CN1560279A - 口蹄疫病毒荧光定量rt-pcr检测试剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以口蹄疫病毒基因片段为靶目标,应用primer Express软件和primer prere5.0软件设计合成的生物制剂,尤其是能够对口蹄疫病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法。本发明所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针。本首次用FMDV 3D区域的基因序列的最保守片段,设计合成了引物和探针,建立了荧光定量RT-PCR并制备成检测试剂盒,可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品中的FMDV进行快速检测,首次创立FMDV荧光定量RT-PCR。
Description
技术领域
本发明涉及一种以口蹄疫病毒基因片段为靶目标,应用primer Express软件和primer prere5.0软件设计合成的生物制剂,尤其是能够对口蹄疫病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的野生、家畜偶蹄动物的一种高度传染性的疾病。快速和可靠的诊断对于FMD的控制至关重要,为采取有效措施,实验室诊断必须在24小时以内作出快速、准确的结论。动物和肉类产品带病毒引发口蹄疫是多次大流行的主要原因。对肉食品中低含量的FMD病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法必须具备高敏感性、高特异性和高准确性。常规的诊断方法如病毒分离、血清学试验、动物试验等,或费时费力,或特异性和敏感性不高,不能满足快速、准确诊断的要求。RT-PCR、竞争PCR和ELISA-PCR方法克服了这些方法的不足,可用于FMD的诊断,但也有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用FMDV 3D区域的基因序列设计合成的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂。
本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。
本发明选择FMDV基因的3D区为靶目标,通过对GenBank中报道的FMDV DNA序列(AF536534、AF536535、AF536536、AF536540、AF536537、AF536538、AF536539)进行同源性分析比较,选定FMDV 3D区内较保守的片段(189bp),应用primerExpress软件和primer prere5.0软件,设计引物和探针,引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法,使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成,探针合成同时进行两端荧光标记,探针5’端标记的荧光报告基团是FAM,3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后,确定扩增效率和特异性最好的二套引物和探针。通过FMDV病毒RNA和标准阳性对照样品的制备,采用矩阵法进行引物和探针最佳浓度的精确筛选,以获得最低的CT值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。通过建立标准曲线,然后用FMDV细胞培养物、乳鼠组织、VSV、BTV17、BVDV、正常BHK21细胞、猪牛的上皮组织等试验样品进行检测,对FMDV荧光定量RT-PCR的特异性、敏感性和重复性试验,以及各参加反应组份最佳条件的筛选,最终建立FMDV荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序。
由上述确定扩增效率和特异性最好的二套引物和探针分述如下:
本发明所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针,扩增目标片段长度为86bp,引物和探针序列为
引物:FVP2-F:5’-TTA CAA ACC TGT GAT GGC CTC-3’
FVP2-R:5’-CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA TG-3’
探针:(FAM)5’-CCT CTC CTT TGC ACG CCG TGG-3’(TAMRA)。
本发明所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针,扩增目标片段长度为135bp,引物和探针序列为:
引物:FVP3-F:5’-CGT GGG ACC ATA CAG GAG AA-3’
FVP3-R:5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’
探针:(FAM)5’-TGA TCT CCG TGG CAG GAC TCG C-3’(TAMRA)。
本发明所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由以下步骤组成:
一、选择FMDV基因的3D区为靶目标,其基因片段的扩增目标核苷酸序为列:TTACAAACCTGTGATGGCCTCAAAGACCCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCG;
二、应用primer Express软件和primer prere5.0软件,设计引物和探针;
三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法,使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成;
