CN105950783A - 一种用于检测口蹄疫病毒通用型的引物、试剂盒、使用方法及其应用 - Google Patents

一种用于检测口蹄疫病毒通用型的引物、试剂盒、使用方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测口蹄疫病毒通用型的引物、试剂盒、使用方法及其应用，所述的引物为引物对FMDU，其中，上游引物FMDUF：5′‑GATGGCCTCAAAGACCC‑3′，下游引物FMDUR：5′‑GACTCGCCGTCCACTCT‑3′。本发明试剂盒的使用方法包括患病动物新鲜样品的采集，核酸提取；反转录聚合酶链反应，琼脂糖凝胶电泳检测。该方法特异性强、灵敏度高、操作简便、省工省时，提高了检测的准确性和特异性。本发明能快速、方便的检测口蹄疫通用型毒株，可用于口蹄疫病毒流行病学调查与分析，具有广阔的市场应用前景和较大的经济效益。

Description

一种用于检测口蹄疫病毒通用型的引物、试剂盒、使用方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于检测口蹄疫病毒通用型的引物、试剂盒、使用方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
口蹄疫(aphthae epizooticae；foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种人兽共患的急性、热性、高度接触性传染病，其临诊特征是在口腔粘膜、四肢下端及乳等处皮肤形成水疱和烂斑。该病传播迅速，流行面广，成年动物多取良性经过，幼龄动物多因心肌受损而死亡率较高。口蹄疫广泛流行于世界各地，造成了巨大的经济损失，各国政府及国际组织高度重视，被列为全球各国共同商定扑灭的头号法定传染病。随着国际贸易的日趋增加，物质交流和国际交往越来越频繁，给口蹄疫的预防和控制增加了难度，因此世界各国都花费大量人力、物力和财力来研究、控制和消灭口蹄疫。
口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus)属于微RNA病毒科中的口蹄疫病毒属，是RNA病毒中最小的一个。口蹄疫病毒具有多型性、易变异的特点。根据其血清学特性，可以分为7个血清型，即A、O、C、SAT1(南非Ⅰ)、SAT2(南非II型)、SAT3(南非III型)及Asia 1型(亚洲1型)。各个血清型间无交叉免疫现象。每一个血清型又包含若干个亚型，同型各个亚型之间也仅有部分交叉免疫性。该病毒的这种特性给口蹄疫的防制带来了许多困难。
口蹄疫病毒在患病动物的水疱液、水疱皮、淋巴液及发热期血液内的含量最高，其次是各组织器官、分泌物、排泄物，可长期存在并向外排毒，退热后病毒可以出现于乳、粪、尿、泪、涎水及各脏器中。口蹄疫病毒对外界环境的抵抗力很强，耐干燥。在自然条件下，含毒组织及污染的饲料、饮水、饲草、皮毛及土壤等所含病毒在数日乃至数周内仍具有感染性。口蹄疫病毒对酸和碱都特别敏感，在pH3.0和pH9.0以上的缓冲液中，病毒感染性将瞬间消失，2％～4％氢氧化钠、3％～5％福尔马林溶液、5％氨水、0.2％～0.5％过氧乙酸或5％次氯酸钠等均为口蹄疫病毒良好的消毒剂。
口蹄疫是一种传染性极强的传染病，一经发生往往呈流行性，在牧区，多呈现大流行，疫情一旦发生，可随动物的流动迅速蔓延，经过一定时期后疫情才逐渐平息。口蹄疫可感染多种动物，偶蹄目动物易感性最高，易感性高低的顺序依次为黄牛、奶牛、牦牛、水牛、猪、羊、骆驼。
对于口蹄疫的防治目前尚无特效药物疗法，主要采取综合防制措施及对症疗法。最根本的办法是消除患病动物、带毒动物和彻底消毒，切断传播途径。因此应加强检疫和口蹄疫监测，以防口蹄疫扩散。
目前，根据流行病学、临诊症状和病例剖检特点可以做出口蹄疫的初步诊断，但确诊需要进行实验室诊断。病毒的分离与鉴定和血清学诊断是实验室诊断常用的方法，但较费时费力，耗时较长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测口蹄疫病毒通用型的引物、试剂盒、使用方法及其应用，采用本发明的试剂盒，能够在三个小时内做出诊断，为口蹄疫临床诊断和分子流行病学调查提供一种有效的分子生物学诊断方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于检测口蹄疫病毒通用型的引物，所述的引物为引物对FMDU，其中，
上游引物FMDUF：5′-GATGGCCTCAAAGACCC-3′
下游引物FMDUR：5′-GACTCGCCGTCCACTCT-3′。
