CN103981283B - 一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有牛传染性鼻气管炎病毒。本发明还公开了特异性引物(如SEQIDNO.3、4所示)以及试剂盒(由特异性引物、牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成)。本发明的方法，既可用于牛传染性鼻气管炎病毒气溶胶样本的检测，也可用于临床血液、奶样、组织等样本的检测，具有广泛的应用前景。

Description

一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，属于生物技术领域。
背景技术
牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisVirus,IBRV)是一种泛嗜性病毒，侵入牛体后可侵染并潜伏于多个部位，可引起牛多系统感染，使病牛长期带毒并可在一定时期内排毒，造成牛群的大范围感染。该病的主要传染源为病牛以及无症状的带毒牛，其传播途径为呼吸道、生殖道，病毒随鼻、眼以及阴道分泌物、精液等排出体外。该病可通过被污染的空气飞沫感染牛群，在过分拥挤、封闭式环境中更易快速传播，对牛群肥育率、产奶量和繁殖影响极大。因此，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为B类疾病，也是我国进境动物必检疾病之一。
IBRV是双链DNA病毒，有囊膜，基因组长约138kb，由一个长独特区(UL，106kb)和一个短独特区(Us，10kb)及Us区两侧的重复序列(IRs和TRs，各11kb，序列相同但方向相反)组成。IBRV基因组至少编码70个左右基因，其中有11种为糖蛋白。由于IBRV易形成潜伏感染，在临床上不表现症状或表现轻微临床症状，建立针对IBRV基因的PCR检测方法，为流行病学调查、临床诊断、疫苗研制乃至疫病的控制及消除等方面都具有重要的意义。
PCR在病毒检测上具有特异、灵敏、高效等特点，用PCR方法检测病毒核酸，不受中和抗体的影响。而实时荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、荧光技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点，仪器自动分析，效率高、无后续处理，更有利于对低浓度的样本进行检测，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了实验时间、简化了实验操作。
气溶胶是由悬浮于气体介质中的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系，其粒径一般为0.001-100μm。而悬浮在气体(如空气)中含有病毒的液态或固态微粒称为病毒气溶胶。随着集约化、规模化畜牧生产的发展，病毒气溶胶在病毒性传染病传播中所占的重要地位逐渐被人们所认识。牛传染性鼻气管炎病毒可通过污染的空气传播，阻碍了畜牧业生产效率的提高和发展。因此全面了解畜禽舍内外环境质量，对流行病的预防和监控十分重要。
目前，关于细菌等空气微生物气溶胶采集及诊断方法的研究报道较多，由于病毒气溶胶难以收集、浓度较低，且传统检测方法灵敏度低，故研究受限。迄今为止，还没有应用SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测气溶胶载IBRV的研究报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，可以应用于牛场环境中IBRV的检测，为牛传染性鼻气管炎病毒的流行病学调查及气溶胶传播方式的防控提供支撑。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，步骤如下：
(1)采集气溶胶样本；
进一步地，采集气溶胶样本的方法为：采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；
(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；
进一步地，提取基因组总DNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在4℃下12000r/min离心30min，取上清液1mL，应用病毒DNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取基因组总DNA；
(3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：
所述试剂盒由特异性引物、牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH2O组成；所述的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒为PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)试剂盒(购自大连宝生物)。采用SYBRGreenⅠ荧光染料的方法，要比Taqman探针方法简便，价格相对较低。
所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D是由序列为SEQIDNO.5所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。
所述特异性引物的序列如下：
上游引物IBRV-F为5′-ACGGACGACGAGCTGGGACT-3′，如SEQIDNO.3所示；
下游引物IBRV-R为5'-CGGCAGCGAAACCATGAAAT-3'，如SEQIDNO.4所示。
