CN107345258A - 一种检测病毒的引物组合及应用、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测病毒的引物组合及应用、试剂盒，属于医药领域。本发明提供的检测病毒的引物组合针对性强、特异性高以及较好的灵敏度；将上述检测病毒的引物组合在检测小牛血去蛋白提取物中口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒检测结果更为准确可靠；上述引物组合应用于制备检测病毒的试剂盒，能更利于方便快捷的检测病毒，将更有利于试剂盒的应用推广，具有较高的试剂应用价值和推广价值。

Description

一种检测病毒的引物组合及应用、试剂盒

技术领域

本发明涉及医药领域，具体而言，涉及一种检测病毒的引物组合及应用、试剂盒。

背景技术

小牛血去蛋白注射液是一种采用的生化药物，小牛血去蛋白注射液为新鲜小牛血或血清经去蛋白、浓缩、超滤或透析等工艺制得的含有无机物及小分子有机物的小牛血去蛋白提取物的无菌溶液。本品为淡黄色澄明液体，相对密度为1.0239～1.0263。小牛血去蛋白注射液具有增加葡萄糖的摄入率和利用率；增加氧的摄取和利用，从而直接促进细胞代谢，改善细胞的能量状态；且与各类生长因子有协同作用，促进各种组织增殖，并有抗凝血酶的作用。

但是，动物源的小牛血去蛋白提取物可能含有一些病毒等不安全因素，因此需要对动物源的小牛血去蛋白提取物进行安全检测，然而现在还很少有针对小牛血去蛋白提取物的安全检测。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种检测病毒的引物组合，该引物组合能快速方便的检测牛病毒性腹泻粘膜病毒和牛传染性鼻气管炎病毒，使检测高效快速。

本发明的第二目的在于提供上述的检测病毒的引物组合在检测小牛血去蛋白提取物中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述检测病毒的引物组合在制备病毒检测试剂盒中的应用。

本发明的第四目的在于提一种检测病毒的试剂盒，通过该试剂盒可以方便于检测。

本发明的第五目的在于提供上述的试剂盒在检测病毒中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种检测病毒的引物组合，引物组合包括检测牛病毒性腹泻粘膜病毒的第1引物对和检测牛传染性鼻气管炎病毒的第2引物对中的至少一种；第1-2引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-4所示。

上述的检测病毒的引物组合在检测小牛血去蛋白提取物中的应用。

上述检测病毒的引物组合在制备病毒检测试剂盒中的应用。

一种检测病毒的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的检测病毒的引物组合。

上述的试剂盒在检测病毒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的检测病毒的引物组合针对性强、特异性高以及比较好的灵敏度；将上述检测病毒的引物组合在检测小牛血去蛋白提取物中口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒检测结果更为准确可靠；上述引物组合应用于制备检测病毒的试剂盒，能更利于方便快捷的检测病毒，将更有利于试剂盒的应用推广，具有较高的试剂应用价值和推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例1提供的口蹄疫病毒熔解曲线图；

图2为本发明实验例1提供的轮状病毒熔解曲线图；

图3为本发明实验例1提供的牛病毒性腹泻粘膜病毒熔解曲线图；

图4为本发明实验例1提供的牛传染性鼻气管炎病毒熔解曲线图；

图5为本发明实验例1提供的乙脑病毒熔解曲线图；

图6为本发明实验例2提供的口蹄疫病毒标准曲线图；

图7为本发明实验例2提供的轮状病毒标准曲线图；

图8为本发明实验例2提供的牛病毒性腹泻粘膜病毒标准曲线；

图9为本发明实验例2提供的牛传染性鼻气管炎病毒标准曲线；

图10为本发明实验例2提供的乙脑病毒标准曲线图；

图11为本发明实验例2提供的口蹄疫病毒熔解曲线图；

图12为本发明实验例2提供的轮状病毒熔解曲线图；

图13为本发明实验例2提供的牛病毒性腹泻粘膜病毒熔解曲线图；

图14为本发明实验例2提供的牛传染性鼻气管炎病毒熔解曲线图；

图15为本发明实验例2提供的乙脑病毒熔解曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种检测病毒的引物组合及应用、试剂盒进行具体说明。