一种用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒，所述的试剂盒包括引物对FMDU，其中，
上游引物FMDUF：5′-GATGGCCTCAAAGACCC-3′
下游引物FMDUR：5′-GACTCGCCGTCCACTCT-3′。
所述的试剂盒还包括5×RT Buffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制剂、反转录酶、DEPC水、裂解液和冲洗液。
所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
所述的裂解液的组分为：羟基喹啉3～5％(质量分数)、磷酸三氯乙酯3.2～5.2μM、异硫氰酸苯酯1.5～3.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮1.3～3.5％(质量分数)、氯化钠0.3～0.5M和柠檬酸钠0.6～0.9M。
所述的冲洗液的组分为：三羟甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇60～80％(体积分数)；pH 7.0。
一种用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)样品的采集
(2)样品RNA的提取
(3)RT-PCR
对样品RNA进行RT-PCR扩增，反应体系25μl：5×RT Buffer 5μl、12.5μMdNTPs 5μl、125μM上游引物FMDUF和125μM下游引物FMDUR各2μl、25U/μlTaq酶0.5μl、2.5U/μl RNA酶抑制剂1μl、2.5μM反转录酶1μl、DEPC水3.5μl和5ng/μl RNA 5μl；
RT-PCR扩增程序为：50℃30min，94℃2min；94℃35s，55℃40s，72℃35s，共35个循环；72℃5min；
(4)RT-PCR扩增产物的检测
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果。
所述的样品的采集分为固体状动物组织的采集或液体状动物组织的采集；其中，
固体状动物组织的采集方法为：无菌采集动物组织病料0.1-100mg，装入无RNA酶污染的离心管中备用；
液体状动物组织的采集分为分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法为：用鼻咽拭子采集鼻咽液，装入无RNA酶污染的离心管中备用；血液的采集方法为：取全血、血清或血浆10-100μl，加入无RNA酶污染的离心管中备用。
所述的样品RNA的提取，具体方法为：
(1)将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取；
(2)在研磨后成糊状的动物组织20-100mg或液体状动物组织20-100μl中，加裂解液500μl，12000rpm离心30s，分离出上清液；
(3)将上清液转入离心管中，加无水乙醇500μl，分次转到RNA纯化柱上，12000rpm离心30s，得到粗提的RNA；
(4)用冲洗液500μl冲洗RNA纯化柱，12000rpm离心30s；
(5)将RNA纯化柱转到另一离心管，加DEPC水50μl，12000rpm离心30s，得到病毒及组织基因组的RNA，于-20℃保存备用。
一种用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒在检测口蹄疫病毒通用型方面的应用。
本发明的有益效果
1、本发明对核酸提取过程进行改进，即采用与现有试剂盒不同配方的裂解液和冲洗液，大大缩短了核酸提取时间，使核酸的提取时间由原来的1-2小时缩短为2分钟，节省了核酸提取的时间，从而提高了试剂盒的使用效率，使试剂盒的检验更加快捷、经济。其中，本发明的裂解液可以使样品迅速裂解，释放出RNA。冲洗液可有效除去蛋白质、盐类及杂质等，使所提取的RNA更加纯净。
2、本发明根据口蹄疫病毒的3D基因组序列，设计能够检测口蹄疫病毒通用型的特异性引物，同等条件下不能扩增口蹄疫其他血清型，具有很高的特异性。同时，本发明的试剂盒具有很高的灵敏度，最低检测限为0.1pg/μl。
3、本发明提供了一种用于检测口蹄疫病毒通用型试剂盒，该试剂盒能快速、准确的检测出口蹄疫病毒通用型毒株。可对口蹄疫感染的单个样品检测，也可对临床病例中混合感染的检测，可用于口蹄疫病毒病原普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和监测。