四、探针合成同时进行两端荧光标记,探针5’端标记的荧光报告基团是FAM,3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR;
五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后,确定并得到扩增效率和特异性好的引物和探针。
本发明的优点和积极效果为:
1、本申请人首次用FMDV 3D区域的基因序列的最保守片段,设计合成了引物和探针,建立了荧光定量RT-PCR并制备成检测试剂盒,可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品中的FMDV进行快速检测,首次创立FMDV荧光定量RT-PCR。
2、本试剂与常规的RT-PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,可同时检测大量样品等优点。FMDV荧光定量RT-PCR可对肉食品中低含量的FMD病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测,是一种FMDV检测的良好方法。
3、本试剂可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品等多种样品中的FMDV进行快速检测,样品适用范围广,没有生物安全隐患,使用安全的优点。
4、本荧光定量RT-PCR试剂除了具有特异性高、敏感性强外,可同时进行大量样品检测,具有高通量性,可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险。比常规PCR快速,无需扩增后的电泳分析。克服了常规RT-PCR和免疫捕获RT-PCR产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。
5、与常规PCR相比,荧光PCR作出一个定量的、客观的估计,判定出阳性、阴性和可疑。CT值为40.00可确定为阳性和阴性的临界值(cut-off)。更重要的是,荧光PCR具有很高的外、内试验重复性。荧光RT-PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。
6、本试剂可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。与FMDVELISA检测结果的阳性检出率低、细胞培养分离病毒需要4天时间相比。该荧光RT-PCR试剂是一种检测临床样品中FMDV的敏感和可靠的方法。
具体实施方式
1、设计引物和探针
本发明选择FMDV基因的3D区为靶目标,通过对GenBank中报道的FMDV DNA序列(AF536534、AF536535、AF536536、AF536540、AF536537、AF536538、AF536539)进行同源性分析比较,选定FMDV 3D区内较保守的片段(189bp),应用primerExpress软件和primer prere5.0软件,设计引物和探针,引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法,使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针合成同时进行两端荧光标记,探针5’端标记的荧光报告基团是FAM,3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后,确定扩增效率和特异性最好的二套引物和探针。第一套引物和探针(FMDVP2-F/FMDVP2-R)扩增目标片段长度为86bp,第二套引物和探针(FMDVP3-F/FMDVP3-R)扩增目标片段长度为135bp。
2、RNA提取
FMDV病毒RNA和标准品同时制备。参照黄祯祥主编《医学病毒学基础及实验技术》,科学出版社(1990年)第143-146页,先测定毒价,以Reed和Muench氏法计算TCID50。取100μL病毒原液,参照卢圣栋主编《分子生物学实验室常用技术》,科学出版社(1999年)第61-62页,酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用无RNA酶的超纯水溶解总RNA,稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的每个反应管。水泡皮、水泡液、血液(抗凝血)、血清和细胞组织等材料直接提取RNA。荧光RT-PCR和常规RT-PCR试验用同批次提取的RNA。
3、FMDV荧光定量RT-PCR
FMDV荧光定量RT-PCR采用25μL体积反应液,在7000型荧光定量PCR仪中,按下列反应参数进行:42℃30min反转录;92℃变性3min;92℃变性10min,45℃30sec,72℃1min,预扩增5个循环;然后以92℃10sec,60℃30sec扩增40个循环。
引物和探针的浓度进行精确筛选,以获得最低的CT值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。每次检测时,设立用水代替病毒RNA样品的4个阴性对照(或正常组织、细胞阴性对照);设立相当于1000、100、10、1TCID50/每反应管的FMDV标准各4个对照;每个样品检测做3管平行试验。在4个阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时,整个试验有效,可进一步判定结果。每个样品须作多个备份,以进行稳定性、重复性试验。
4、常规RT-PCR
常规RT-PCR的上游引物用FVP2-F:5’-TTA CAA ACC TGT GAT GGCCTC-3’,下游引物用FVP3-R:5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’,扩增目标片段长度为189bp,按常规方法进行扩增。检测用2%琼脂糖电泳分析,阳性扩增结果出现一条189bp特异性条带。