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属；感染的偶蹄动物引起急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等；黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。

轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。经由粪口途径传染的。它会感染与小肠连结的肠黏膜细胞(enterocyte)并且产生肠毒素(enterotoxin)，肠毒素会引起肠胃炎，导致严重的腹泻，有时候甚至会因为脱水而导致死亡。

牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)属于黄病毒科瘟病毒属，引起牛病毒性腹泻(粘膜病)，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高；主要在消化道和淋巴组织，口腔(口黏膜、齿龈、舌和硬腭)、咽部、鼻镜出现不规则烂斑、溃疡，以食道黏膜呈虫蚀样的烂斑最具特征。

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，IBRV)属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科；易引起牛传染性鼻气管炎。临床表现形式多样，以呼吸道为主，伴有结膜炎、流产、乳腺炎，有时诱发小牛脑炎等。

乙脑病毒临床上表现为高烧、意识障碍、抽搐、颅内压升高以及脑膜刺激症。牛感染发病后呈现脑炎症状，没精打采、反应迟钝、食欲消失、呻吟磨牙、惊恐、牙关紧闭、四肢强直、失去平衡和走路摇晃，重者跌倒；呈兴奋型的牛狂躁不安、胡乱冲撞、有的发生痉挛，继而兴奋和沉郁现象交替出现，有时因昏迷而死亡。

一种检测病毒的引物组合，引物组合包括检测牛病毒性腹泻粘膜病毒的第1引物对和检测牛传染性鼻气管炎病毒的第2引物对中的至少一种；第1-2引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-4所示。

进一步地，还包括检测口蹄疫病毒的第3引物对、检测轮状病毒的第4引物对和检测乙脑病毒的第五引物对；第3-5引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.5-10所示。

分别根据口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒的保守序列设计出可以用于荧光定量PCR的引物，扩增的产物长度控制在150-200bp左右。

上述的检测病毒的引物组合在检测小牛血去蛋白提取物中的应用。将上述检测病毒的引物组合应用于小牛血去蛋白提取物的检查，可以方便的检查出口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒。

进一步地，上述的应用，以待检样本为模板进行PCR反应；第1-5引物对的退火温度为56-65℃。

选择56-65℃的退火温度，能扩增出较好的目的条带，避免扩增出非特异的条带干扰实验结果，将微量的模板放大，利于检测。

上述检测病毒的引物组合在制备检测病毒的试剂盒中的应用。

一种检测病毒的试剂盒，检测试剂盒包括上述的检测病毒的引物组合。

进一步地，还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、2×Super RealPreMix、荧光试剂、目的片段标准品和Mg²⁺中的至少一种。

试剂盒中，包括进行普通PCR的试剂，可以对样本的病毒进行先期的定性分析；同时，试剂盒中还包括进行荧光定量PCR的试剂，选用荧光定量PCR的试剂可以对样本的病毒进行定量分析；另外，试剂盒中还包括目的片段标准品，可在检测待检样本的时候，作为阳性对照。

进一步地，荧光试剂包括SYBR Green I或者SYBR GreenⅡ。

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

SYBR Green II染料是一种高敏感的核酸染色试剂，可以对RNA或者是单链的DNA进行染色。

进一步地，检测试剂盒，还包括反转录试剂；反转录试剂包括dNTPs、randomprimer、5×MLV-RT缓冲液、RNase抑制剂和MLV RT反转录酶中的至少一种。

由于病毒大多都是单链RNA病毒，因此需要对病毒RNA进行反转录扩增，通过反转录获得相应的cDNA序列，方便后续的荧光定量PCR反应。

上述的检测试剂盒在检测病毒中的应用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种检测病毒的引物组合，该引物组合包括检测牛病毒性腹泻粘膜病毒的第1引物对和检测牛传染性鼻气管炎病毒的第2引物对中的至少一种；第1-2引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-4所示。