4、本发明的方法是建立在分子生物学基础上的，检测中提供了阴性对照和阳性对照，大大提高了检测的准确度，降低假阳性的出现几率，特异性较强，省时省力，该试剂盒将检测时间缩短至3小时，大大提高了工作效率。
5、本发明特别适合于口蹄疫病毒感染的大量临床样本的快速诊断，可以为临床和科研上口蹄疫病防治和治疗提供科学依据，而且对提高口蹄疫病毒病原的检测、监控、疫苗研制等具有重要意义。
附图说明
图1为RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中，泳道M代表DL 2000DNA Marker(从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1-7分别代表口蹄疫病毒A型、O型、C型、SAT1(南非Ⅰ)、SAT2(南非II型)、SAT3(南非III型)及Asia1型(亚洲1型)阴性对照；泳道8-14分别代表口蹄疫病毒A型、O型、C型、SAT1(南非Ⅰ)、SAT2(南非II型)、SAT3(南非III型)及Asia1型(亚洲1型)样品。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明所用的聚乙烯基吡咯烷酮的相对分子量为40000。
本发明所用的羟基喹啉为2-羟基喹啉。
实施例1 用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒
1、引物的设计
根据口蹄疫病毒通用型的基因序列，设计引物对FMDU，其中，
上游引物FMDUF：5′-GATGGCCTCAAAGACCC-3′(SEQ ID NO.1)
下游引物FMDUR：5′-GACTCGCCGTCCACTCT-3′(SEQ ID NO.2)。
2、RNA的提取
以黄牛为实验动物，提取样品RNA，包括以下步骤：
(1)样品的采集
采集黄牛全血100μl，加入无RNA酶污染的离心管中备用。
(2)样品RNA的提取
(a)在采集的100μl全血中，加裂解液500μl，12000rpm离心30s，分离出上清液；
(c)将上清液转入离心管中，加无水乙醇500μl，分次转到RNA纯化柱上，12000rpm离心30s，得到粗提的RNA；
(d)用冲洗液500μl冲洗RNA纯化柱，12000rpm离心30s；
(e)将RNA纯化柱转到另一离心管，加DEPC水50μl，12000rpm离心30s，得到病毒及组织基因组的RNA，于-20℃保存备用。
3、RT-PCR
以样品RNA为模板，进行RT-PCR扩增，同时以猪水疱病病毒为阴性对照，以各血清型RNA为阳性对照，提取阴性对照和阳性对照样品的RNA，RT-PCR扩增(方法同黄牛全血样品RNA的提取)，反应体系25μl：5×RT Buffer 5μl、12.5μM dNTPs 5μl、125μM上游引物FMDUF和125μM下游引物FMDUR各2μl、25U/μl Taq酶0.5μl、2.5U/μl RNA酶抑制剂1μl、2.5μM反转录酶1μl、DEPC水3.5μl和5ng/μl RNA 5μl。
RT-PCR扩增程序为：50℃30min，94℃2min；94℃35s，55℃40s，72℃35s，共35个循环；72℃5min。
4、RT-PCR扩增产物的检测
取RT-PCR扩增产物5μl和Loading Buffer 5μl混匀，加到含EB的1.0％的琼脂糖凝胶中，同时加入阴性对照、阳性对照的RT-PCR扩增产物和DL2000DNA Marker，电压为120V，电泳35min，然后在凝胶成像仪中观察结果。
实施例2 用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的应用
采用实施例1的试剂盒检测口蹄疫病毒A型，其中，本实施例的裂解液的组分为：羟基喹啉3％(质量分数)、磷酸三氯乙酯3.2μM、异硫氰酸苯酯3.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮1.3％(质量分数)、氯化钠0.3M和柠檬酸钠0.9M。冲洗液的组分为：三羟甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇60％(体积分数)；pH 7.0。本实施例的实验动物为确诊携带口蹄疫病毒A型的黄牛，以猪水疱病病毒为阴性对照，以口蹄疫病毒A型为阳性对照(结果见图1)。
实施例3 用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的应用