扩增反应体系为20μL：2×SYBRPremixExTaqII10μL，模板2μL，上游引物和下游引物各0.5μL(终浓度均为0.25μmol/L)，RNaseFreeddH2O7μL。
反应条件为：预变性95℃30s，然后按照95℃变性5s、63℃退火延伸30s进行40个循环；溶解曲线为95℃5s、65℃60s、95℃Continuous；最后50℃30s结束反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；
(5)判断：若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛传染性鼻气管炎病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛传染性鼻气管炎病毒。
本发明应用荧光PCR对收集到的奶牛场不同环境中空气样品进行检测，操作简便、快速，特异性强，灵敏度高，结果可靠，可应用于IBRV病毒气溶胶的实时监测，为牛场IBRV的监测与评估、病毒来源和传播扩散的跟踪以及感染剂量的检测提供了有力的技术支持。
本发明的检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，既可用于牛传染性鼻气管炎病毒气溶胶样本的检测，也可用于临床血液、奶样、组织等样本的检测。本发明的方法可以对规模化奶牛场环境中的牛传染性鼻气管炎病毒气溶胶进行实时监测，也可用于调查牛传染性鼻气管炎病毒持续感染等相关的基础研究，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法检测牛传染性鼻气管炎病毒气溶胶样本的标准曲线，图中各点的标准阳性质粒拷贝数分别对应为1：1.7×106拷贝数/μL；2：1.7×105拷贝数/μL；3：1.7×104拷贝数/μL；4：1.7×103拷贝数/μL；5：1.7×102拷贝数/μL；6：1.7×101拷贝数/μL；7：1.7×100拷贝数/μL。
图2：SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法检测牛传染性鼻气管炎病毒气溶胶样本的溶解曲线，其中，空白对照以等量RNaseFreeddH2O代替模板，其他模板为标准阳性质粒分别为1.7×106-1.7×100拷贝数/μL。
图3：SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法检测气载牛传染性鼻气管炎病毒的特异性曲线，其中，1：牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)；2：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；3：牛副流感3型病毒(BPIV-3)；4：牛冠状病毒(BcoV)；5：牛轮状病毒(BRV)；6：ddH2O。
图4：SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法检测气载牛传染性鼻气管炎病毒病毒的灵敏度及重复性检测结果，其中，1：1.7×106拷贝数/μL；2：1.7×105拷贝数/μL；3：1.7×104拷贝数/μL；4：1.7×103拷贝数/μL；5：1.7×102拷贝数/μL；6：1.7×10拷贝数/μL；7：1.7×100拷贝数/μL；8：空白对照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。
图5：气溶胶临床样本检测曲线，其中，1：阳性对照(模板质粒1.7×10拷贝数/μL)；2：气溶胶样本1；3：气溶胶样本2；4：气溶胶样本3；5：气溶胶样本4；6：空白对照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用一些材料和试剂如下：
MS-1型多功能微生物采样器(青岛众瑞智能仪器有限公司)；480Ⅱ荧光定量PCR仪(罗氏公司)；琼脂糖凝胶回收试剂盒(目录号：DP209)和高纯度质粒小提中量试剂盒(目录号：DP107)购自天跟生化科技(北京)有限公司；RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(目录号：K1622)购自Fermentas公司；pEASY-T3载体试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(CodeNo.:9766)、PremixExTaqTMII(TIiRNaseHPlus)试剂盒(CodeNo.:RR820A)、LATaq(CodeNo.:RR52AG)、TaKaRaTaq(CodeNo.:R001A)、DNAMarker、IPTG、X-gal均购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1引物的设计与合成
根据GeneBank中牛传染性鼻气管炎病毒gD基因(GenBank:NC001847)保守序列，应用PrimerPremier5.0设计全长扩增引物gD-F、gD-R(表1，序列1和序列2，如SEQIDNO.1、2所示)，用于阳性标准质粒的构建；采用PrimerExpress3.0软件，设计一对特异性引物IBRV-F、IBRV-R(表1，序列3和序列4，SEQIDNO.3、4所示)，用于牛传染性鼻气管炎病毒检测。
表1引物寡核苷酸序列
实施例2建立SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法
(一)SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立
1、待测样本的制备
取牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感3型病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒的细胞培养毒200μL，参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取病毒DNA/RNA，获得的病毒RNA按照FermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行反转录。