实施例2

本实施例提供一种检测病毒的引物组合，该引物组合包括实施例1提供的的引物组合，还包括检测口蹄疫病毒的第3引物对、检测轮状病毒的第4引物对和检测乙脑病毒的第五引物对；第3-5引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.5-10所示。

实施例3

本实施例提供一种检测病毒的试剂盒，该检测试剂盒包括实施例1提供的检测病毒的引物组合。

实施例4

本实施例提供一种检测病毒的试剂盒，该检测试剂盒包括实施例2提供的检测病毒的引物组合。

实施例5

本实施例提供一种检测病毒的试剂盒，该检测试剂盒包括实施例2提供的检测病毒的引物组合。

当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、2×SYBR green I和Mg²⁺中的至少一种。

实施例6

本实施例提供一种检测病毒的试剂盒，该检测试剂盒包括实施例2提供的检测病毒的引物组合。

当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、2×SYBR green II和Mg²⁺中的至少一种。

另外，还包括反转录试剂；反转录试剂包括dNTPs、randomprimer、5×MLV-RT缓冲液、RNase抑制剂和MLV RT反转录酶中的至少一种。

实验例1

本实验例对实施例6提供的检测病毒的试剂盒的引物组合的最佳引物浓度、退火温度以及阳性标准品的制备。

阳性标准品的制备，具体步骤如下：

根据NCBI数据库的提供的数据，分别选择口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒参考株的长片段保守序列；通过克隆的方法，分别将口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒参考株的长片段保守序列连接到pUC57载体上；并进行检测。

通过实验，发现检测呈阳性；所以口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒参考株的长片段保守序列成功克隆到pUC57载体；得到阳性标准品。

引物浓度和退火温度的优化，具体方法如下：

将获得的口蹄疫病毒阳性标准品稀释至3.7×10⁵copies/μL；轮状病毒阳性标准品稀释至4.96×10⁵copies/μL、牛病毒性腹泻粘膜病毒阳性标准品稀释至3.54×10⁵copies/μL、牛传染性鼻气管炎病毒阳性标准品稀释至5.2×10⁵copies/μL和乙脑病毒的阳性标准品分别稀释到2.0×10⁵copies/μL，并且分别作为模板。将试剂盒中检测口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒的引物组合稀释到10μmol/L的浓度；用20μL的反应体系，检测口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒的引物组合均设置5个实验组，依次为实验组1到实验组5，实验组1到实验组5添加的引物体积为0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL和1.0μL；在加入10μL的2×Taq Mix，阳性标准品0.5μL；然后用ddH₂O补足到20μL。进行PCR反应。

口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒的检测引物组合的最佳浓度均为20μL反应体系中，使用10μmol/L的引物0.6μL即可。

将获得的口蹄疫病毒阳性标准品稀释至1×10⁵copies/μL；轮状病毒阳性标准品稀释至4.96×10⁵copies/μL、牛病毒性腹泻粘膜病毒阳性标准品稀释至3.54×10⁵copies/μL、牛传染性鼻气管炎病毒阳性标准品稀释至5.2×10⁵copies/μL和乙脑病毒的阳性标准品分别稀释到2.0×10⁵copies/μL，并且分别作为模板。将试剂盒中检测口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒的引物组合稀释到10μmol/L的浓度；用20μL的反应体系，检测口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒的引物组合均设置10个实验组，分别为第一组到第十组；第一组到第十组的退火温度依次设置为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃。分别进行PCR反应。

口蹄疫病毒和轮状病毒检测引物组合的最佳退火温度为63℃、牛病毒性腹泻粘膜病毒最佳退火温度为60℃；牛传染性鼻气管炎病毒最佳退火温度为63.5℃和乙脑病毒的最佳退火温度为63℃。