采用实施例1的试剂盒检测口蹄疫病毒O型，其中，本实施例的裂解液的组分为羟基喹啉5％(质量分数)、磷酸三氯乙酯4μM、异硫氰酸苯酯2.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮2％(质量分数)、氯化钠0.5M和柠檬酸钠0.6M。冲洗液的组分为三羟甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇80％(体积分数)；pH 7.0。本实施例的实验动物为确诊携带口蹄疫病毒O型的黄牛，以猪水疱病病毒为阴性对照，以口蹄疫病毒O型为阳性对照(结果见图1)。
实施例4 用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的应用
采用实施例1的试剂盒检测口蹄疫病毒C型，其中，本实施例的裂解液的组分为羟基喹啉4％(质量分数)、磷酸三氯乙酯5.2μM、异硫氰酸苯酯1.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮3.5％(质量分数)、氯化钠0.4M和柠檬酸钠0.8M。冲洗液的组分为三羟甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇70％(体积分数)；pH 7.0。本实施例的实验动物为确诊携带口蹄疫病毒C型的黄牛，以猪水疱病病毒为阴性对照，以口蹄疫病毒C型为阳性对照(结果见图1)。
实施例5 用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的应用
实施例5的试剂盒使用方法与实施例2的试剂盒基本相同，不同之处在于：本实施例的实验动物为确诊携带口蹄疫病毒SAT1型的黄牛，以猪水疱病病毒为阴性对照，以口蹄疫病毒SAT1型为阳性对照(结果见图1)。
实施例6 用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的应用
实施例6的试剂盒使用方法与实施例2的试剂盒基本相同，不同之处在于：本实施例的实验动物为确诊携带口蹄疫病毒SAT2型的黄牛，以猪水疱病病毒为阴性对照，以口蹄疫病毒SAT2型为阳性对照(结果见图1)。
实施例7 用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的应用
实施例7的试剂盒使用方法与实施例2的试剂盒基本相同，不同之处在于：本实施例的实验动物为确诊携带口蹄疫病毒SAT3型的黄牛，以猪水疱病病毒为阴性对照，以口蹄疫病毒SAT3型为阳性对照(结果见图1)。
实施例8 用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的应用
实施例8的试剂盒使用方法与实施例2的试剂盒基本相同，不同之处在于：本实施例的实验动物为确诊携带口蹄疫病毒Asia1型的黄牛，以猪水疱病病毒为阴性对照，以口蹄疫病毒Asia1型为阳性对照(结果见图1)。
琼脂糖凝胶电泳结果表明，本发明分别携带口蹄疫病毒A型、O型、C型、SAT1(南非Ⅰ)、SAT2(南非II型)、SAT3(南非III型)和Asia1型(亚洲1型)的黄牛样品RNA的RT-PCR扩增产物均在335bp出现条带，与预期相符，说明本发明的RT-PCR试剂盒具有良好的特异性。
使用本发明实施例2的试剂盒提取不同样品的基因组RNA，对提取的基因组RNA的浓度和纯度进行测定，结果见下表。
表 本发明试剂盒提取的基因组RNA浓度和纯度的测定结果
样品编号 1 2 3 4 5 6 7
提取的RNA浓度 20.14 21.76 21.86 21.58 20.33 21.87 20.96
吸光度比值 1.85 1.89 1.93 1.87 1.94 1.85 1.88
注：RNA浓度单位为ng/μl；吸光度比值为RNA在260nm和280nm处的吸光度比值(260/280)，通过吸光度比值来判断RNA的纯度，从上表可以看出，吸光度值在1.8～2.0之间，说明提取的RNA纯度较好。
表中样品1、2、3、4、5、6、7分别为使用该试剂盒从100μl血清中提取约1.00μg、1.09μg、1.09μg、1.08μg、1.02μg、1.09μg、1.05μg基因组RNA。
将提取的RNA取1μg/μl作10倍系列稀释，分别取1μg/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl、0.01pg/μl、0.001pg/μl RNA进行RT-PCR一步法进行扩增，结果表明本发明对口蹄疫病毒7个血清型的最低检测限约为0.1pg/μl，这比普通的RT-PCR两步法的敏感性(1pg/μl)高出10倍。

Claims (10)