2、标准质粒阳性模板的制备
以步骤1得到的牛传染性鼻气管炎病毒的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL：2×GCBufferI(Mg2+Plus)25μL、2.5mMdNTPMixture8μL、LATaq0.5μL(5U/μL)、模板2μL，10μmol/L的gD-F和gD-R基因全长上下游引物各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性3min，然后进入94℃30s，60℃30s，72℃1min，共进行31个循环；72℃延伸10min，最后停止于4℃。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体，蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果与序列表中的SEQIDNO.5所示的序列进行比对，正确的重组质粒为阳性，将其命名为pEAST-T3-D。
将pEAST-T3-D质粒作为阳性标准品，用核酸蛋白分析仪(NanoPhotometerTMP300)测定质粒浓度，按照下述公式计算出每μL质粒中的DNA拷贝数，结果拷贝数为1.7×1010拷贝数/μL。
质粒拷贝数(拷贝/μL)＝计算方法：(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(质粒浓度g/ml)/(MWg/mol)，其中：[平均分子量(MWg/mol)：dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；ssDNA＝(碱基数)×(330道尔顿/碱基)；ssRNA＝(碱基数)×(340道尔顿/碱基)]。
3、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的扩增条件的确立
设立引物终浓度梯度为0.2-1.0mol/L，以确定反应的最佳引物浓度；设立温度梯度为59-68℃，根据PCR扩增结果，选取最佳退火温度。以Ct最小值、荧光最高值、溶解曲线显示只有单特异峰为标准，分别对退火温度、引物浓度、循环条件进行优化(接下来的步骤4中的各项参数即为优化结果)。
4、标准曲线的建立
将质粒pEAST-T3-D按10倍进行倍比稀释至100-109拷贝数/μL，将稀释的拷贝数作为模板进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR扩增，建立标准曲线。扩增反应体系为20μL：2×SYBRPremixExTaqII10μL，质粒pEAST-T3-D2μL，浓度为10μmol/L的上游引物和下游引物(表1中的引物对IBRV-F和IBRV-R)各0.25μL，RNaseFreeddH2O补足20μL。同时设置空白对照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。然后进行标准曲线的扩增，反应程序如下：
预变性95℃30秒钟(升温速率4.4℃/秒)1cycle。
PCR分析模式：定量分析。
95℃5秒钟(升温速率4.4℃/秒)；63℃30秒钟(升温速率2.2℃/秒，AcquisitionMode:Single)40cycles。
融解分析模式：溶解曲线。
95℃5秒钟(升温速率4.4℃/秒)；65℃1分钟(升温速率2.2℃/秒)；95℃(升温速率0.11℃/秒,AcquisitionMode:Continuous,Acquisitions:5per℃)1cycle。
降温50℃30秒钟(升温速率2.2℃/秒)1cycle。
标准曲线如图1所示，各点在一直线上，表明标准曲线好。
使用480ⅡGeneScanningSoftwareVersion1.5的AbsQuant/2ndDerivativeMax分析模式分析，结果各点在一直线上，各参数值为
溶解曲线如图2所示，从图中可以看出，溶解曲线只有单一的峰出现，没有引物二聚体或其它非阳性峰出现，为特异性扩增。
(二)SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的特异性试验
按照上述步骤建立的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法进行特异性试验，分别以牛传染性鼻气管炎病毒DNA、牛病毒性腹泻病毒cDNA、牛副流感3型病毒cDNA、牛冠状病毒cDNA、牛轮状病毒cDNA作为模板，以ddH2O为阴性对照。
在530nm激发光下检测牛传染性鼻气管炎病毒的特异性的结果如图3所示，从图中可以看出，1有相应病毒的特异性荧光曲线，而2～6均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物扩增牛传染性鼻气管炎病毒特异性好，与其它检测毒株无交叉反应。因此以针对gD基因的引物对所建立的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于检测未知样本是否有牛传染性鼻气管炎病毒核酸的存在。
(三)SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的灵敏度及重复性试验
以10倍系列稀释液上述制备的pEASY-T3-D质粒，得到拷贝数为1.7×108-1.7×100拷贝/μL的系列稀释液，将含有不同的质粒拷贝数的稀释液作为模板，同时设置一等量RNaseFreeddH2O代替模板的空白对照进行SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增，每个模板浓度做3个重复。其中，SYBRGreenⅠ荧光定量PCR采用上述优化后的反应体系和反应条件；
SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测，在530nm激发光下的结果，如图4所示，牛传染性鼻气管炎病毒的检测1.7×100拷贝仍有较好的荧光曲线，SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法对牛传染性鼻气管炎病毒具有较高的灵敏度。
通过计算Ct值的标准差(S)和变异系数(CV)来验证荧光定量PCR的批内重复性，结果显示，所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法重复性好。
另选取一个浓度的pEASY-T3-D质粒DNA作为模板，进行荧光PCR扩增，间隔7d重复一次，共进行3次重复，然后计算Ct值的变异系数(CV)，验证荧光定量PCR的批间重复性，结果显示该方法具有较好的批间重复性。
实施例3、气溶胶样本的检测
(一)气溶胶样品采集
选择奶牛场的不同区域(奶牛舍、运动场、挤奶厅等)，应用MS-Ⅰ型空气微生物采样箱，通过国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，Porton采样器采集空气样品。首先安装三脚架，采样器放置高度为距地面1.5m，然后将10mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)注入Proton采样器，同时滴加一滴橄榄油，放入三脚固定支架内固定。将Porton冲击式稳流器的一端接到主机入气口上，另一端用橡胶管连接到Proton采样器的出气口上。采样流量为12.5L/min，采样时间为20min。采样结束后将采样器内的采集液收集到15mL离心管保存用于检测。
(二)模板DNA制备
气溶胶吸收液4℃，12000r/min离心30min，取1mL上清，参照病毒DNA提取试剂盒说明书，提取气溶胶样本中的DNA，将所有DNA溶于50μL水中，-20℃存储备用。
(三)临床气溶胶样本的检测
待测样本为山东省不同地区奶牛养殖场不同地点收集的气溶胶样本，分别制备这些气溶胶样本的病毒DNA。以制备的气溶胶样本的基因组DNA分别作为模板，按照实施例2中步骤4中建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法进行检测。若在530nm激发光下的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有牛传染性鼻气管炎病毒；若反应结果为一条直线，则待测样本中没有牛传染性鼻气管炎病毒。
检测结果如下：经测定，在530nm激发光下，1号阳性对照和4号待检样本中出现S型曲线，其余样本出现直线扩增，表明仅有1号对照和4号样本中含有牛传染性鼻气管炎病毒，如图5所示。

Claims (3)

1.一种非诊断目的的检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)采集气溶胶样本；
(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；
(3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：
所述试剂盒由特异性引物、牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成；
所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D是由序列为SEQIDNO.5所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；
所述特异性引物的序列如下：
上游引物IBRV-F为5′-ACGGACGACGAGCTGGGACT-3′；
下游引物IBRV-R为5'-CGGCAGCGAAACCATGAAAT-3'；
(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；
(5)判断：若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛传染性鼻气管炎病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛传染性鼻气管炎病毒；
所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为：采用全玻璃液体冲击式采样器，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本；
所述步骤(2)中，提取基因组总DNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在4℃下12000r/min离心30min，取上清液1mL，应用病毒DNA试剂盒提取基因组总DNA。
2.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR的扩增反应体系为20μL：2×SYBRPremixExTaqII10μL，模板2μL，上游引物和下游引物各0.5μL，RNaseFreeddH2O7μL。
3.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR的反应条件为：预变性95℃30s，然后按照95℃变性5s、63℃退火延伸30s进行40个循环；溶解曲线为95℃5s、65℃60s、95℃继续；最后50℃30s结束反应；温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
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