实验例2

本实验例对实施例6提供的检测病毒的试剂盒的引物组合特异性和灵敏度进行检测并建立各病毒浓度与循环阈值之间的标准曲线。

标准曲线的建立方法，具体步骤如下：

将获得的口蹄疫病毒阳性标准品经10倍梯度浓度稀释，依次稀释至3.7×10⁸copies/μL-3.7×10copies/μL；轮状病毒阳性标准品稀释至4.96×10⁸copies/μL-4.96×10²copies/μL、牛病毒性腹泻粘膜病毒阳性标准品稀释至1×10⁸copies/μL-1×10²copies/μL、牛传染性鼻气管炎病毒阳性标准品稀释至1×10⁸copies/μL-1×10²copies/μL；乙脑病毒的阳性标准品分别稀释到2.0×10⁷copies/μL-2.0×10²copies/μL，并且分别作为模板。

反应总体系20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL、ROX Reference DyeⅡ0.5μL、上下游引物各0.6μL，模板2μL，Nuclease-Free Water补足至20μL。采用两步法进行荧光定量PCR反应；反应条件为:95℃预变性2min；95℃变性15s；退火1min，扩增40个循环；退火温度选用优化的最佳退火温度。反应结束后，得到口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒的引物组合各自的Ct值，以Ct值为纵坐标，以起始模板浓度的对数为横坐标，建立标准曲线。同时得到各反应的熔解曲线图。

将获得的口蹄疫病毒阳性标准品和牛病毒性腹泻粘膜病毒阳性标准品经10倍梯度浓度稀释，依次稀释至3.7×10⁸copies/μL-3.7×10copies/μL；轮状病毒阳性标准品稀释至4.96×10⁸copies/μL-4.96×10²copies/μL、牛传染性鼻气管炎病毒阳性标准品稀释至5.2×10⁸copies/μL-5.2×10²copies/μL；乙脑病毒的阳性标准品分别稀释到2.0×10⁷copies/μL-2.0×10²copies/μL，并且分别作为模板，进行荧光定量PCR，反应体系及反应程序参考实施例前述标准曲线建立过程中的反应体系及反应程序。

根据口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒的熔解曲线图，如图1至图5可以发现：口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒引物组合的反应，呈现单一的熔解峰，无非特异性扩增，特异性较好。

荧光PCR反应完成后，得到反应数据，以Ct值为纵坐标，以起始模板浓度的对数为横坐标，建立标准曲线。

结果如图6所示，口蹄疫病毒的标准曲线方程为：Y＝-3.8739X+33.136；R²＝0.9894。

结果如图7所示，轮状病毒的标准曲线方程为：Y＝-3.3446X+37.756；R²＝0.9962。

结果如图8所示，牛病毒性腹泻粘膜病毒的标准曲线方程为：Y＝-3.7396X+38.065；R²＝0.9976。

结果如图9所示，牛传染性鼻气管炎病毒的标准曲线方程为：Y＝-3.1829X+39.347；R²＝0.9971。

结果如图10所示，乙脑病毒的标准曲线方程为：Y＝-3.1175X+30.343；R²＝0.9992。

如图11-15所示，口蹄疫病毒和牛病毒性腹泻粘膜病毒在浓度低至3.7×10copies/μL、轮状病毒在浓度低至4.96×10²copies/μL、牛传染性鼻气管炎病毒在浓度低至5.2×10²copies/μL和乙脑病毒在浓度低至2.0×10²copies/μL依然能够检测到并有扩增曲线，说明实施例6提供的试剂盒中的引物组合均具有较好的灵敏度。

综上所述，实施例6提供的试剂盒的引物组合具有较好的特异性和灵敏度。

实验例3

本实验例对实施例6提供的检测病毒的试剂盒的应用。将该试剂盒应用于生产的小牛血去蛋白产品的检测。

小牛血去蛋白样本中病毒总RNA的提取(参考宝生物病毒总RNA提取试剂盒：UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒)