5、FMDV荧光定量RT-PCR的特异性、敏感性
用VSV、BVD、BTV、EHD、AKAV以及正常BHK21细胞、野外采集猪、牛的组织样品和血清进行特异性比较检测。对FMDV细胞培养物、人工感染乳鼠组织样品进行10倍系列稀释,用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测,比较它们的敏感性。
6、荧光定量RT-PCR稳定性和重复性试验
在评估FMDV荧光定量RT-PCR检测FMDV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时,用相当于1000TCID50的样品RNA,在同样反应条件下,反复进行荧光定量RT-PCR检测,每次试验的每个样品做6个平行的反应管,重复12次。
7、标准阳性对照样品的制备、标准曲线的建立及核酸拷贝数的计算
所用的标准阳性对照样品为含有目的扩增片段的质粒pBAD-3D,由本实验室用pBAD/Thio TOPO载体构建。质粒转化大肠杆菌TOP10,LB培养基(含Amp100μg/mL)增殖,碱裂解法提取,经试剂盒纯化,质粒浓度用分光光度计测OD260定量。模板浓度的计算:在作绝对定量时,首先制备标准曲线。对标准品进行10-1、10-2、10-3、10-4~10-7稀释,通过测OD知道质粒原液(标准品)的浓度后,可计算出每个PCR管中模板的数量。例如,已知pBAD/Thio TOPO载体长4436bp,插入的FMDV 3D目的片断长189bp,每个碱基的平均分子量是330,(每对碱基/bp是660,)质粒原液约250μg/mL,阿弗加德罗常数(每mol的微粒数)是6.02×1023/mol。那么每2μL的绝对模板数量是:(250μg/mL×2μL×6.02×1023/mol)/[(4436+189)bp×660g/(mol×bp)]=98.6×1018。据此,10-4~10-7质粒的模板分子数是98.6×1014~1011。做荧光定量RT-PCR检测,以拷贝数或TCID50的对数为X轴,CT值为Y轴作回归曲线,获得标准曲线。
8、引物和探针及其浓度的筛选
选择引物、探针、模板的最佳浓度配比,获得荧光定量RT-PCR反应的最低CT值和最高ΔRn,提高扩增效率和敏感性。应用含有目的片段的质粒标准品和FMDV细胞毒,经系列稀释,制备DNA和RNA不同含量的检测样品。对设计的二对引物和各自的探针,选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探针终浓度,采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。
9、对FMDV样品的检测
用荧光定量RT-PCR对FMDV细胞培养物、乳鼠组织、VSV、BTV17、BVDV、正常BHK21细胞、猪牛的上皮组织等试验样品进行检测。提取的RNA稀释后检测,阳性样品的CT值均小于或等于38.50,阴性对照样品的CT值均大于40,试验特异性强。CT值40.00可作为是阳性和阴性的临界值。CT值大于40可判为阴性,CT值小于或等于38.50可判为阳性,在38.50-40之间为可疑,须重新试验。用第一套引物和探针进行检测FMDV的荧光定量RT-PCR特异性高,强阳性样品的CT值小于28.00,试验的敏感性高,稳定性、可靠性、重复性很好。
10、FMDV荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序
10.1试剂盒组成
组成成份(48tests/盒) | 体积 |
样本处理试剂裂解液核酸扩增试剂DEPC水FMDV RT-PCR反应液RT-PCR酶(带盖PCR反应管装)Taq酶(5U/ul)对照品阴性对照阳性对照(非感染性体外转录RNA) | 5ml×6瓶1ml×1管750ul×1管1颗/管×12管12ul×1管1ml×1管1ml×1管 |
定量用标准对照品(重组质粒) | 0.5ml×1管 |
10.2操作方法
10.2.1样本处理(样本处理区)
取n个1.5ml灭菌离心管(n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),作好标记。
首先加入600ul裂解液(裂解液有很强的腐蚀性,切勿沾到皮肤或衣物,否则立即用大量清水冲洗并擦干),然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul(一份样本换用一个吸头);再加入200ul氯仿,混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀)。
于12,000g离心15min(如有条件,于4℃进行离心)。
取与步骤1.1.中相同数量的1.5ml灭菌离心管,加入400ul异丙醇(-20℃预冷),作好标记。吸取步骤1.3.各管中的上清液相转移至相应的管中(上清液应至少吸取500ul,注意不要吸出中间层,该层富含DNA和蛋白质),颠倒混匀。
●12,000g离心15min,(注意固定离心管方向,即将离心管开口朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干);加入600ul 75%乙醇,颠倒洗涤。
●12,000g离心10min,(注意固定离心管方向,即将离心管开口朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。
●4,000g离心10sec(注意固定离心管方向,即将离心管开口朝离心机转轴方向放置)将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头,注意吸头不要碰到有沉淀一面),室温干燥3min(不宜过于干燥,以免RNA不溶)。