1.一种用于检测口蹄疫病毒通用型的引物，其特征在于，所述的引物为引物对FMDU，其中，
上游引物FMDUF：5′-GATGGCCTCAAAGACCC-3′
下游引物FMDUR：5′-GACTCGCCGTCCACTCT-3′。
2.一种用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括引物对FMDU，其中，
上游引物FMDUF：5′-GATGGCCTCAAAGACCC-3′
下游引物FMDUR：5′-GACTCGCCGTCCACTCT-3′。
3.根据权利要求2所述的用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括5×RT Buffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制剂、反转录酶、DEPC水、裂解液和冲洗液。
4.根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒，其特征在于，所述的裂解液的组分为：羟基喹啉3～5％(质量分数)、磷酸三氯乙酯3.2～5.2μM、异硫氰酸苯酯1.5～3.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮1.3～3.5％(质量分数)、氯化钠0.3～0.5M和柠檬酸钠0.6～0.9M。
6.根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒，其特征在于，所述的冲洗液的组分为：三羟甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇60～80％(体积分数)；pH 7.0。
7.一种如权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品的采集
(2)样品RNA的提取
(3)RT-PCR
对样品RNA进行RT-PCR扩增，反应体系25μl：5×RT Buffer 5μl、12.5μMdNTPs 5μl、125μM上游引物FMDUF和125μM下游引物FMDUR各2μl、25U/μlTaq酶0.5μl、2.5U/μl RNA酶抑制剂1μl、2.5μM反转录酶1μl、DEPC水3.5μl和5ng/μl RNA 5μl；
RT-PCR扩增程序为：50℃ 30min，94℃ 2min；94℃ 35s，55℃ 40s，72℃ 35s，共35个循环；72℃ 5min；
(4)RT-PCR扩增产物的检测
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果。
8.根据权利要求7所述的用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的样品的采集分为固体状动物组织的采集或液体状动物组织的采集；其中，
固体状动物组织的采集方法为：无菌采集动物组织病料0.1-100mg，装入无RNA酶污染的离心管中备用；
液体状动物组织的采集分为分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法为：用鼻咽拭子采集鼻咽液，装入无RNA酶污染的离心管中备用；血液的采集方法为：取全血、血清或血浆10-100μl，加入无RNA酶污染的离心管中备用。
9.根据权利要求8所述的用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的样品RNA的提取，具体方法为：
(1)将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取；
(2)在研磨后成糊状的动物组织20-100mg或液体状动物组织20-100μl中，加裂解液500μl，12000rpm离心30s，分离出上清液；
(3)将上清液转入离心管中，加无水乙醇500μl，分次转到RNA纯化柱上，12000rpm离心30s，得到粗提的RNA；
(4)用冲洗液500μl冲洗RNA纯化柱，12000rpm离心30s；
(5)将RNA纯化柱转到另一离心管，加DEPC水50μl，12000rpm离心30s，得到病毒及组织基因组的RNA，于-20℃保存备用。
10.一种如权利要求2-6任一项所述的用于检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒在检测口蹄疫病毒通用型方面的应用。
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