1.1注射用骨肽样本1g加入到200μL的PBS溶液中溶解，转移到1.5mL的RNase-free的离心管中，得到样本溶液；

1.2向步骤1.1中获得的样本溶液中加入350μLRLT溶液，剧烈震荡，10000rpm离心2min，去上清至另外一个1.5mL的RNase-free的离心管中；

1.3加入1/2体积的无水乙醇，混匀，得到样本混合溶液(即使有沉淀也无需离心)；

1.4将吸附柱放入收集管，将步骤1.3中的样本混合溶液移至吸附柱中，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液；

1.5将吸附柱重新放回收集管，加入500μL RW Solution，静置1min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；

1.6将吸附柱放回收集管中，加入500μl RPE Solution，静置2min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，并重复本操作一次；

1.7将吸附柱放回收集管中，10000rpm离心2min；

1.8以12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温5-10min，彻底晾干；

1.9将吸附柱放入RNase-free的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30-50μLDEPC-treated ddH₂O，静置5min，12000rpm离心2min，将所得到的RNA溶液置于-80℃保藏备用。

样本cDNA的合成

2.1以步骤1.10获得RNA中的24μL为模板，进行反转录，加入2μL random primer，dNTPs(10mM each)2μL，MLV RT 2μL，RNase2μL加MLV-RT缓冲液8μL，混匀后短暂离心；

2.2在37℃反应60min；

2.3在90℃条件下孵育10min，灭活MLV RT和RNase；

2.4反应结束后，获得病毒cDNA，取出后置于冰上3-5min，-20℃保存备用。

荧光定量PCR

利用实验例2提供的反应体系及反应程序，进行检测。根据反应结果的Ct值，设定Ct值＜30判定为检测出病毒。通过标准曲线计算得到待检样本的Ct值，待检样本Ct值>30，检测结果为阴性；检测结构均显示不含口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒。

生产的小牛血去蛋白产品安全可靠。

综上所述，本发明实施例提供的检测病毒的检测引物具有较好的特异性和较高的灵敏度，使用该检测引物应用于检测口蹄疫病毒、轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和乙脑病毒，以及应用于制备检测上述病毒的试剂盒，都具有较好的特异性和较高的灵敏度；检测上病毒的试剂盒方便提取病毒的核酸并进行鉴定，具有较高的实用性和较高的推广应用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司、哈尔滨珍宝制药有限公司

<120> 一种检测病毒的引物组合及应用、试剂盒

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttacaaacct gtgatggcct c 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcaggtaaa gtgatctgta gctt 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actccatatg cgaactcgac ac 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctgttggc caccctttag 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgagtacagg gtagtcgttc a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcaattcca tgtgccatgt 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgctgtaccc gatcaccac 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctctttttc gccttgtgct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cagatcccta gcgaagatcg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcatggatag gcgtttaggg 20

Claims (10)

1.一种检测病毒的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括用于检测牛病毒性腹泻粘膜病毒的第1引物对和/或用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的第2引物对；所述第1-2引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-4所示。

2.根据权利要求1所述的检测病毒的引物组合，其特征在于，还包括检测口蹄疫病毒的第3引物对、检测轮状病毒的第4引物对和检测乙脑病毒的第5引物对；所述第3-5引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.5-10所示。

3.如权利要求1或2所述的检测病毒的引物组合在检测小牛血去蛋白提取物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以待检样本为模板进行PCR反应；所述第1-5引物对的退火温度为56-65℃。

5.如权利要求1或2所述检测病毒的引物组合在制备检测病毒的试剂盒中的应用。

6.一种检测病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1或2所述的检测病毒的引物组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、荧光试剂、目的片段标准品和Mg²⁺中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光试剂包括SYBR Green I或者SYBR GreenⅡ。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括反转录试剂；所述反转录试剂包括dNTPs、random primer、5×MLV-RT缓冲液、RNase抑制剂和MLV RT反转录酶中的至少一种。

10.如权利要求6-9任一项所述的试剂盒在检测病毒中的应用。