●加入11ul DEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2,000g离心5sec,冰上保存备用(注意:此时的RNA最易受RNA酶降解,请在2小时内进行PCR扩增)。
10.2.2扩增试剂准备(PCR前准备区)
●从试剂盒中取出FMDV RT-PCR反应液、Taq酶,在室温下融化后,2,000rpm离心5sec。设所管数为n(n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
试剂 | FMDV RT-PCR反应液 | Taq酶 |
用量 | 15ul | 0.25ul |
●计算好各试剂的使用量,加入一适当体积试管中,向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒,充分混合均匀,向每个反应管中各分装15ul,转移至样本处理区。
10.2.3加样(样本处理区)
●在各设定的反应管中分别加入上述样本处理步骤1.8.中制备的RNA溶液各10ul,盖紧管盖,放入离心机中,于2,000rpm离心5sec。将反应管排好放入PCR荧光检测仪内,记录样本摆放顺序。
10.2.4 RT-PCR反应(检测区)
●循环条件设置
Program | cycles | Temperature(℃) | IncubationTime(min∶sec) | Temperature TransitionRate(℃/sec) | AcquisitonMode | AnalysisMode |
1 | 1 | 42 | 30∶0 | 20 | None | None |
2 | 1 | 92 | 3∶00 | 20 | None | None |
3 | 5 | 92 | 10 | 20 | None | None |
45 | 30 | 20 | None | |||
72 | 1∶00 | 20 | None | |||
4 | 40 | 92 | 10 | 20 | None | Quantification |
60 | 30 | 20 | Single | |||
5 | 1 | 40 | 0 | 20 | None | None |
10.2.5结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,结果显示阴性为准。
10.2.6质控标准
●阴性对照的检测结果为阴性。
●阳性对照的Ct值应小于等于28.0。
10.2.7结果判断
●Ct值无数值的样本为阴性样本。
●Ct值≤38.5的样本为阳性。
●Ct值大于38.5的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性,否则为阳性。
10.2.8定量检测
在作绝对定量检测时,首先制备标准曲线。对试剂盒中提供的定量用标准对照品(重组质粒),按说明书要求进行序列稀释,与被检样品同时进行荧光定量RT-PCR检测。以标准品的拷贝数的对数为X轴,CT值为Y轴作回归曲线,获得标准曲线,即可对被样品进行定量。
Claims (3)
1、一种口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂,其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针,扩增目标片段长度为86bp,引物和探针序列为:
引物:FVP2-F:5’-TTA CAA ACC TGT GAT GGC CTC-3’
FVP2-R:5’-CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA TG-3’
探针:(FAM)5’-CCT CTC CTT TGC ACG CCG TGG-3’(TAMRA)。
2、一种口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂,其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针,扩增目标片段长度为135bp,引物和探针序列为:
引物:FVP3-F:5’-CGT GGG ACC ATA CAG GAG AA-3’
FVP3-R:5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’
探针:(FAM)5’-TGA TCT CCG TGG CAG GAC TCG C-3’(TAMRA)。
3、按照权利要求1或2所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法,其特征在于由以下步骤组成:
(一)、选择FMDV基因的3D区为靶目标,其基因片段的扩增目标核苷酸序列为:TTACAAACCTGTGATGGCCTCAAAGACCCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCG;
(二)、应用primer Express软件和primer prere5.0软件,设计引物和探针;
(三)、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法,使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成;
(四)、探针合成同时进行两端荧光标记,探针5’端标记的荧光报告基团是FAM,3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR;
(五)、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后,确定并得到扩增效率和特异性好的引物和探针。
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