTC-3’；SAV-P1：5’-TACGGGGGAATAGGTTT-3’、SAV-P2：5’-CAGCCACATCTGGGTAGT-3’。